TUNEL Testi
TUNEL testi en yaygın olarak, programlanmış hücre ölümünün bir şekli olan apoptoz geçiren hücreleri tespit etmek için kullanılır. Apoptoz, gelişim sırasında ve doku homeostazını korumak için önemli bir biyolojik süreçtir. TUNEL boyama, apoptotik hücrelerin görselleştirilmesine ve miktarının belirlenmesine izin verir. Bu, bilim adamlarının, apoptozun kanserde olduğu gibi inhibe edildiği veya nörodejenerasyonda olduğu gibi arttırıldığı bozukluklar için yeni tedavilerin etkinliğini test etmelerine yardımcı olur.
Bu video, TUNEL testinin apoptoz geçiren hücreleri etiketlemek için nasıl kullanılabileceğini, bu yöntemi doku kesitlerinde gerçekleştirmek için adım adım bir protokol ve araştırmacıların hücre ölümü mekanizmalarını anlamak için bu tekniği nasıl uyguladıklarını açıklayacaktır.
TUNEL testinin protokolüne girmeden önce, bu tekniğin arkasındaki ilkeleri tartışalım.
Apoptozun birçok ayırt edici özelliğinden biri DNA parçalanmasıdır. DNA parçalanması nasıl oluşur? Apoptoz, sitozolde bulunan kaspaz adı verilen enzimler tarafından gerçekleştirilir. Birincil rolleri, hücreyi parçalamak için proteinleri parçalamaktır. Ek olarak, kaspazlar, kaspaz ile aktive olan DNaz veya CAD adı verilen bir enzimi, inhibitörü olan ICAD'den ayırarak aktive eder. Aktive edilmiş CAD, çekirdeğe giden ve kromozomal DNA'yı parçalayan bir endonükleazdır.
DNA'nın bölünmesi, nihayetinde çentikli uçları olan DNA parçalarının birikmesine neden olur ve TUNEL tahlili, parçalanmış DNA'nın bu çentikli uçlarını floresan olarak etiketleyerek bilim adamlarının apoptozu tespit etmesine olanak tanır. Ama bu nasıl oluyor? Bunun için TUNEL reaksiyonunu anlamanız gerekir. TUNEL, terminal deoksinükleotidil transferaz aracılı dUTP nick-end etiketleme anlamına gelir. İki ana TUNEL reaktifi, tespit kolaylığı için floresan olarak etiketlenebilen terminal deoksinükleotidil transferaz veya TdT ve deoksiüridin trifosfat veya dUTP'dir.
TUNEL reaksiyonunu anlamak için, DNA parçaları ile apoptotik hücrelere geri dönelim. Bu çentikli parçalar serbest 3' hidroksil gruplarına sahiptir. TUNEL reaktiflerini apoptotik hücreler içeren bir numuneye eklediğinizde, floresan etiketli dUTP'ler, katalizör enzimi TdT'nin yardımıyla bu 3' hidroksil gruplarına bağlanır. Bu prosedür kullanılarak boyanan hücrelere TUNEL pozitif hücreler denir ve bunlar daha sonra floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir.
Artık TUNEL testinin arkasındaki temel ilkeleri ve kavramları anladığınıza göre, bu tekniği doku kesitlerinde gerçekleştirmek için genel bir protokol hazırlayalım. TUNEL testinin ana adımları, ilgilenilen dokunun sabitlenmesini, dokunun geçirgenleşmesini, TUNEL reaktiflerinin eklenmesini, TUNEL reaksiyonunun durdurulmasını ve son olarak analizi içerir.
İlk olarak, biyolojik yapıları korumak için ilgilenilen doku sabitlenmelidir. Fiksasyon, hücreler içindeki proteinleri çapraz bağlayarak çalışır. TUNEL testi için dokular, 4 ° C'de 4-24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içeren bir çözeltiye eklenerek sabitlenebilir. Fiksasyondan sonra, dokuyu 10 μm veya daha az ince dilimler halinde kriyoseksiyon yapın.
Bir sonraki adım, TdT enzimi gibi reaktiflerin hücre çekirdeğine nüfuz etmesine izin veren geçirgenliktir. Doku kesitlerinin geçirgenliği, dokunun 37 ° C'de 5-15 dakika boyunca proteinaz K çözeltisine eklenmesiyle gerçekleştirilebilir. Doku bölümlerini, oda sıcaklığında 15-30 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde fosfat tamponlu salin ile durulayın.
Geçirgenleştirmeyi takiben, TdT enzimi ve floresan etiketli dUTP'ler, TUNEL reaksiyonu için bir kofaktör görevi gören kobalt içeren bir etiketleme tamponu ile birlikte doku bölümlerine eklenir. Birlikte, TUNEL reaksiyon karışımı ve doku bölümü 37 ° C'de 1-3 saat inkübe edilir ve floresanın solmasını önlemek için ışıktan korunur.
İnkübasyonu takiben, TUNEL reaksiyonunu durdurmak için doku bölümüne durdurma tamponu eklenir ve kısa bir inkübasyondan sonra bölümler fosfat tamponlu salin ile yıkanır. Son olarak, floresan etiketli dUTP kullanılarak boyanan doku kesitleri, floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir ve belirli bir doku içindeki TUNEL pozitif hücrelerin lokalizasyonu için değerlendirilir. Hücre ölümü, belirli bir doku bölümündeki TUNEL pozitif hücrelerin yüzdesini sayarak basitçe ölçebilir.
Artık apoptotik hücreleri tespit etmek için TUNEL testinin nasıl yapıldığını gördüğünüze göre, bu testin hücre biyologları tarafından sorulan soruları ele almak için nasıl kullanılabileceğini tartışalım.
Hücre ölümü, doku ve yapıların şekillendirilmesi ve gereksiz hücrelerin ortadan kaldırılması için gelişimin normal bir parçası olarak gerçekleşir. Bu nedenle, bu fenomenle ilgilenen bilim adamları, farklı maddelere doğum öncesi maruz kalmanın gelişim sırasında apoptoz üzerindeki etkisini inceler. Burada bilim adamları, doğum öncesi alkole maruz kalmanın beyin gelişimi üzerindeki etkisini incelemekle ilgilendiler. Fetal beyinler üzerinde gerçekleştirilen TUNEL boyamanın sonuçları, kontrol hayvanlarına kıyasla doğum öncesi alkole maruz kalan dokularda artmış apoptoz ortaya çıkardı.
Bilim adamları ayrıca bakteriyel enfeksiyona yanıt olarak apoptozu araştırmak için TUNEL testini kullanırlar. Bu deneyde bilim adamları, farelere akciğer iltihabına neden olan Pseudomonas aeruginosa enjekte ederek bir pnömoni modeli geliştirdiler. Daha sonra akciğer dokusu çıkarıldı ve bakteriyel enfeksiyona yanıt olarak apoptozu incelemek için TUNEL boyaması yapıldı. Sonuçlar, bakterilere maruz kalan farelerde apoptotik hücre ölümünün, kontrol hayvanlarına kıyasla arttığını göstermektedir.
Son olarak, ilaçlara tümör yanıtını belirlemek için insan tümör örneklerinde TUNEL boyama kullanılabilir. Bu örnekte, tümör örnekleri insan hastalardan toplandı ve ex vivo olarak kültürlendi. Daha sonra, klinik öncesi ilaçlarla tedavi edildiler ve TUNEL testi kullanılarak bir yanıt için değerlendirildiler. Elde edilen veriler, ısı şoku proteini 90'ı inhibe eden bir ilaçla yapılan tedavinin tümör dokusunda apoptozu önemli ölçüde artırdığını göstermektedir.
JoVE'nin apoptoz geçiren hücreleri tespit etmek için TUNEL testini kullanma hakkındaki videosunu izlediniz. Bu video, TUNEL boyamanın arkasındaki ilkeleri ve doku kesitlerinde TUNEL testini gerçekleştirmek için adım adım bir protokolü gözden geçirdi. Ayrıca, gelişim ve hastalık sırasında programlanmış hücre ölümünü anlamak için bu yöntemin nasıl uygulanabileceğini de gözden geçirdik. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Apoptozun ayırt edici özelliklerinden biri, nükleazlar tarafından nükleer DNA parçalanmasıdır. Bu enzimler, hücre ölüm programını yürüten protein aile…
TUNEL testi en yaygın olarak, programlanmış hücre ölümünün bir şekli olan apoptoz geçiren hücreleri tespit etmek için kullanılır. Apoptoz, gelişim sırasında ve doku homeostazını korumak için önemli bir biyolojik süreçtir. TUNEL boyama, apoptotik hücrelerin görselleştirilmesine ve miktarının belirlenmesine izin verir. Bu, bilim adamlarının, apoptozun kanserde olduğu gibi inhibe edildiği veya nörodejenerasyonda olduğu gibi arttırıldığı bozukluklar için yeni tedavilerin etkinliğini test etmelerine yardımcı olur.
Bu video, TUNEL testinin apoptoz geçiren hücreleri etiketlemek için nasıl kullanılabileceğini, bu yöntemi doku kesitlerinde gerçekleştirmek için adım adım bir protokol ve araştırmacıların hücre ölümü mekanizmalarını anlamak için bu tekniği nasıl uyguladıklarını açıklayacaktır.
TUNEL testinin protokolüne girmeden önce, bu tekniğin arkasındaki ilkeleri tartışalım.
Apoptozun birçok ayırt edici özelliğinden biri DNA parçalanmasıdır. DNA parçalanması nasıl oluşur? Apoptoz, sitozolde bulunan kaspaz adı verilen enzimler tarafından gerçekleştirilir. Birincil rolleri, hücreyi parçalamak için proteinleri parçalamaktır. Ek olarak, kaspazlar, kaspaz ile aktive olan DNaz veya CAD adı verilen bir enzimi, inhibitörü olan ICAD'den ayırarak aktive eder. Aktive edilmiş CAD, çekirdeğe giden ve kromozomal DNA'yı parçalayan bir endonükleazdır.
DNA'nın bölünmesi, nihayetinde çentikli uçları olan DNA parçalarının birikmesine neden olur ve TUNEL tahlili, parçalanmış DNA'nın bu çentikli uçlarını floresan olarak etiketleyerek bilim adamlarının apoptozu tespit etmesine olanak tanır. Ama bu nasıl oluyor? Bunun için TUNEL reaksiyonunu anlamanız gerekir. TUNEL, terminal deoksinükleotidil transferaz aracılı dUTP nick-end etiketleme anlamına gelir. İki ana TUNEL reaktifi, tespit kolaylığı için floresan olarak etiketlenebilen terminal deoksinükleotidil transferaz veya TdT ve deoksiüridin trifosfat veya dUTP'dir.
TUNEL reaksiyonunu anlamak için, DNA parçaları ile apoptotik hücrelere geri dönelim. Bu çentikli parçalar serbest 3' hidroksil gruplarına sahiptir. TUNEL reaktiflerini apoptotik hücreler içeren bir numuneye eklediğinizde, floresan etiketli dUTP'ler, katalizör enzimi TdT'nin yardımıyla bu 3' hidroksil gruplarına bağlanır. Bu prosedür kullanılarak boyanan hücrelere TUNEL pozitif hücreler denir ve bunlar daha sonra floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir.
Artık TUNEL testinin arkasındaki temel ilkeleri ve kavramları anladığınıza göre, bu tekniği doku kesitlerinde gerçekleştirmek için genel bir protokol hazırlayalım. TUNEL testinin ana adımları, ilgilenilen dokunun sabitlenmesini, dokunun geçirgenleşmesini, TUNEL reaktiflerinin eklenmesini, TUNEL reaksiyonunun durdurulmasını ve son olarak analizi içerir.
İlk olarak, biyolojik yapıları korumak için ilgilenilen doku sabitlenmelidir. Fiksasyon, hücreler içindeki proteinleri çapraz bağlayarak çalışır. TUNEL testi için dokular, 4 ° C'de 4-24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içeren bir çözeltiye eklenerek sabitlenebilir. Fiksasyondan sonra, dokuyu 10 μm veya daha az ince dilimler halinde kriyoseksiyon yapın.
Bir sonraki adım, TdT enzimi gibi reaktiflerin hücre çekirdeğine nüfuz etmesine izin veren geçirgenliktir. Doku kesitlerinin geçirgenliği, dokunun 37 ° C'de 5-15 dakika boyunca proteinaz K çözeltisine eklenmesiyle gerçekleştirilebilir. Doku bölümlerini, oda sıcaklığında 15-30 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde fosfat tamponlu salin ile durulayın.
Geçirgenleştirmeyi takiben, TdT enzimi ve floresan etiketli dUTP'ler, TUNEL reaksiyonu için bir kofaktör görevi gören kobalt içeren bir etiketleme tamponu ile birlikte doku bölümlerine eklenir. Birlikte, TUNEL reaksiyon karışımı ve doku bölümü 37 ° C'de 1-3 saat inkübe edilir ve floresanın solmasını önlemek için ışıktan korunur.
İnkübasyonu takiben, TUNEL reaksiyonunu durdurmak için doku bölümüne durdurma tamponu eklenir ve kısa bir inkübasyondan sonra bölümler fosfat tamponlu salin ile yıkanır. Son olarak, floresan etiketli dUTP kullanılarak boyanan doku kesitleri, floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir ve belirli bir doku içindeki TUNEL pozitif hücrelerin lokalizasyonu için değerlendirilir. Hücre ölümü, belirli bir doku bölümündeki TUNEL pozitif hücrelerin yüzdesini sayarak basitçe ölçebilir.
Artık apoptotik hücreleri tespit etmek için TUNEL testinin nasıl yapıldığını gördüğünüze göre, bu testin hücre biyologları tarafından sorulan soruları ele almak için nasıl kullanılabileceğini tartışalım.
Hücre ölümü, doku ve yapıların şekillendirilmesi ve gereksiz hücrelerin ortadan kaldırılması için gelişimin normal bir parçası olarak gerçekleşir. Bu nedenle, bu fenomenle ilgilenen bilim adamları, farklı maddelere doğum öncesi maruz kalmanın gelişim sırasında apoptoz üzerindeki etkisini inceler. Burada bilim adamları, doğum öncesi alkole maruz kalmanın beyin gelişimi üzerindeki etkisini incelemekle ilgilendiler. Fetal beyinler üzerinde gerçekleştirilen TUNEL boyamanın sonuçları, kontrol hayvanlarına kıyasla doğum öncesi alkole maruz kalan dokularda artmış apoptoz ortaya çıkardı.
Bilim adamları ayrıca bakteriyel enfeksiyona yanıt olarak apoptozu araştırmak için TUNEL testini kullanırlar. Bu deneyde bilim adamları, farelere akciğer iltihabına neden olan Pseudomonas aeruginosa enjekte ederek bir pnömoni modeli geliştirdiler. Daha sonra akciğer dokusu çıkarıldı ve bakteriyel enfeksiyona yanıt olarak apoptozu incelemek için TUNEL boyaması yapıldı. Sonuçlar, bakterilere maruz kalan farelerde apoptotik hücre ölümünün, kontrol hayvanlarına kıyasla arttığını göstermektedir.
Son olarak, ilaçlara tümör yanıtını belirlemek için insan tümör örneklerinde TUNEL boyama kullanılabilir. Bu örnekte, tümör örnekleri insan hastalardan toplandı ve ex vivo olarak kültürlendi. Daha sonra, klinik öncesi ilaçlarla tedavi edildiler ve TUNEL testi kullanılarak bir yanıt için değerlendirildiler. Elde edilen veriler, ısı şoku proteini 90'ı inhibe eden bir ilaçla yapılan tedavinin tümör dokusunda apoptozu önemli ölçüde artırdığını göstermektedir.
JoVE'nin apoptoz geçiren hücreleri tespit etmek için TUNEL testini kullanma hakkındaki videosunu izlediniz. Bu video, TUNEL boyamanın arkasındaki ilkeleri ve doku kesitlerinde TUNEL testini gerçekleştirmek için adım adım bir protokolü gözden geçirdi. Ayrıca, gelişim ve hastalık sırasında programlanmış hücre ölümünü anlamak için bu yöntemin nasıl uygulanabileceğini de gözden geçirdik. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
TUNEL testi en yaygın olarak, programlanmış hücre ölümünün bir şekli olan apoptoz geçiren hücreleri tespit etmek için kullanılır. Apoptoz, gelişim sırasında ve doku homeostazını korumak için önemli bir biyolojik süreçtir. TUNEL boyama, apoptotik hücrelerin görselleştirilmesine ve miktarının belirlenmesine izin verir. Bu, bilim adamlarının, apoptozun kanserde olduğu gibi inhibe edildiği veya nörodejenerasyonda olduğu gibi arttırıldığı bozukluklar için yeni tedavilerin etkinliğini test etmelerine yardımcı olur.
Bu video, TUNEL testinin apoptoz geçiren hücreleri etiketlemek için nasıl kullanılabileceğini, bu yöntemi doku kesitlerinde gerçekleştirmek için adım adım bir protokol ve araştırmacıların hücre ölümü mekanizmalarını anlamak için bu tekniği nasıl uyguladıklarını açıklayacaktır.
TUNEL testinin protokolüne girmeden önce, bu tekniğin arkasındaki ilkeleri tartışalım.
Apoptozun birçok ayırt edici özelliğinden biri DNA parçalanmasıdır. DNA parçalanması nasıl oluşur? Apoptoz, sitozolde bulunan kaspaz adı verilen enzimler tarafından gerçekleştirilir. Birincil rolleri, hücreyi parçalamak için proteinleri parçalamaktır. Ek olarak, kaspazlar, kaspaz ile aktive olan DNaz veya CAD adı verilen bir enzimi, inhibitörü olan ICAD'den ayırarak aktive eder. Aktive edilmiş CAD, çekirdeğe giden ve kromozomal DNA'yı parçalayan bir endonükleazdır.
DNA'nın bölünmesi, nihayetinde çentikli uçları olan DNA parçalarının birikmesine neden olur ve TUNEL tahlili, parçalanmış DNA'nın bu çentikli uçlarını floresan olarak etiketleyerek bilim adamlarının apoptozu tespit etmesine olanak tanır. Ama bu nasıl oluyor? Bunun için TUNEL reaksiyonunu anlamanız gerekir. TUNEL, terminal deoksinükleotidil transferaz aracılı dUTP nick-end etiketleme anlamına gelir. İki ana TUNEL reaktifi, tespit kolaylığı için floresan olarak etiketlenebilen terminal deoksinükleotidil transferaz veya TdT ve deoksiüridin trifosfat veya dUTP'dir.
TUNEL reaksiyonunu anlamak için, DNA parçaları ile apoptotik hücrelere geri dönelim. Bu çentikli parçalar serbest 3' hidroksil gruplarına sahiptir. TUNEL reaktiflerini apoptotik hücreler içeren bir numuneye eklediğinizde, floresan etiketli dUTP'ler, katalizör enzimi TdT'nin yardımıyla bu 3' hidroksil gruplarına bağlanır. Bu prosedür kullanılarak boyanan hücrelere TUNEL pozitif hücreler denir ve bunlar daha sonra floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir.
Artık TUNEL testinin arkasındaki temel ilkeleri ve kavramları anladığınıza göre, bu tekniği doku kesitlerinde gerçekleştirmek için genel bir protokol hazırlayalım. TUNEL testinin ana adımları, ilgilenilen dokunun sabitlenmesini, dokunun geçirgenleşmesini, TUNEL reaktiflerinin eklenmesini, TUNEL reaksiyonunun durdurulmasını ve son olarak analizi içerir.
İlk olarak, biyolojik yapıları korumak için ilgilenilen doku sabitlenmelidir. Fiksasyon, hücreler içindeki proteinleri çapraz bağlayarak çalışır. TUNEL testi için dokular, 4 ° C'de 4-24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içeren bir çözeltiye eklenerek sabitlenebilir. Fiksasyondan sonra, dokuyu 10 μm veya daha az ince dilimler halinde kriyoseksiyon yapın.
Bir sonraki adım, TdT enzimi gibi reaktiflerin hücre çekirdeğine nüfuz etmesine izin veren geçirgenliktir. Doku kesitlerinin geçirgenliği, dokunun 37 ° C'de 5-15 dakika boyunca proteinaz K çözeltisine eklenmesiyle gerçekleştirilebilir. Doku bölümlerini, oda sıcaklığında 15-30 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde fosfat tamponlu salin ile durulayın.
Geçirgenleştirmeyi takiben, TdT enzimi ve floresan etiketli dUTP'ler, TUNEL reaksiyonu için bir kofaktör görevi gören kobalt içeren bir etiketleme tamponu ile birlikte doku bölümlerine eklenir. Birlikte, TUNEL reaksiyon karışımı ve doku bölümü 37 ° C'de 1-3 saat inkübe edilir ve floresanın solmasını önlemek için ışıktan korunur.
İnkübasyonu takiben, TUNEL reaksiyonunu durdurmak için doku bölümüne durdurma tamponu eklenir ve kısa bir inkübasyondan sonra bölümler fosfat tamponlu salin ile yıkanır. Son olarak, floresan etiketli dUTP kullanılarak boyanan doku kesitleri, floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir ve belirli bir doku içindeki TUNEL pozitif hücrelerin lokalizasyonu için değerlendirilir. Hücre ölümü, belirli bir doku bölümündeki TUNEL pozitif hücrelerin yüzdesini sayarak basitçe ölçebilir.
Artık apoptotik hücreleri tespit etmek için TUNEL testinin nasıl yapıldığını gördüğünüze göre, bu testin hücre biyologları tarafından sorulan soruları ele almak için nasıl kullanılabileceğini tartışalım.
Hücre ölümü, doku ve yapıların şekillendirilmesi ve gereksiz hücrelerin ortadan kaldırılması için gelişimin normal bir parçası olarak gerçekleşir. Bu nedenle, bu fenomenle ilgilenen bilim adamları, farklı maddelere doğum öncesi maruz kalmanın gelişim sırasında apoptoz üzerindeki etkisini inceler. Burada bilim adamları, doğum öncesi alkole maruz kalmanın beyin gelişimi üzerindeki etkisini incelemekle ilgilendiler. Fetal beyinler üzerinde gerçekleştirilen TUNEL boyamanın sonuçları, kontrol hayvanlarına kıyasla doğum öncesi alkole maruz kalan dokularda artmış apoptoz ortaya çıkardı.
Bilim adamları ayrıca bakteriyel enfeksiyona yanıt olarak apoptozu araştırmak için TUNEL testini kullanırlar. Bu deneyde bilim adamları, farelere akciğer iltihabına neden olan Pseudomonas aeruginosa enjekte ederek bir pnömoni modeli geliştirdiler. Daha sonra akciğer dokusu çıkarıldı ve bakteriyel enfeksiyona yanıt olarak apoptozu incelemek için TUNEL boyaması yapıldı. Sonuçlar, bakterilere maruz kalan farelerde apoptotik hücre ölümünün, kontrol hayvanlarına kıyasla arttığını göstermektedir.
Son olarak, ilaçlara tümör yanıtını belirlemek için insan tümör örneklerinde TUNEL boyama kullanılabilir. Bu örnekte, tümör örnekleri insan hastalardan toplandı ve ex vivo olarak kültürlendi. Daha sonra, klinik öncesi ilaçlarla tedavi edildiler ve TUNEL testi kullanılarak bir yanıt için değerlendirildiler. Elde edilen veriler, ısı şoku proteini 90'ı inhibe eden bir ilaçla yapılan tedavinin tümör dokusunda apoptozu önemli ölçüde artırdığını göstermektedir.
JoVE'nin apoptoz geçiren hücreleri tespit etmek için TUNEL testini kullanma hakkındaki videosunu izlediniz. Bu video, TUNEL boyamanın arkasındaki ilkeleri ve doku kesitlerinde TUNEL testini gerçekleştirmek için adım adım bir protokolü gözden geçirdi. Ayrıca, gelişim ve hastalık sırasında programlanmış hücre ölümünü anlamak için bu yöntemin nasıl uygulanabileceğini de gözden geçirdik. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is DNA fragmentation and how does it occur during apoptosis?
DNA fragmentation is a hallmark of apoptosis where chromosomal DNA is cleaved into fragments with nicked ends. Caspases, enzymes in the cytosol, activate caspase-activated DNase (CAD) by removing its inhibitor. Activated CAD travels to the nucleus and cleaves chromosomal DNA, creating fragments that accumulate and signal cell death.
Q2: How does the TUNEL assay detect apoptotic cells?
The TUNEL assay fluorescently labels nicked DNA ends in apoptotic cells. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) catalyzes the attachment of fluorescently labeled deoxyuridine triphosphate (dUTP) nucleotides to free 3' hydroxyl groups on fragmented DNA. This creates TUNEL positive cells visible under fluorescence microscopy.
Q3: What are the main steps in performing a TUNEL assay on tissue sections?
The TUNEL assay protocol includes tissue fixation using 4% paraformaldehyde, cryosectioning into 10 µm slices, permeabilization with proteinase K, adding TdT enzyme and labeled dUTPs, incubating for 1-3 hours at 37°C, stopping the reaction with stop buffer, and visualizing with fluorescence microscopy.
Q4: Why is tissue permeabilization necessary before adding TUNEL reagents?
Permeabilization allows TUNEL reagents, particularly the TdT enzyme, to penetrate the cell nucleus and access fragmented DNA. Proteinase K treatment for 5-15 minutes at 37°C creates pores in cell membranes, enabling the enzyme to reach its substrate inside the nucleus.
Q5: How can researchers use TUNEL staining to study apoptosis in disease?
Researchers apply TUNEL staining to examine apoptosis in various disease contexts. For example, scientists use it to assess tumor responsiveness to drugs by treating human tumor samples with experimental compounds and measuring increased apoptosis. TUNEL staining quantifies cell death by counting the percentage of TUNEL positive cells in tissue sections.
Q6: What role do caspases play in initiating DNA fragmentation?
Caspases are proteolytic enzymes present in the cytosol that execute apoptosis by cleaving cellular proteins. They activate caspase-activated DNase (CAD) by detaching it from its inhibitor ICAD. Once activated, CAD enters the nucleus and cleaves chromosomal DNA, producing the fragmented DNA that TUNEL assays detect.
Q7: What does TUNEL positive staining indicate about cells in a tissue sample?
TUNEL positive cells are undergoing apoptosis and contain fragmented DNA with nicked ends labeled by fluorescent dUTP. These cells appear fluorescent under microscopy and indicate programmed cell death. Counting TUNEL positive cells provides a quantitative measure of apoptosis occurring in a tissue section.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:59
Principles of the TUNEL Assay
3:06
Generalized TUNEL Assay Protocol in Tissue Sections
5:34
Applications
7:35
Summary