Name: Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Keşfedin, insan kanındaki B lenfositlerinden tamamen insan monoklonal antikor üretme yöntemini. Bu teknik, nadir antijen spesifik B hücrelerinin izolasyonunu ve immünoterapi uygulamaları için hassas hedeflemeyi mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sitometresi tesis "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) uzman teknik destek için teşekkür ederiz. Ayrıca tüm personel rekombinant protein üretim (P2R) ve etkisi platformları (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) onların teknik destek için teşekkür ederiz. Biz Emmanuel Scotet ve Richard Breathnach el yazması yapıcı yorumlar için teşekkür ederim. Bu eser mali Fransız Ulusal araştırma Ajansı (ANR tarafından) (ANR-10-IBHU-005) yönetilen «Investissements d'Avenir» Fransız hükümeti programı tarafından finanse edilen IHU Cesti projesi tarafından desteklenmiştir. IHU Cesti projesi de Nantes Métropole ve Région Pays de la Loire tarafından desteklenmektedir. Bu eser gelecek program ANR-11-LABX-0016-01 yatırım üzerinden ulusal araştırma ajansı tarafından desteklenen LabEX IGO program kapsamında gerçekleşmiştir.

Tüm insan periferik kan örnekleri anonim yetişkin bağışçılardan uygun olarak yerel Etik Komitesi (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, yordam Yayındayız NTS-2016-08) aydınlatılmış onam sonra elde edilmiştir.
1. insan periferik kan mononükleer hücre izolasyon
Not: malzeme başlayan toplam insan periferik kan ya da cytapheresis örnekleri olabilir. Örnekleri 8 h büyük olmamalıdır ve antikoagülanlar (örneğin, heparin) ile desteklenmiştir.
<ol><li>Kan ile 2 cilt (İnsan periferik kan) veya RPMI (Roswell Park Memorial Enstitüsü) orta 5 cilt (cytapheresis örnek) oranında seyreltin.</li>
	<li>Dikkatle seyreltilmiş hücre süspansiyon üzerine 50 mL konik tüp yoğunluk gradient ortamda 15 mL 35 mL katman. Çok sayıda tüpler seyreltilmiş kan dağıtmak için gerekli yapmak. Sallanan-kova Open End oda sıcaklığında 25 min için 1.290 x g de kapalı tut ile santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Dikkatle yoğunluk gradient orta ve plazma katmanın arasında arayüz mononükleer hücre katmanında Aspire edin ve hücreleri yeni bir 50 mL konik tüp aktarın.</li>
	<li>Tüp RPMI orta ile doldurmak, mix ve oda sıcaklığında 10 dakika için 1.290 x g de santrifüj kapasitesi. Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın.</li>
	<li>Hücre Pelet RPMI orta ve santrifüj 200 x g trombosit kaldırmak 10 min için de 20 ml resuspend. Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın. Bir kez bu adımı yineleyin.</li>
	<li>RPMI orta % 10 ile hücre Pelet resuspend Fetal sığır Serum (FBS). Not: doğrudan tetramer etiketleme için devam etmek ya da bir konsantrasyon 107 hücre/mL, gecede 4 ° C'de hücreler tutmak.</li>
</ol>2. tetramer ilişkili manyetik zenginleştirme Ag özgü B hücre
<ol><li>Her iki PE ekleyerek AG-tetramers hazırlamak veya APC etiketli premium sınıf streptavidin veya BV421 etiketli streptavidin molar oranı 1:4 biotinylated antijen monomer için de. Bir aliquot her 10 min oda sıcaklığında ekleyerek üç ayrı bölümlerinde streptavidin eşlenik uygun miktarda ekleyin.</li>
	<li>15 mL konik tüpler (3 x 108 tüp başına) hücrelerde dağıtmak ve 5 min için 460 x g, santrifüj kapasitesi. Not: Aşağıdaki protokol için bir tüp var.</li>
	<li>PBS (fosfat tamponlu tuz) 200 µL % 2 ile hücre Pelet resuspend FBS. PE, APC ve tetramers, her bir son konsantrasyonu 10 µg/ml BV421 Birleşik ekleyin. Mix iyi ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Buz gibi hücre ayrılık arabelleği (SB) % 0.5 BSA (sığır Serum albümin) ve EDTA (Ethylenediaminetetraacetic asit) ile PBS kullanarak hazırlamak 2 mM.</li>
	<li>SB. Pelet hücre 10 mL aralıklarla 460 x g 5 min için de ekleyebilirsiniz.</li>
	<li>Buz gibi SB. ekle 50 µL anti-APC manyetik lastikteki anti-PE ve 50 µL olan 500 µL hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Mix iyi ve 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Adım 2.5 iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant ortadan andresuspend 2 x 108 hücre/mL buz soğuk SB bir konsantrasyon, hücre Pelet.</li>
	<li>Bir mıknatıs SB 3 mL ile üzerinde konumlandırılmış büyük bir manyetik sütun equilibrate.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 2,9 dengelenmiş sütunun üst üzerine aktarmak ve tamamen drenaj sağlar. : Kritik sütun topaklanma önlemek için hücreleri bir 70 µm naylon ağ geçiş adım.</li>
	<li>Hangi hücrelerin buz soğuk SB 3 mL ile bulunan tüp durulama ve arabellek sütun (durumunda filtrasyon, durulama 70 µm naylon mesh) doğrudan üzerine aktarın.</li>
	<li>Arabellek sütuna tamamen süzülmüş, buz soğuk SB başka bir 3 mL için sütun ekleyin.</li>
	<li>2.13 başka bir 3 mL yıkama için yineleyin.</li>
	<li>Sütun üzerinde 15 mL konik toplama tüp mıknatıs ve yer çıkarın.</li>
	<li>Buz soğuk SB sütunun üst üzerine 5 mL ekleyin ve hemen pistonu kullanarak sütun hücreleri temizle. Bir kez bu adımı yineleyin.</li>
	<li>460 x g 5 min için de kendine hakim hücre (zenginleştirilmiş ilgili tetramer pozitif hücre kesir) santrifüj kapasitesi ve ek antikor boyama için devam edin. Not: Havuz, hücreleri uygunsa tüm tüpler toplanan.</li>
</ol>3. Ag özgü insan B hücreleri ve hücre sıralama boyama
<ol><li>Hücre Pelet CD3 karşı anti-insan antikorların bir kokteyl ile resuspend (son seyreltme: 1:20), CD19 (1:20) CD14 (1:50), CD16 (1:50) ve 7AAD (1: 1000) PBS 100 µL % 2 ile son bir hacim içinde FBS. 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Hücreleri, 460 x g, santrifüj 5 min için PBS 10 mL ekleyin ve süpernatant ortadan kaldırmak. Bir kez bu adımı yineleyin. Hücre Pelet PBS, filtre üzerine 70 µm naylon mesh 200 µL resuspend.</li>
	<li>Belirli B hücreleri tek hücre düzeyinde bir hücre sıralayıcısı sitometresi 100 µm meme ve 20 psi basınç ile üzerinde 1.000 olaylar/s9aşmadan sıralamak için devam edin. Not: kullanılan gating strateji şekil 1'. de gösterilen Hücreleri ilk geçişli CD14 üzerinde-CD16-7AAD- hücreleri monosit, NK ve ölü hücreleri ( şekil 1' de gösterilen değil) dışlamak için. O zaman CD19+ B hücre seçildi Çift Kişilik lekeli hücrelerdeyse çoğunluğuna önce PE ve APC ilgili Ag-tetramers tarafından. Spesifik olmayan B hücreleri (alakasız Ag-tetramer tarafından günahı) BV421 negatif hücreleri üzerinde perdeleme tarafından dışlandı.</li>
	<li>Daha önce 1 x PBS 10 µL ve RNAse inhibitörü ile 10 birim dolu ve bir raf 96 mikrotüpler için yerleştirilen 8-şerit PCR tüpleri içine tek B hücreleri toplamak. Hemen PCR tüpleri-80 ° C'de dondurmak Not: sitometresi araç üzerinde seçilen sıralama maskeleri verim maske vardır: 0, saflık maskesi: 32 ve faz maskesi: 0. bu tek hücreli depozito bir 96 - veya 384-da PCR plakasına gerekirse ayarlanmış olabilir. Tek B hücreleri kısa zamanda dondurulmuş olması ve-80 ° C'de birkaç hafta için gerekirse bırakılabilir.</li>
</ol>4. tek hücre RT-PCR
<ol><li>Hücreleri doğrudan PCR şeritler kuru bir banyoda 5 min için 70 ° C'de Donmuş numuneler Isıtma tarafından parçalayıcı.</li>
	<li>Buz ve transkripsiyon (RT) 2 x 1 mM dNTP, 25 µg/mL oligod(T) astar, 5 µM rastgele hexamers, 20 birim RNAse inhibitörü ve transkriptaz 400 Ünite içeren ana mix tampon tüp başına 10 µL ekleyerek tersine çevirmek için devam etmek için şeritler aktarın. Not: hücre çözdürme sonra RT hızlı bir şekilde RNA yıkımı önlemek için gerçekleştirilmesi gerekir.</li>
	<li>25 ° c melez, sonra 1s 50 ° c için kuluçkaya ve 95 ° c reaksiyonu durdurmak 3 min için bir kuluçka ile bitirmek rasgele hexamers izin vermek 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>İç içe geçmiş PCR güçlendirme için her değişken ağır (vH) ve kappa (vLκ) veya lambda hafif zincirleri (vLλ) için kodlama bölgede iki tur ile devam edin. Not: Alternatif olarak, RT örnekleri olabilir-20 ° C'de donmuş ve bir hafta boyunca devam etti.<ol>
<li>CDNA 1.5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, DNA polimeraz 2.5 birimleri ve 200 içeren bir 40 µL son birim için 3 µL PCR ilk turu için eklemek nM dış astar (bkz: Şekil 2 ve Tablo malzemeler için astar serileri). Not: Kompozisyon dış astar karıştırın. Ağır zincir amplifikasyon için: 4 ileri astar (5' SVH mix) ve 2 ters astar (3' CµCγ mix). Işık kappa zinciri amplifikasyon için astar 3 ileri (5' LV | mix) ve 1 ters astar (3' Cκ543-566). Işık lambda zinciri amplifikasyon için astar (5' LVl mix) 7 ileri ve astar (3' Cl) 1 ters. Not: Astar tarafından Tiller vd. tüm ağır ve hafif zincir aile genleri5amplifikasyon için tasarlanmış.</li>
		<li>Bisiklete binme aşağıdaki koşullar geçerlidir: 94 ° C 4 dk, 30 40 döngüsü tarafından takip 94 ° c, 30 s s VH ve VLκ VLλ için (60 ° C) ve 55 58 ° C'de s son bir uzama ile 72 ° C'de adım 7 dk 72 ° C'de.</li>
		<li>İkinci yuvarlak PCR için ilk amplifikasyon ürünü 3 µL 40 son bir hacim için kullanın µL 1.5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, DNA polimeraz 2.5 birimleri ve 200 içeren iç astar ifadeye klonlama için restriksiyon enzimi siteleri içeren nM (astar dizileri için bkz: Şekil 2 ve Malzemeler tablo ) vektörel çizimler. Not: Kompozisyon iç astar karıştırın. Ağır zincir amplifikasyon için: 9 ileriye astar (5' AgeIVH mix) ve 3 geriye doğru astar (3' SalIJH mix). Işık kappa zinciri amplifikasyon için 9 astar ileri (5' AgeIV | mix) ve 3 ters astar (3' BsiWIJκ mix). Işık lambda zinciri amplifikasyon için astar (5' AgeIVl mix) 6 ileri ve astar (3' XhoICl) 1 ters. Not: Astar tarafından Tiller vd., tüm ağır ve hafif zincir aile genleri5amplifikasyon için tasarlanmış.</li>
		<li>Bisiklete binme aşağıdaki koşullar geçerlidir: 94 ° C 4 dk, 30 40 döngüsü tarafından takip 94° c, 30 s s VH ve LCκ LCλ için (60 ° C) ve 45 58 ° C'de s son bir uzama ile 72 ° C'de adım 7 dk 72 ° C'de.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR ürünlerinin vH, vLκ ve vLλ (500 bp ürünler değişken ağır zincir kodlama segmentler için) ve bir 350 bp ürün segmentleri kodlama değişken hafif zinciri için % 1.5 özel jel üzerinde geçirme 5 μL tarafından olumlu wells tanımlayın.</li>
	<li>PCR ürünlerinin arıtma için tasarlanmış Ultrafiltrasyon membranları kullanarak pozitif kuyulardan kalan kalan 35 µL PCR ürün arındırmak.</li>
	<li>H2O. 60 µL PCR ürünleri elute</li>
</ol>5. ifade klonlama
<ol><li>
Ekler hazırlamak Not: 60 µL saflaştırılmış her PCR sindirmek son hacmi 100 µL uygun restriksiyon enzimi arabellek içeren ürün.<ol>
<li>VH PCR ürünleri, AgeI 50 birim ve SalI 50 birim eklemek ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
		<li>VLλ PCR ürünleri, AgeI 50 birim ve XhoI 50 birim eklemek ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
		<li>VLκ PCR ürünlerinin, AgeI 50 birim eklemek ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya 96 PCR membranlar kullanarak özetleri arındırmak ve H2o Digest 60 µL ile BsiWI restriksiyon enzimi arabelleği 100 µL son hacmi 60 µL eluate elute, BsiWI 50 birim eklemek ve 55 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
		<li>Isıtma için 15 dk 80 ° C'de tarafından enzimler devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vektörel çizimler ifade hazırlık Not: vH PCR ürünleri sürekli ağır zincir Igg1 Cγ1 içeren bir ifade vektör içinde (HCγ1) klonlanır. vLκ PCR ürünleri sürekli hafif zincir Cκ içeren bir ifade vektör içinde (LCκ) klonlanır. vLλ PCR ürünleri sürekli hafif zincir Cλ içeren bir ifade vektör içinde (LCλ) klonlanır.<ol>
<li>Aşağıdaki sindirim gerçekleştirin:<ol>
<li>Mix 1 µg ifade HCγ1 AgeI 10 ünite ve toplam hacmi 20 µL üretici tarafından önerilen kısıtlama arabelleği SalI endonucleases 10 ünite ile vektör ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
			<li>İfade vektör LCκ Mix 1 µg AgeI restriksiyon enzimi 20 µL kısıtlama arabelleğinin toplam hacmi 10 ünite ile üretici tarafından önerilen ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya 10 ünite BsiWI restriksiyon enzimi ekleyin ve 1 h 55 ° C'de için kuluçkaya</li>
			<li>İfade vektör LCλ Mix 1 µg AgeI 10 ünite ve toplam hacmi 20 µL kısıtlama arabelleği XhoI endonucleases 10 ünite ile üretici tarafından önerilen ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
		</ol>
</li>
		<li>Her sindirim karışımı enzimleri devre dışı bırakabilirsiniz 10 dk 65 ° C'de ısı.</li>
		<li>Sindirilir PCR ürünü 5 µL 2 µL ile birleştirmesini gerçekleştirmek (100 ng) 1 DNA ligaz arabellek x 20 µL tarafından kuluçka gecede 4 ° C'de 1 adet T4 DNA-ligaz ile toplam hacmine karşılık gelen doğrusallaştırılmış ifade vektör Not: Alternatif olarak, 4 ° C'de 3 h için ligasyonu gerçekleştirilir</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Klonlama
	<ol>
<li>Electroporate 1 µL ev yapımı electrocompetent TOP10 E. coli (Moleküler Biyoloji, Bölüm 1.8.4-1.8.8 geçerli protokoller) 45 µL içine 20 µL ligasyonu karışımı. 2 X YT orta 500 µL eklenir ve bir su banyosunda 30 dakika süreyle 37 ° C'de 2 x YT Ampisilin plakaları dönüştürülmüş yayılan bakteri kuluçkaya. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Her dönüşüm için PCR tarafından sekiz kolonileri ekran.<ol>
<li>Bir reaksiyon Premiks aşağıdaki gibi buza ayarla: 45 µL PCR tampon, 12 µL MgCl2 (25 mM), dNTPs (üzerinden bir hisse senedi içeren 10 mM her) 4 µL, 10 µL ileri astar (hisse senedi 10 µM) vektör sıra (astar Ab vec anlamda) hybridizing x 5 ve geriye doğru astar (hisse senedi 10 µM) sürekli ağır veya hafif zincir bölge hedefleme 10 µL ( Tablo reçetesi astar dizileri için bakınız). H2O. ile 200 µL son hacmi için makyaj Daha sonra 4 µL DNA polimeraz enziminin (5 U/µL) ekleyin.</li>
			<li>Reaksiyon Premiks 8-şerit PCR tüp buz üzerinde başına 25 µL dağıtın.</li>
			<li>Bireysel koloniler almak için steril bir kürdan kullanın. Kürdan Çoğalt bir tabak oluşturur ve sonra bir PCR reaksiyon tüp içine daldırma için 2 x TY Ampisilin plaka üzerine çizgi.</li>
			<li>Bisiklete binme aşağıdaki koşullarda PCR tarama gerçekleştirmek: 94 ° C için 10 min, 30 25 döngüsü tarafından takip 94 ° c, 30 s s 55 ° c ile 50 72 ° C'de s</li>
			<li>Pozitif bakteriler tarafından geçirme 5 µL PCR ürünlerinin % 1.5 özel jel üzerinde tanımlayın. Not: Pozitif kolonileri bir PCR ürünü yaklaşık 850 vermek ağır zincir vektör ve 600 için bp bp hafif zincir vektör için.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dört olumlu kolonileri Çoğalt plaka 2 mL LB orta aşılamak ve gecede 37 ° C'de 200 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.</li>
		<li>Plazmid sıvı kültürleri bir plazmid arıtma kit kullanarak üreticisi tarafından belirtildiği şekilde ayıklayın.</li>
		<li>Değişken etki alanı Sanger tarafından doğru yerleştirilmesi doğrulayın Plasmid'ler ile Ab vec anlamda astar, sıralama. Not: Plazmid (HC ve karşılık gelen LC kodlama) doğru eklemek ile 293A hücrelere salgılanması için cotransfected olacaksın. Küçük ölçekli üretilen mAbs özgüllük tarafından ELISA denetlesinler. Sonra büyük ölçekli üretim varsa gerçekleştirilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. mAbs imalatı
<ol><li>
Özgüllük kontrol etmek için küçük ölçekli üretim
	<ol>
<li>Transfection, tohum 15,000 insan embriyonik böbrek 293A önceki gün (HEK 293A) hücreleri 200 µL olan Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 10 ile desteklenmiş DMEM) içinde FBS 96-şey plakaları bir kuyu başına. Gecede 37 ° C'de CO2 kuluçka (%5 CO2) kuluçkaya</li>
		<li>DMEM orta % 10 içeren hücrelerde 293A cotransfect FBS doğrusal polyethylenimine türev transfection reaktifi kullanarak. Not: transfection triplicates içinde gerçekleştirin. Bir düz dipli 96-şey plaka bir şey için aşağıdaki iletişim kuralıdır.<ol>
<li>DNA transfection reaktif 0.5 µL 150 mM NaCl 10 µL sulandırmak. VH 0,125 µg ve vL ifade vektörlerin 0,125 µg 150 mM NaCl 10 µL oranında seyreltin. Girdap her seyreltme için 10 s.</li>
			<li>10 µL DNA transfection reaktif seyreltilmiş 10 µL DNA çözüm ekleyin. Girdap 15 s ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. 20 µL mix drop-wise 293A hücreleri üzerinde ve yavaşça plaka dönen tarafından karıştırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Orta 16 h serum-Alerjik orta 5 gün boyunca transfection ve kültür hücreleri sonra değiştirin. Not: serum-Alerjik orta serum IGS üretilen antikorlar kirletici önlemek için kullanın.</li>
		<li>Hücreleri ve enkaz Santrifüjü 460 x g 5 min için de tarafından ortadan kaldırmak.</li>
		<li>Aspirasyon ile çok kanallı pipet tarafından supernatants hasat ve V-alt 96-şey plaka aktarabilirsiniz.</li>
		<li>Gecede 4 ° C'de Sulandırılan ELISA/ELISPOT kaplama kuyu başına 100 µL içinde kat ilgili Ag 1 x 96-Peki ELISA tabak 2 µg/mL nihai bir konsantrasyon, tampon. 9örneklere bakın.</li>
		<li>Blok wells ile % 10 FBS DMEM orta 37 ° C'de 2 h için</li>
		<li>Supernatants transfected 293A hücre 50 µL 6.1.5 adımından ekleyin ve RT. 2 h için kuluçkaya</li>
		<li>Horseradish peroksidaz (HRP) enzim 1 µg/mL, 100 µL IgG Ab Birleşik bir anti-insan ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. 50 µL chromogenic substrat (TMB) ekleyin ve 20 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>450 de optik yoğunlukları okumak nm bir Spektrofotometre üzerinde. Not: ELISA tahlil tarafından ortaya belirli mAbs daha büyük ölçekte üretilmektedir ve protein saf insan IgG için ilgi gösteren bir sütun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Büyük ölçekli üretim ve belirli mAbs arıtma
	<ol>
<li>Transfection, tohum 6 x 106 insan embriyonik böbrek 293A önceki gün (HEK 293A) hücreleri 25 mL % 10 ile desteklenmiş DMEM içeren 175 cm2 şişe içine FBS. Gecede 37 ° C'de CO2 kuluçka (%5 CO2) kuluçkaya Not: Hücreleri transfected zaman % 70 birleşmesi olmalıdır.</li>
		<li>DMEM orta % 10 içeren hücrelerde 293A cotransfect FBS doğrusal polyethylenimine türev transfection reaktifi kullanarak.<ol>
<li>DNA transfection reaktif 50 µL 150 mM NaCl 450 µL sulandırmak. VH 10 µg ve vL ifade vektörlerin 10 µg 150 mM NaCl 500 µL oranında seyreltin. Girdap 10 s her seyreltme.</li>
			<li>Seyreltilmiş DNA transfection reaktif DNA ekleyin. Girdap 15 s ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. 1 mL karışımı drop-wise hücrelere ve yavaşça şişeye dönen tarafından karıştırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Orta 16 h serum-Alerjik orta 5 gün boyunca transfection ve kültür hücreleri sonra değiştirin.</li>
		<li>Hasat orta tarafından 25 mL pipet ile alıyorum.</li>
		<li>Hücreleri ve enkaz Santrifüjü 460 x g 5 min için de tarafından ortadan kaldırmak.</li>
		<li>Protein A 4 ° C'de bir hızlı protein sıvı Kromatografi (FPLC) sistemde ile kaplı bir 1 mL sütun kullanarak antikorlar arındırmak<ol>
<li>Protein sepharose sütun 20 mM fosfat tampon (pH 7) ile equilibrate.</li>
			<li>Hücre kültür ortamından 6.2.5 1.22 µm filtre sonra 0,45 µm filtre kullanarak filtre.</li>
			<li>Sütuna filtre uygulanmış orta yük.</li>
			<li>20 mM fosfat tampon (pH 7) yıkama ve 0.1 M sitrat arabellek (pH 3.5) ile elute.</li>
			<li>280, optik yoğunlukları okumak nm Absorpsiyon Spektrofotometre ve hemen protein içeren kesirler 1 M Tris arabelleği (pH 9) ile nötralize.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gecede 4 ° C'de karşı PBS tampon (pH 7,4) kesme 3.5 K Moleküler ağırlığı ile bir kaset içinde arıtılmış Ab diyaliz.</li>
		<li>0.2 µm filtrasyon ve denetim saflık olarak üretici tarafından belirtilen boyut-dışlama Kromatografi tarafından sterilize.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+therapeutics%3A+history+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody therapeutics: history and future.</a> Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).</li>
<li>Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+inhibitors+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment.</a> Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).</li>
<li>Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+therapeutic+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies.</a> Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).</li>
<li>Kwakkenbos, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+monoclonal+antibody-producing+B+cell+receptor-positive+human+memory+B+cells+by+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming.</a> Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).</li>
<li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li>
<li>Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+characterization+and+isolation+of+rare+memory+B+cells+with+antigen+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers.</a> Blood. 118 (2), 348-357 (2011).</li>
<li>Morris, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+human+anti-HIV+gp41+membrane+proximal+region+neutralizing+antibody+by+antigen-specific+single+B+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting.</a> PLoS One. 6 (9), e23532(2011).</li>
<li>Iizuka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cytomegalovirus+%28CMV%29pp65+antigen-specific+human+monoclonal+antibodies+using+single+B+cell-based+antibody+gene+cloning+from+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients.</a> Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).</li>
<li>Ouisse, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+single+B+cell+sorting+and+expression-cloning+from+immunoglobulin+humanized+rats%3A+a+rapid+and+versatile+method+for+the+generation+of+high+affinity+and+discriminative+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies.</a> BMC Biotechnol. 17 (1), 3(2017).</li>
<li>Kerkman, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterisation+of+citrullinated+antigen-specific+B+cells+in+peripheral+blood+of+patients+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis.</a> Ann Rheum Dis. , (2015).</li>
<li>Hamilton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Approach+for+Tetramer-Based+Identification+of+Autoantigen-Reactive+B+Cells%3A+Characterization+of+La-+and+snRNP-Reactive+B+Cells+in+Autoimmune+BXD2+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice.</a> J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).</li>
<li>Sanjuan Nandin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in+vitro+booster+vaccination+to+rapidly+generate+antigen-specific+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies.</a> J Exp Med. , (2017).</li>
<li>Bowers, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+display+for+the+discovery+and+optimization+of+antibody+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics.</a> Methods. 65 (1), 44-56 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Önerilen protokol doğrudan kanda dolaşan Ag özgü B hücreleri insan mAbs üretimi için güçlü bir yöntem olmasıdır. Bu üç önemli yönleri birleştirir: (i) bile nadir Ag bağlayıcı B hücreleri; bir ex vivo yalıtım sağlayan bir tetramer ilişkili manyetik zenginleştirme, kullanımı (II) etiketli üç Ag tetramers (iki ilgili olanlar ve bir alakasız bir) ile üç farklı fluorochromes izole, Akış Sitometresi tarafından yalnızca B hücreleri BCR belirli istenen Ag için bir ifade kullanır bir perdeleme strateji; (iii) karşılık ge...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56508/generation-discriminative-human-monoclonal-antibodies-from-rare">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood</a>.
The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,&#160;Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1 
1Centre R&#233;gional de Recherche en Canc&#233;rologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Universit&#233; de Nantes 
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,3,&#160;Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2&#160; 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Universit&#233; d&#39;Angers, Universit&#233; de Nantes 
2LabEx IGO, &#34;Immunotherapy, Graft, Oncology&#34; 
3CHU, Nantes, France

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56508/generation-discriminative-human-monoclonal-antibodies-from-rare">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood</a>

Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Burada açıklanan yöntemi istenen antijen (Ag) karşı tamamen insan Monoklonal antikor (mAbs) hızlı ve çok yönlü üretimini sağlar. mAbs birçok temel araştırma uygulamaları içinde in vitro ve in vivotemel araç vardır: Örneğin Akış Sitometresi, Histoloji, western Blot, engelleme deneyleri. Ayrıca, mAbs daha fazla tıpta otoimmün hastalıklar, kanser, tedavisi için ve nakli ret1kontrol etmek için kullanılıyor. Örneğin, anti-CTLA-4 ve anti-PD-1 (ya da anti-PD-L1) mAbs son zamanlarda kanser tedavileri2bağışıklık denetim noktası inhibitörleri olarak kullanılmıştır.
İlk mAbs immünglobulin (Ig) tarafından üretildi-hybridomas salgılayan aşılı fare ya da sıçan dalak hücrelerinden elde. Ancak, fare ya da sıçan mAbs karşı güçlü bağışıklık yanıtı hızlı onların temizlik ve aşırı duyarlılık reaksiyonları3olası indüksiyon nedeniyle insanlarda terapötik kullanımları engellemektedir. Bu sorunu çözmek için hayvansal protein dizileri mAbs kısmen sözde chimeric fare-insan veya insanlaşmış antikorlar oluşturmak için insan olanlar tarafından değiştirilmiş. Ancak, bu strateji yalnızca kısmen önemli ölçüde maliyet ve zaman ölçekli üretim artırırken immünojenisite, azaltır. İnsan mAbs doğrudan insan B hücreleri oluşturmak için daha iyi bir çözümdür ve bunun için çeşitli stratejiler mevcuttur. Onlardan biri fajının veya Maya display kullanımıdır. Bu rastgele insan IG ağır Kombinatorik kitaplığından değişken etki alanları görüntüleme içerir ve ışık phages veya Mayalar ve ilgi spesifik antijen kullanarak bir seçim adım taşıyan zincirleri. Bu stratejinin büyük bir dezavantaj ağır ve hafif zincirleri rastgele ilişkili, çok büyük bir artış için oluşturulan antikorlar çeşitlilik içinde lider olmasıdır. Elde edilen antikor üzerinden belirli bir Ag karşı doğal bir bağışıklık yanıtı ortaya çıkacak karşılık gelmesi olası değildir. Ayrıca, insan protein katlanması ve translasyonel modifikasyonlar sistematik olarak prokaryot ve Mayalar hatta çoğaltılamaz değil. İkinci bir insan mAb üretim yöntem doğal insan B hücreleri, Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu veya anti-apoptotik faktörler BCL-6 ve BCL-XL4ifade tarafından əbadoləşdirmək olduğunu. Ancak, bu yöntem yalnızca bellek B hücreleri için geçerlidir ve az (varsa) mAb klonlar istenen antijenik özgüllük ile tanımlamak için çok sayıda mAb üreten ölümsüzleştirdi B hücreleri ile taranması gerektiren verimli değildir. Böylece pahalı ve zaman alıcı bir yöntemdir.
Yeni bir protokol son zamanlarda insan mAbs izole tek B hücreleri5üretiminin tarif edilmiştir. Bunun üzerine bir en iyi duruma getirilmiş tek hücreli ters transkripsiyon-Polimeraz zincir tepkimesi (RT-PCR) amplifikasyon her iki ağır - ve ışık-segmentleri bir tek sıralanmış B hücreden kodlama zinciri için dayanır. Bu böylece tamamen insan mAb yeniden inşası izin bir ökaryotik ifade sisteminde, klonlama ve ifade Bu kesimler tarafından takip ediyor. Bu iletişim kuralı başarıyla B hücreleri aşı bağışçılardan başlayarak kullanılmıştır. Hücreleri birkaç hafta sonra aşı B hücre istenen Ag karşı yönetmen yüksek frekansları almak ve böylece6eleme için gereken süreyi sınırlamak için hasat edildi. Tamamen insan diğer mAbs aynı zamanda enfekte HIV+ (insan immün yetmezlik virüsü) hastalar7 ve melanom hastalarda8üretilmektedir. Bu gelişmeler rağmen bu hala bir işlemdir Ag özgü B hücreleri kendi bellek fenotip veya frekans bağımsız yalıtım sağlayan kullanılabilir.
Prosedür tanımlamak burada verimli ex vivo yalıtım insan dolaşımdaki B hücreleri tamamen insan antijen spesifik mAbs yüksek verim ve düşük tarama süresi ile üretim ardından BCR olmalarından temel yol açar. Yöntem bellek B hücreleri veya antikor salgılayan B hücreleri bağışıklık yanıtının sonra indüklenen için sınırlı değildir, ama insan naif B hücre repertuar için de uygulanabilir. O bile Ag özgü B hücreleri çok düşük frekanslarda mevcut başlayarak inşaat verimlilik iyi bir göstergesidir. Yönteminin prensibi aşağıdaki gibidir: periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) iki tetramers faiz antijen sunan lekeli, her bir farklı fluorochrome ile (örneğin, Phycoerythrin (PE) ve Allophycocyanin (APC)), etiketli ve üçüncü bir tetramer yakından ilgili bir antijen sunan bir üçüncü fluorochrome ile (örneğin, parlak mor 421 (BV421)) Birleşik. Antijen bağlayıcı hücreleri için zenginleştirmek için hücreleri daha sonra anti-PE ile kaplı boncuk ile inkübe ve anti-APC Abs ve hücre ayrılık sütunlarda sıralanabilir. PE+ APC+ hücre kesir, mAbs farklı PBMC hücre türlerine B hücreleri tanımlanmasına izin özgü çeşitli lekeli ve tabi Akış Sitometresi hücre sıralama için seçilir. PE+ ve APC+, parlak mor-, ama olan B hücreleri izole edilmiştir. Bu adımı karşı olan B hücreleri olmayan veya tetramerized antijen bind yapmak ama ya PE veya APC (Bu hücreler PE+ APC- veya PE- +APC olacak) veya tetramers (Bunlar kullanılan antijen parçası bağlamak hücreleri seçer hücre-ecek var olmak BV421+). B hücreleri değil son derece ilgi epitope için belirli karşı bu adımda belirlenmişse de (Bu hücreler-ecek da var olmak BV421+). Bu nedenle, bu yöntem B-hücre reseptörleri (BCRs) iki çok yakından ilgili antijenleri arasında ayrımcılık mümkün ifade son derece belirli B hücreleri arındırmak. Tek belirli B hücreleri tüplerde toplanır ve onların PCR güçlendirilmiş IG cDNAs (tamamlayıcı deoksiribonükleik asit) klonlanmış ve tarafından salgılanan IgG mAbs insan hücre çizgilerle ifade.
Kavramının bir kanıtı olarak, bu çalışmada bir peptid ben MHC kompleksi sınıf tarafından sunulan tanıyan insan mAbs, verimli nesil açıklar (MHC-ben) molekül ve bu peptid ve aynı yüklü diğer peptidler arasında ayırt edebilirsiniz MHC-ben gen. Bu AG karmaşıklık düzeyi önemli olmakla birlikte, bu yöntem, (i) Ag özel mAbs yüksek verimli kurtarma sağlar; (ii) üretim mAbs iki yapısal olarak yakın Ags arasında ayırımcılık yapması mümkün. Bu yaklaşım herhangi bir iletişim kuralı yapılmaksızın aşı veya enfekte hastalar için genişletilmiş ve ayrıca zaten başarıyla bir insanlaşmış sıçan sistem9' uygulamaya konmuştur. Böylece, bu çalışmada temel araştırma ve immünoterapi kullanılabilir tamamen insan mAbs oluşturmak için çok yönlü ve verimli bir yaklaşım açıklar.

<table><tbody><tr><td>HEK 293A hücre hattı</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X) Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı</td><td>Gibco yaşam teknolojileri tarafından</td><td>21969-035(+</td><td>) 4,5g/L D-Glikoz 0,11g/L sodyum piruvat (-) L-Glutmin</td></tr><tr><td>RPMI medium1640 (1X)</td><td>Gibco by yaşam teknolojileri</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin (BSA)</td><td>PAA</td><td>K45-001</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td>100X Conc</td></tr><tr><td>PBS-Fosfat Tamponlu Salin (10X) pH 7,4</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Etilendiamintetraasetik asit) 0,5M pH=8</td><td>Life Technologies tarafından Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır serumu (FBS)</td><td>Dominique Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll - lenfositlerin ayrılması orta</td><td>EuroBio</td><td>CMSMSL01-01</td><td>yoğunluk 1,0777 +/- 0,001</td></tr><tr><td>streptavidin R-fikoeritrin konjugatı</td><td>Invitrogen by Life Technologies</td><td>S21388</td><td>premiun grade 1mg / ml 5mM sodyum azid</td></tr><tr><td>Streptavidin, allofikosiyanin konjugatı</td> içerir ThermoFisher <td>scientific S32362</td><td>tarafından Invitrogen</td><td>1mg / ml 2mM azid birinci sınıf</td></tr><tr><td>Parlak menekşe 421 streptavidin</td><td>Biolegend</td><td>405225</td><td>konsantre : 0,5mg/ml</td></tr><tr><td>Anti-PE konjuge manyetik Mikro Boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC konjuge manyetik Mikro Boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACs veya QuadroMACS separotor</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302 / 130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>LS Sütunlar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD3 BV510 BD horizon</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>563109</td><td>Kullanılan seyreltme 1:20</td></tr><tr><td>CD19 FITC</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>345788</td><td>Kullanılan seyreltme 1:20</td></tr><tr><td>CD14 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>561116</td><td>Kullanılan seyreltme 1:50</td></tr><tr><td>CD16 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>338440</td><td>Kullanılan seyreltme 1:50</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>51-68981E (559925)</td><td>Kullanılan seyreltme 1:1000</td></tr><tr><td>FACS ARIA III Hücre Sıralayıcı Sitometre</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 şeritli PCR tüpleri</td><td>Axygen</td><td>321-10-061</td><td></td></tr><tr><td>96 mikrotüp için Raflar</td><td>Dominique Dutscher</td><td>45476</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Ribonükleaz İnhibitörü (rekombinant)</td><td>ThermoFisher scientific tarafından invitrojen</td><td>10777-019</td><td>adet: 5000U (40U / ul)</td></tr> <tr><td>Damıtılmış Su Dnase / Rnase Free</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Oligod (T) 18 mRNA Primer</td><td>New England BioLabs</td><td>S1316S</td><td>5.0 A260unit</td></tr><tr><td>Rastgele heksamer</td><td>ThermoFisher scientific tarafından Invitrogen</td><td>N8080127</td><td>adet : 50uM, 5nmol</td></tr><tr><td>Üst simge III Ters transkriptaz</td><td>İnvitrojen thermoFisher scientific</td> <td>tarafından18080-044</td><td>adet : 10000U (200U/ul)</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polimeraz</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Seti, Moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td>4*100umol</td></tr><tr><td>5LVH1</td><td>Eurofins</td><td>ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG</td><td>PCR'nin ilk turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - Dış astarlar - İleri Prmers</td></tr><tr><td>5LVH3</td><td>Eurofins</td><td>AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG</td><td>PCR'nin ilk turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - Dış astarlar - İleri Prmers</td></tr><tr><td>5LVL4_6</td><td>Eurofins</td><td>CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG</td><td>PCR'nin ilk turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - Dış astarlar - İleri Prmers</td></tr><tr><td>5LVH5</td><td>Eurofins</td><td>CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG</td><td>PCR'nin ilk turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - Dış astarlar - İleri Prmers</td></tr><tr><td>3HuIgG_const_anti</td><td>Eurofins</td><td>TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT</td><td>PCR'nin ilk turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - Dış astarlar - İnsan Ig- Bakteriler için ters primerler PCR taraması</td></tr><tr><td>3CuCH1</td><td>Eurofins</td><td>GGGAATTCTCACA GGAGACGA</td><td>PCR'nin ilk turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - Dış astarlar -İnsan Ig 5AgeIVH1_5_7 için ters primerler</td></tr><tr><td></td><td></td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>5AgeIVH3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>5AgeIVH3_23</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>5AgeIVH4</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>5AgeIVH4_34</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_18</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_24</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>5AgeIVH3__9_30_33</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>5AgeIVH6_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>3SalIJH1_2_4_5</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç primerler -Ters primerler</td></tr><tr><td>3SalIJH3</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -Ters astarlar</td></tr><tr><td>3SalIJH6</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -Ters astarlar</td></tr><tr><td>5' LVk1_2</td><td>Eurofins</td><td>ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG</td><td>PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - Dış astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>5'LVk3</td><td>Eurofins</td><td>CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG</td><td>PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - Dış astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>5'LVk4</td><td>Eurofins</td><td>ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG</td><td>PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - Dış astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>3'Ck543_566</td><td>Eurofins</td><td>GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA</td><td>PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - Dış primerler -Ters primerler - Bakteri PCR taraması</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1_9_1&ndash; 13</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1D_43_1_8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2_28_2_30</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_11_3D_11</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTTGACACAGTC</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_15_3D_15</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_20_3D_20</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTTGACGCAGTCT</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>5'AgeVk4_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk1_2_4</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk3</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk5</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>5'LVl1</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG</td><td>PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>5'LVl2</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG</td><td>PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>5'LVl3</td><td>Eurofins</td><td>GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG</td><td>PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>5'LVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG</td><td>PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>5'LVl6</td><td>Eurofins</td><td>GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG</td><td>PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>5'LVl7</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG</td><td>PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>5LVl8</td><td>Eurofins</td><td>GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG</td><td>PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri astarlar</td></tr><tr><td>3'Cl</td><td>Eurofins</td><td>CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG</td><td>PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri primerler</td></tr><tr><td>5'AgeIVl1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - İç astarlar -ileri astarlar</td></tr><tr><td>5'AgeIVl2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - İç astarlar -ileri astarlar</td></tr><tr><td>5'AgeIVl3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - İç astarlar -ileri astarlar</td></tr><tr><td>5'AgeIVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - İç astarlar -ileri primerler</td></tr><tr><td>5'AgeIVl6</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - İç astarlar -ileri astarlar</td></tr><tr><td>5'AgeIVl8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - İç astarlar -ileri astarlar</td></tr><tr><td>3'XhoICl</td><td>Eurofins</td><td>CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG</td><td>PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - İç astarlar -Ters primerler - Bakteri PCR taraması</td></tr><tr><td>Ab-vec-sense</td><td>Eurofins</td><td>GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC</td><td>Bakteri PCR taraması</td></tr><tr><td>QA Agarose-TM, Moleküler Biyoloji Sınıfı</td><td>MP Bio</td><td>AGAH0500</td><td></td></tr><tr><td>NucleoFast 96 PCR Plakası</td><td>Macherey Nagel</td><td>743.100.100</td><td></td></tr><tr><td>Enzim Yaşı I HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3552L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzim SalI HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3138L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzim Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzim BSIWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553L</td><td>10000U/ml</td></tr><tr><td>HCg1 (Genbank katılım numarası FJ475055)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCk (Genbank katılım numarası FJ475056 )</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCl (Genbank katılımı sayı FJ517647)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>ThermoFisher scientific tarafından Invitrogen</td><td>15224.017</td><td>100U (1U/ul)</td></tr><tr><td>2X YT ortamı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1003-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Luria Bertani) Et Suyu (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nükleospin Plazmid DNA, RNA ve protein saflaştırma</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.250</td><td></td></tr><tr><td>Jet PEI DNA transfeksiyon reaktifi</td><td>PolyPlus</td><td>101-40</td><td></td></tr><tr><td>Düz tabanlı96 kuyulu plaka</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>V tabanlı 96 kuyulu plaka</td><td>Nunc/Thermofisher 055142</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc easy 175 cm2 şişeler</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>12-562-000</td><td></td></tr><tr><td>ELISA/ELISPOT kaplama tamponu</td><td>eBiosciences</td><td>00-0044-59</td><td></td></tr><tr><td>Nunc maxisorp düz tabanlı 96 kuyulu ELISA plakaları</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>44-2404-21</td><td>yüksek protein bağlayıcı</td></tr><tr><td>Yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge anti-insan IgG Ab</td> <td>Pharmingen / BD Biosciences</td><td>55788</td><td></td></tr><tr><td>TMB substrat</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S0677</td><td></td></tr><tr><td>1 mL-HiTrap proteini A HP sütunu</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0402-01</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>18190026</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL sütunu</td><td>GE Healthcare</td><td>17517501</td><td></td></tr><tr><td>NGC Quest 10 Plus Kromatografi Sistemi</td><td>BioRad</td><td>7880003</td><td></td></tr></tbody></table>

kanda dolaşan nadir antijen spesifik b hücreleri discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoklonal antikor (mAbs) güçlü her iki temel araştırma ve Biyomedikal yararlı araçlardır. Antikor (örneğin, bir normal protein ve bunların mutasyona uğramış bir sürüm) son derece ilgili yapılar arasında ayırt etmek gerektiğinde yüksek olmalarından vazgeçilmezdir. Böyle discriminative mAbs üreten geçerli yolu, pahalı ve zaman alıcı olan birden fazla Ab üreten B hücrelerinin geniş tarama içerir. Biz burada tamamen insan mAbs B lenfositler dolaşan kan grubundan başlayan discriminative, nesil için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem öneriyorum. Diğer tüm hücrelerin hazır periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) kullanarak karşı seçim ile kombine spesifik antijen bağlayıcı B hücre seçimini bu strateji özgünlük kaynaklanmaktadır. Belirli B hücreleri izole olduğunda, karşılık gelen mAb için kodlama cDNA (tamamlayıcı deoksiribonükleik asit) dizileri tek hücre ters transkripsiyon-Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) teknolojisini kullanan ve daha sonra insan ifade elde edilir hücreleri. Gibi az içinde 1 ay olarak, doğal olarak B hücre repertuar tarafından algılanan hemen hemen herhangi bir istenen antijen karşı son derece discriminative insan mAbs miligram üretmek mümkündür.

PBMC bu proje hediye peptid Pp65495 tanıyan insan mAbs, nesil sağlıklı bağışçılardan başlayan (Pp65, insan Sitomegalovirüs üzerinden) sunulan MHC kompleksi sınıf tarafından ben (MHC-ben) molekül HLA - A * 0201 () HLA-A2). Bu mAbs bu karmaşık ve aynı MHC yüklenen diğer peptidler temsil eden konut projeleri arasında ayırt edebilirsiniz-ben molekül.
PBMC HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC ve yukarıdaki protokolünde açıkland...

Biz insan kanında dolaşan nadir B hücreleri başlayarak insan antikorlar faiz, bir antijen için belirli üretim için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu doğal antikorlar nesil verimli ve hızlı ve elde edilen antikor arasında son derece ilgili antijenleri ayırt edebilirsiniz.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Bu prosedürün genel amacı, kanda dolaşan insan B lenfositlerinden başlayarak istenen bir antijene karşı tamamen insan monoklonal antikorları üretmektir. Bu protokol, yüksek oranda ilişkili antijenler arasında ayrım yapabilen monoklonal antikorların üretilmesine izin verir. İmmünoterapi gibi bazı uygulamalar için, bir antijenin hassas bir şekilde hedeflenmesi vazgeçilmez olabilir.Bu tekniğin avantajları, bunun sağlıklı veya aşılanmış donörlerin kanından başlayarak yapılabilmesi ve nadir antijen bağlayıcı B hücrelerinin bile izolasyonuna izin vermesidir. Bu yöntem insan örneklerinden yola çıkılarak tarif edilirken, önceden aşılanabilen hayvanlara da uygulanabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü prosedür gerçekten de ayırt edilmiş B lenfositlerinin oldukça karmaşık çoklu analitik geçit stratejisi altındadır.İşlem Melinda tarafından gerçekleştirilecektir. Laboratuvarımızda yardımcı mühendis olarak görev yapmaktadır. İlk olarak, 50 mililitrelik konik bir tüpte 15 mililitre yoğunluk gradyanı üzerine 35 mililitre seyreltilmiş hücre süspansiyonu pipetleyin.Daha sonra konik boruyu frenleri kapalı bir döner kova rotoruna yerleştirin ve oda sıcaklığında 25 dakika boyunca yerçekiminin 1290 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. Daha sonra, yoğunluk gradyan ortamı ve plazma tabakasının arayüzünde, mononükleer hücre tabakasını dikkatlice aspire edin ve yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe ekleyin ve beş dakika boyunca yerçekiminin 460 katında santrifüjleyin.Daha sonra, peleti% 2 fetal sığır serumu ile 200 mikrolitre fosfat tamponlu salin içinde yeniden süspanse edin. Konjuge tetramerleri mililitre başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin. İyice karıştırın ve ardından oda sıcaklığında, ışıktan korunarak Laminer akış başlığında 30 dakika inkübe edin.Daha sonra hücre süspansiyonuna 10 mililitre buz gibi soğuk hücre ayırma tamponu ekleyin. Hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 460 kez yerçekiminde santrifüjleyin. Elde edilen hücre peletine 500 mikrolitre buz gibi soğuk hücre ayırma tamponu ve 50 mikrolitre iki çeşit manyetik mikro boncuk ekleyin ve hücre süspansiyonunu 20 dakika inkübe edin.Sonraki, hücre peletini buz gibi soğuk hücre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu dengeli bir kolonun üstüne dikkatlice aktarın ve tamamen boşalmasına izin verin. Daha sonra tüpü üç mililitre hücre ayırma tamponu ile durulayın ve tamponu kolona aktarın.Sütunu üç kez duruladıktan sonra, mıknatıstan çıkarın ve 25 mililitrelik konik bir toplama tüpüne yerleştirin. Kolonun üstüne beş mililitre buz gibi soğuk ayırma tamponu ekledikten sonra, hücreleri bir piston yardımıyla kolondan hızlı bir şekilde yıkayın. Hücre peletini,% 2 fetal sığır serumu ile toplam 100 mikrolitre fosfat tamponlu salin hacminde bir anti-insan antikor kokteyli ve 7AAD ile yeniden süspanse edin.Ardından, hücreleri 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, belirli B hücrelerini saniyede 1.000 olayı aşmayacak şekilde tek hücre düzeyinde sıralamak için bir hücre sıralayıcı sitometre kullanın. Daha sonra, tek sıralanmış B hücrelerini daha önce 10 mikrolitre 1X fosfat tamponlu salin ve 10 birim RNAse inhibitörü ile doldurulmuş 8 şeritli PCR tüplerine toplayın ve 96 mikrotüp için bir rafa yerleştirin.Tüpleri eksi 80 santigrat derecede hızla dondurun. Dondurulmuş numuneleri, hücreleri parçalamak için beş dakika boyunca 70 santigrat derecede tutulan kuru bir banyoda ısıtın. Ardından şeridi buzun üzerine yerleştirin ve ters transkripsiyon ana karışımını oluşturmaya başlayın.Ters transkripsiyon ana karışımı hazırlandıktan sonra, program termocycler'a talimat verir. Ters transkripsiyonun sonunda, immünoglobulin genlerini amplifiye etmek için iç içe PCR'ler gerçekleştirin. Değişken ağır zincir ve kodlama segmentleri için 500 baz çifti PCR ürününün ve değişken hafif zincir kodlama segmentleri için 350 baz çifti PCR ürününün migrasyonunu %1,5'lik bir agaroz jel üzerinde görselleştirerek pozitif klonları tanımlayın.45 mikrolitre elektroyetkin TOP10 E.coli hücresine bir mikrolitre klonlama ürünü ekleyin. Elektroporat. Daha sonra hücrelere hızlı bir şekilde 500 mikrolitre 2X YT ortamı ekleyin ve 37 santigrat derecede bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin. Dönüştürülmüş bakterileri 2X YT ampisilin plakasına yayın.Ardından, plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, bir reaksiyon ön karışımı ayarlayın ve buz üzerinde tutulan 8 şeritli PCR tüpü başına 25 mikrolitre ekleyin. Ardından, kolonileri toplamak için steril bir kürdan kullanın ve kolonileri 2X YT ampisilin plakasına çizin.Ardından kürdanları PCR reaksiyon tüpüne batırın. Ağır zincir vektörü için 850 baz çifti PCR ürününün ve hafif zincir vektörü için 600 baz çifti PCR ürününün migrasyonunu %1.5'lik bir agaroz jel üzerinde görselleştirerek pozitif klonları tanımlayın. İki mililitre LB ortamında, dört pozitif koloniyi aşılayın.Aşılamayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, dakikada 200 devirde çalkalayın. Transfeksiyondan bir gün önce düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 200 mikrolitre Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında 15.000 insan embriyonik böbrek hücresi tohumlayın. Daha sonra plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksitte inkübe edin.Doğrusal bir polietilenimin türevi transfeksiyon reaktifi kullanarak hücreleri birlikte transfekte edin. 0.5 mikrolitre DNA transfeksiyon reaktifini 10 mikrolitre 150 milimolar sodyum klorür ile seyreltin. Daha sonra, her değişken ağır ve hafif zincir eksprese eden vektörlerin 0.125 mikrogramını 10 mikrolitre 150 milimolar sodyum klorür içinde seyreltin.Tüm seyreltmeleri her biri 10 saniye boyunca girdaplayın. Daha sonra, önceden seyreltilmiş DNA transfeksiyon reaktifini 10 mikrolitre DNA çözeltisi ile karıştırın. DNA transfeksiyon karışımını 15 saniye boyunca hızlı bir şekilde girdap haline getirin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.DNA transfeksiyon karışımını hücrelerin üzerine damla damla ekleyin ve ardından plakayı hafifçe döndürün. Transfeksiyondan 16 saat sonra ortamı değiştirin ve hücreleri beş gün boyunca serum içermeyen ortamda 37 santigrat derecede kültürleyin. Ardından, süpernatanı aspire etmek için çok kanallı bir pipet kullanın ve v-tabanlı 96 oyuklu plakaya aktarın.Her bir kuyucuğu, mililitre başına iki mikrogramlık bir nihai konsantrasyonda 100 mikrolitre sulandırılmış ELISA kaplama tamponunda gece boyunca dört santigrat derecede ilgili antijen ile 96 oyuklu bir ELISA plakasında kaplayın. Daha sonra, 96 oyuklu bir ELISA plakasının kuyucuklarına 50 mikrolitre transfekte edilmiş bir hücre süpernatantı ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Daha sonra, mililitre konsantrasyonda bir mikrogram olarak yaban turpu peroksidaz enzimine konjuge edilmiş 100 mikrolitre antihuman immünoglobulin G antikoru ekleyin ve kuyuyu oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.Son olarak, kuyucuğa 50 mikrolitre kromojenik substrat ekleyin ve 20 dakika daha inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, bir spektrofotometrede 450 nanometredeki optik yoğunluğu okuyun. Spesifik B hücrelerini izole etmek için, HLA-A2 / PP65 kompleksine karşı reseptörleri eksprese eden B hücrelerini ayırt eden bir geçit stratejisi kullanıldı.Başlangıçta, hücreler CD19 pozitif, CD3 negatif kapılıydı. Son olarak, hücreler hem HLA-A2 / Pp65PE hem de HLA-A2 / Pp65APC ile boyandı, ancak HLA-A2 / MelABV421 tetramerleri ile boyanmadı, yüksek derecede spesifik B hücrelerini elde etmek için kapılandı. Bu geçit stratejisi kullanılarak, HLA-A2 / PP65 ve diğer ilgili HLA-A2 peptit kompleksi arasında ayrım yapabilen seçici B hücreleri izole edilebilir.Daha sonra, HLA-A2 / PP65 tetramerine karşı PC1.02 antikorunun varlığını incelemek için bir ELISA testi yapıldı. Elde edilen çubuk grafiğinde, y ekseni optimum yoğunluk okumalarına karşılık gelir ve x ekseni HLA-A2 peptitlerine karşılık gelir. Testten, bir monoklonal antikorun HLA-A2 / Pp65 tetramer ile bir peptit ve majör histouyumluluk kompleksine bağlı bir şekilde bağlandığını göstermektedir.Daha sonra, PC1.02 antikorunun bağlanma afinitesini incelemek için yüzey plazmin reziyonu kullanıldı. Daha sonra, HLA-A2/PP65 spesifik B hücrelerini analiz etmek için tablo şeklinde bir veri elde edildi. Spesifik olmayan B hücrelerinin dışlama stratejisinin, immünoglobulin gen amplifikasyonunun verimlerinin ve HLA-A2 / PP65 spesifik B hücrelerinden monoklonal antikor üretiminin etkisi gösterilmiştir.Bir kez ustalaştıktan sonra, insan kanından antijenlere özgü B hücrelerinin izolasyonundan monoklonal antikor üretimine kadar uzanan teknik bir ay gibi kısa bir sürede yapılabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, duraklamadan doğrudan B hücrelerinin sıralanmasından RT-PCR'ye geçmeyi unutmayın.

generation-discriminative-human-monoclonal-antibodies-from-rare

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, ağır ve hafif zincir genlerine sahip plazmit vektörlerini tanıtarak memeli hücrelerinden antikor üretme yöntemini göstermektedir. Bu vektörler polietilenimin ile etkileşime girer ve polipleksler oluşturarak hücrelere girer; Daha sonra, tek tek proteinlere çevrilirler ve hücre dışı ortama salgılanan tam antikorlara birleştirilirler.

Memeli Hücre Kültürlerinden Rekombinant Monoklonal Antikorların Üretilmesi

Video, antijene özgü B hücrelerinden monoklonal antikorlar üretmek için bir tekniği göstermektedir. İzole edilmiş antijene özgü B hücrelerinden klonlanan antikorların ağır ve hafif zincirlerini kodlayan ökaryotik ekspresyon vektörleri, polipleksler kullanılarak memeli hücrelerine sokulur. Hücrelerin içine girdikten sonra, bu vektörler translasyona uğrar ve elde edilen ağır ve hafif zincirli peptitler, daha sonra hücreler tarafından salgılanan antikorlara dönüşür.

Antijene Özgü B Hücrelerinden Monoklonal Antikorlar Üretmek İçin Bir Teknik

Bu makale, tanımlanmış bir alloantijene spesifik olarak yanıt veren insan T hücresi klonlarının üretilmesi ve yayılması için bir yöntemi açıklar. Bu protokol, çeşitli peptit-MHC ligandlarına özgü insan T hücrelerinin klonlanması için uyarlanabilir.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

İnsan monoklonal antikorlarının sentezi, oto-antikor aracılı immün yanıtların patofizyolojik mekanizmalarını çözmeyi amaçlayan çalışmaların ilk basamağıdır. B hücresi izolasyonu, antikor klonlaması ve in vitro sentez dahil olmak üzere kanla sınıflandırılmış B hücrelerinden rekombinant insan immünoglobulin G (IgG) monoklonal antikorları üretmek için bir protokol geliştirdik.

Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi

İnsan periferik kanı, humoral immün yanıtın değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılır. Burada, insan B hücrelerini periferik kandan izole etme, insan B hücrelerini kültürde antikor (Ab) salgılayan B hücrelerine (ASC'ler) ayırma ve bir ELISpot testi ile toplam IgM ve IgG-ASC'leri numaralandırma yöntemleri açıklanmaktadır.

İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi&#39;nin olarak

Hidoma teknolojisine dayalı monoklonal antikorların üretilmesi için optimize edilmiş bir protokol sunulmuştur. Fareler bir immünokonjugat ile aşılandı. Dalak hücreleri, PEG ve ölümsüz miyelom hücreleri ile bir elektrik darbesi ile kaynaştırıldı. Antikor üreten hibridoma hücreleri HAT ve antijene özgü ELISA taraması ile seçildi.

Hibridoma teknolojisi ile murin monoklonal antikorlar üretilmesi

Fonksiyonel ve fenotipik analizi için antijene reaktif B hücreleri tespit etmek ve ettirecek bir manyetik nano-tanecikleri kullanır basit ama etkili bir yöntem tarif edilmiştir.

Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

Bu makale hazırlanması ve doğal ürünler kullanmak üzere çeşitli uzun karşı Monoklonal antikor değerlendirilmesi için detaylı bir protokol sağlar. Bu yordam bağışıklama, hücre füzyon, dolaylı rekabet ELISA olumlu klon eleme ve monoklonal Hibridoma hazırlık için içerir. Antikor karakterizasyonu MALDI-TOF-MS ve ELISA analizleri kullanarak spesifikasyonları da temin edilmektedir.

Doğal ürünler karşı monoklonal antikorların üretimi

BSelex yöntemi tanımlamak ve insan periferik kan mononükleer hücrelerden bireysel antijen özgü antikorlar kurtarmak için tek hücreli PCR ve klonlama ile akış sitometri birleştirir.

Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

Burada periton, dalak ve kemik iliği dokularındaki murin immün B hücre bölmesinin akış sitometrisine göre heterojenliğinin basit bir analizinde açıklanmaktadır. Protokol diğer fare dokularına uyarlanabilir ve genişletilebilir.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Keşfedin, insan kanındaki B lenfositlerinden tamamen insan monoklonal antikor üretme yöntemini. Bu teknik, nadir antijen spesifik B hücrelerinin izolasyonunu ve immünoterapi uygulamaları için hassas hedeflemeyi mümkün kılar.

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Daha fazla video keşfet