Name: Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Öğrenin, fare meme bezlerinin bütün halde izole edilmesi ve hücre dışı matriks protein ekspresyonu ile duktal morfolojinin analizi için immunohistokimyasal yöntemleri. Bu teknik, gelişim biyolojisi ve tümör araştırmalarında doku mimarisini incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Nisan Wiles ve Dr. Roger Broderson sırasıyla hayvan nekropsi ve bezi yalıtım, hakkında yardım almak için kabul etmek istiyorum. Bu iş için fon Philadelphia üniversite osteopatik tıp merkezleri tarafından kronik bozuklukları, yaşlanma için destek verdi.

hayvan bireylerde bu iletişim kuralı ile ilgili yordamları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Philadelphia Osteopatik Tıp Fakültesi tarafından onaylanmış ve tüm teknikleri sıkı altında yapılmıştır Etik kurallar.
 1. örnek satın alma ve işleme <ol><li>seçin uygun hayvan konu ve CO 2 odası yerine. Bu deneme için 8-10 hafta kullanan eski dişi nulliparous B6. CG-Cav1tmMIs/J ve C57BI/6J.</li>
	<li>Gaz akışı açmak % 30-40. Bir kez hayvan yaklaşık 2 dakika sonra gözle görülür bilinci yerinde değil, ek bir 5 dakika süreyle tam basınç için gaz vanası açık 
	Not: hayvan ölüm (örneğin göğüs hareketi) CO 2 teslim bırakma sonra bir 10 dakika boyunca nefes görünür işaretleri gözlemleyerek onaylayın. Hayvan hala hayatta olsa, geri CO 2 odasında yerleştirilebilir. Servikal yerinden çıkması da kan diseksiyon sonuçları çalışmasına mani meme dokuları çevresinde biriktikçe tavsiye edilmez, ancak kullanılabilir.</li>
	<li>Kurban, ardından pin karkas sırtüstü pozisyonda ve % 70 etanol ile emdirmek.</li>
	<li>Yukarıda forseps kullanarak pubis pelt pinch ve küçük Cerrahi makas ile nick. Makas, döner kesme taşıma ventral orta çizgi boyunca pelt Kaudal kafatası için.</li>
	<li>Daha büyük makas veya bir hemostat ile açık açık subkutan fasya bilateral, karın zarını delmek değil dikkatli kullanarak incelemek. Yatay kenar boşlukları boyunca belgili tanımlık kesme distal her iki uçta da kesti.</li>
	<li>PIN pelt Kapakları açın ve tekrar % 70 etanol ile sprey. 
	Not: her ne kadar % 70 etanol bezi ve çevresindeki subkutan doku arasında daha iyi görsel ayrım açiktir, doku kullanımı Bu çözümün sonucu kurutma önlemek dikkatli olun. Kurutma önlemek için 4 dk aşmayacak şekilde bir zaman dilimi içinde bezi kaldırın. % 70 etanol için alternatif olarak, araştırmacı da doku kuruma önlemek için 1 x PBS gibi genel bir ayrı tutma tampon yerine kullanabilir.</li>
	<li>İlgi, meme dokuları bulma slayt boyunca meme bezi ve ilişkili Kutanöz yağ dermis ücretsiz kesme pelt flep içine #4 neşter blade. 
	Not: 3,5 x cerrahi mikro büyüteçler bezleri daha kolay görsel öğeyi yardımcı olabilir.</li>
	<li>Hemen daldırın konik tüp için 24-48 h % 10 tarafsız tampon formalin 10:1 çözüm-doku hacmi içeren yeni izole bezi 
	Not: paraformaldehyde, genomik çalışmalar ve ticari olarak mevcut RNA arabellekleri korunması için etanol gibi birçok alternatif Fiksajlar çalışma amacı bağlı olarak, kullanılabilir.</li>
	<li>Parafin katıştırma için kurumsal iletişim kuralları izleyin, bize örnek katıştırma, satıcıya işleme ve montaj Dilimleme/slayt. Bölüm 5 mikron, dokulara. 
	Not: aşırı yağ çevreleyen bezi nedeniyle 100-200 µm kesit ve boyama önce doku kaldırmayı düşünün.</li>
</ol> 2. Doku Staining <ol><li>ısı blokta lekeli için immünhistokimya <ol><li>yer slaytlar ayarla, parafin eritmek 1 h için 58 ˚C. 
		Dikkat: parafin balmumu erime slaytın dışına çalışmaya başlayabilir. Yakından izleyin veya yer silme ikinci tur balmumu yakalamak için slaytın altında. 
		Not: Bu adım gerekli değildir ve atlanabilir. Sonuçlar beklendiği gibi değilse, bu adımı geri ekleme sonuçları artırabilir.</li>
		<li>Incubate slaytları bir slayt içeren % 100 Ksilen 30 dk tam batma sağlanması için jar. Bir kez yineleyin. 
		Not: Bu noktada, doku bölümlerde yağ dokusu ve parafin serbest olduğundan emin olmak için görsel muayene yapılmalıdır. Ek yağ dokusu veya balmumu belirgin ise, slayt Ksilen içinde yeniden ve sular altında. Bu doku büzülme neden olabilir gibi eklenen Ksilen maruz en aza indirmek için dikkatli olun.</li>
		<li>% 100 etanol 10 dakika süreyle içeren bir slayt kavanoz rehydrate dokularda bir kez yineleyin.</li>
		<li>Hareket slaytlar % 95 etanol 10 dakika süreyle içeren bir slayt kavanoz için bir kez yineleyin.</li>
		<li>Slaytları bir slayt kavanoz içeren % 75 etanol 5 dakika süreyle hareket</li>
		<li>Slaytları bir slayt kavanoz içeren % 50 etanol 5 dakika süreyle hareket</li>
		<li>Kaynatın 10 mM sodyum sitrat çözüm (pH 6.0) sıcak bir tabak veya mikrodalga ve Coplin kavanoza dökün. 
		Uyarı: Dikkatli bir şekilde çözüm Isıtma sırasında izlemek ve üzerinde kaynatın önlemek için dikkat ediniz. Konteyner çok sıcak olacak. Yanık önlemek için koruma kullanın.</li>
		<li>Yavaş yavaş Coplin yer slaytlara jar, tam batma, sağlanması, epitopları almak 10 dk 100 ° C'de kuluçkaya. Kaldırmak ve dikkatle slaytlar kuru.</li>
		<li>Bir engel etrafında doku hidrofobik bir marker ile çizin. Yeterli endojen enzim engelleyici ekleyin (hidrojen peroksit ve sodyum azid, mevcut ticari olarak) ve doku kapağı için 10 dk. kuluçkaya</li>
		<li>10 dakika süreyle saline (PBS) Submerge slaytları 1 x fosfat tamponlu</li>
		<li>Eklemek yeterli % 10 eşek serum ve doku kapsayacak bir oksijen odası oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya 1 x PBS içinde. 
		Not: Deneme burada slaytları oksijen Odası 4 ° C'de gecede depolayarak duraklatılmış. Eşek serum en iyi boyama sonuç vermeye bulundu iken, araştırmacı sığır serum albumin (BSA), keçi serum veya en iyi sonuçları belirlemek için at serum gibi farklı sera sınamak isteyebilirsiniz. BSA kullanıyorsanız, araştırmacı bu taze kullanmadan önce hazırlamalıdır.</li>
		<li>Aşırı engelleyici slaytlardan dikkatle boşaltmak ve düzgün seyreltilmiş birincil antikor doğrudan slaytlara doku eşit olarak çözümde kaplıdır sağlanması % 1 serum eklemek. Oksijen odası oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya. 
		Not: Bu adımı uzun zaman süreleri için nemli Odası 4'te depolanmış devam ° C. bu adımda doğru negatif kontrol slaytlar (örneğin bir slayt ile bilinen antijen-negatif doku, vb hiçbir birincil antikor) eklemek emin olun.</li>
		<li>Dikkatle diH 2 O doku üzerinde yaklaşık 1 mL akan tarafından slaytlar yıkama ve 1 x PBS 5 dakika süreyle 1 değişiklik kuluçkaya</li>
		<li>Aşırı PBS dikkatle boşaltmak ve doku kapak ve 30 dk içinde oksijen odası için kuluçkaya için yeterli horseradish peroksidaz etiket ekleyin. 
		Not: Bu adımda, araştırmacı fluorescently konjuge ikincil antikorları kullanarak boyama floresan için devam etmek isteyebilirsiniz. Bu isterseniz, açıklanan sonraki adımları uygun şekilde değiştirilmesi.</li>
		<li>Dikkatle diH 2 O doku üzerinde yaklaşık 1 mL akan tarafından slaytlar yıkama ve 1 x PBS 5 dakika süreyle 1 değişiklik kuluçkaya</li>
		<li>Yapmak diaminobenzidine (DAB) Kromojen çözüm üretici önerilen oranı göre artı ve mix gönderen vortex. 
		Not: Birçok hazır kitleri piyasada bulunan bu protokol için kullanılan bir kenara.</li>
		<li>Decant fazla tampon slaytlardan ve 2-3 damla Kromojen leke (10-50 µL) doğrudan dokuların ekleyin ve nemli odasında 5 min için kuluçkaya. Dikkatle doku üzerinde slayt akan yaklaşık 1 mL diH 2 O tarafından yıkayın. 
		Dikkat: DAB-Kromojen çok zehirli. Tehlikeli atık içinde kapalı leke cilt ve toplamak akışı ile doğrudan temas önlemek.</li>
	</ol></li> <li>Hematoksilen ve Eozin (H &#38; E) <ol><li>son durulama Kromojen kuluçka sonra takip daldırın Harris Hematoksilen musluk suyu 1-2 dakika süreyle yavaşça altında 2-2,5 dk. durulama slaytlar için slaytlar 
		Not: su doku üzerine doğrudan jet önlemek için dikkat ediniz.</li>
		<li>Submerge farklılaşma çözüm (100 ml % 70 etanol hidroklorik asit 0.25 mL) 2-3 s için slaytlar. Slaytları musluk suyu yaklaşık 1-2 dakika süreyle yavaşça altında durulayın</li>
		<li>% 95 etanol için 30 60 s. durulama slaytlar için slaytlar mavi Agent (100 mL musluk suyundaki 9.4 için ayarlanır pH 4.5 mg kalsiyum karbonat) daldırın s.</li>
		<li>Alkollü Eozin Y 2-3 dakika süreyle Submerge slaytları</li>
		<li>% 95 etanol 1 dk. için 2 değişiklik dokusunda kurutmak.</li>
		<li>% 100 etanol 1 dk. değiştirmek Dehydrate doku 1</li>
		<li>Hav bırakmayan bir bezle dikkatlice kuru slaytlar. 1 damla uygulamak (yaklaşık 100-200 µL) sentetik, sulu olmayan, reçine tabanlı slayt ve coverslip uygulamak için ortam takma. 
		Not: farklı bir boyama yöntemi seçildi, farklı montaj medya gerekli olabilir. Örneğin, araştırmacı bir floresan Birleşik ikincil antikor seçerseniz, sulu bir Dağı daha ideal olurdu.</li>
		<li>Gecede oda sıcaklığında ayarlamak slayt izin.</li>
	</ol></li> <li>Picrosirius kırmızı (PSR) Staining <ol><li>lekeli ve immünhistokimya Protokolü (% 50 etanol emmek) adım 6 ile takip için slaytları seçin.</li>
		<li>PSR Submerge slaytları için 1 h. leke</li>
		<li>%0,5 Asetik asit 1-2 s, iki kez leke ayırt etmek için slaytları daldırın.</li>
		<li>% 95 etanol 1 dk. için 2 değişiklik dokularda kurutmak.</li>
		<li>Dehydrate dokularda % 100 etanol 1 dk. değiştirmek 1</li>
		<li>Temizleyin slaytlar kısa bir süre için % 100 Ksilen içinde hakkında batış tarafından 3-4 s.</li>
		<li>Hav bırakmayan bir bezle dikkatlice kuru slaytlar. 1 damla uygulamak (yaklaşık 100-200 µL) sentetik, sulu olmayan, reçine tabanlı slayt ve coverslip uygulamak için ortam takma.</li>
	</ol></li></ol> 3. Örnek analiz <ol><li>Duktal analizi <ol><li>seçin slaytlar lekeli α-SMA için. Kamera monte objektif ile donatılmış bir ışık mikroskop kullanarak toplamak temsilcisi imge vasıl 20 X büyütme.</li>
		<li>Kullanma ImageJ (NIH), ayırt etmek ve kanalları her görüntüde saymak. Bunlar el ile numaralandırılan veya bir sayısal puanı için bireysel kanalları devredebiliriz. Bir sayısal puan atamak için ImageJ açın ve eklentileri seçin. Analiz seçin ve açılır menüsünden hücre sayacı seçin. Başlat'ı tıklatın sonra tip kanalları etiketleme başlamak için 1 vurgulayın. Ne zaman tamamlanmak, duktal sayısı görüntülemek için sonuçları seçin. 
		Not: duktal ve değil vasküler yapılardır doğrulamak için dikkat ediniz.</li>
		<li>İçinde &#39; ölçüm ayarla &#39; seçenekleri, kontrol &#39; çevre &#39; ve &#39; alan &#34;.</li>
		<li>Bir serbest Çokgen aracını kullanarak myoepithelial yuvası (α-SMA leke tarafından destekli görünürlük), her kanal etrafında bir çizgi çizin. Seçin &#39; ölçü &#39; ve çevre ve alan kaydedebilirsiniz.</li>
		<li>Tekrar bir serbest Çokgen aracını kullanarak duktal epitel apikal tarafında bir satır Lümen içi içinde çiz. Seçin &#39; ölçü &#39; ve çevre ve alan kaydedebilirsiniz.</li>
		<li>Myoepithelial bölme luminal bölmesinin gelen çevre çevre duktal epitel çevresi elde etmek için çıkarma. Duktal epitel alanı elde etmek için myoepithelial bölme alan luminal bölme alan çıkarma.</li>
	</ol></li> <li>İmmünhistokimya analizi <ol><li>Upload aydınlık alan görüntüleri bir analitik yazılım, ImageJ veya FIJI Suite gibi. 
		Not: Bu protokol analiz ImageJ ve IHC Toolbox eklentisi kullanarak boyama için özet bilgiler.</li>
		<li>IHC araç kutusu eklenti menüsünden açın. İçinde &#34; Model Seç &#34; açar, uygun leke seçin açılan kutu (Yani H-DAB, PSR, vb). Seçin &#34; renk &#34; leke yalıtmak için seçeneği. Bu bir sonuç penceresi açılacaktır. 
		Not: Bu yöntem ilgi bir proteinin hücre dışı veya sitozolik alanlarda yer alan veya plazma zarı bağlı uygundur. Faiz protein nükleer ise, seçme &#34; çekirdeği &#34; olumlu lekeli çekirdekler için görüntü analiz etmek için eklenti isteyecektir.</li>
		Renk Seçici'yi slayt kullanmak uygun yalıtım olmadan arka plan içerme veya dışlama aşırı leke leke emin olmak için <li>. 
		Not: otomatik mod leke tespit edemiyor veya kabul edilebilir Albümdeki yol açmaz, bir kare bölgesi faiz (ROI) üzerinde tanımlanan bir bölge lekeli çizin. IHC Toolbox penceresi seçin &#34; tren &#34; uygun hedef eklentisine yönetecek.</li>
		<li>16-bit için resmi dönüştürün. Gidin görüntü &#8594; türü &#8594; 16 bit.</li>
		<li>Eşik görüntü. Gidin görüntü &#8594; ayarlamak &#8594; otomatik eşik.</li>
		<li>Görüntü ölçüm ölçek uzunluğu atama görüntüde bir hattı yatırım Getirisi ölçek çubuğu üzerinden doğrudan çizerek ayarlayın. Ölçek çubuğu ayarlamak için'gidin analiz &#8594; ölçeği ayarla. Piksel uzunluğu (örneğin 120 piksel / 50 µm) istenen birim sayısını girdi.</li>
		<li>Sonuç alan ölçmek ve gri değeri demek. Gidin analiz &#8594; ayarla ölçümleri ve ölçüm tıklatarak toplamak analiz &#8594; ölçü birimi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gao-Feng Xiong, R. X. <a target="_blank" href="http://jcmtjournal.com/article/view/1713">Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression.</a> J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).</li>
<li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+biology+and+implications+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), 38(2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11(2008).</li>
<li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix%3A+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).</li>
<li>Ioachim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+expression+of+extracellular+matrix+components+tenascin%2C+fibronectin%2C+collagen+type+IV+and+laminin+in+breast+cancer%3A+their+prognostic+value+and+role+in+tumour+invasion+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression.</a> Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).</li>
<li>Barkan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Wang, J. P., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+How+Its+Aberrant+Expression+in+Tumors+May+Improve+Therapeutic+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting.</a> J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).</li>
<li>Qian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+tumor%2Fstromal+caveolin-1+expression+in+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients.</a> Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).</li>
<li>Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+functional+significance+of+loss+of+caveolin-1+expression+in+breast+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts.</a> J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).</li>
<li>Witkiewicz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absence+of+stromal+caveolin-1+expression+predicts+early+tumor+recurrence+and+poor+clinical+outcome+in+human+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers.</a> Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).</li>
<li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammary gland development.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).</li>
<li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+reproductive+status%2Fstages+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).</li>
<li>Cannata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+circulating+IGF-I+promotes+mammary+gland+development+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation.</a> Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).</li>
<li>Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+caveolin-1+alters+extracellular+matrix+protein+expression+and+ductal+architecture+in+murine+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands.</a> PLoS One. 12 (2), 0172067(2017).</li>
<li>Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+expression+modulates+mammary+epithelial+cell+proliferation+during+acinar+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation.</a> Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).</li>
<li>Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+for+localized+drug+delivery+to+the+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Gazetede, olduğu gibi fare meme dokuları duktal morfoloji ve ECM ifade aşağı akım histolojik analizler için yalıtmak için bir teknik anlatmıştık. Duktal Morfoloji analizleri ile ilgili olarak, duktal mimarisi lekeli histolojik kesitler kapalı tabanlı hızlı incelenmesi bu yöntemi sağlar. Duktal analizleri diğer yöntemleri görselleştirme duktal ağacının etkinleştirmek için boya teknik olarak zor ve zaman alıcı olabilir yöntemleri enjeksiyonlari güveniyor.
Meme Kanserinde ECM anormal olduğu bildi...

Meme kanseri doku fibrozu1,2,3,4önemli bir derecesi ile karakterizedir. ECM anılacaktır, bu cep varlık derecelerde tüm dokularda bulunur ve öncelikle fibriler ve fibriler sigara collagens, elastin ve glikoproteinlerin yanı sıra çoğu çeşitli sinyal molekülleri karmaşık bir meshwork oluşur Bu matris münzevi. Homeostatik koşullar altında ifade ve ECM bozulma sıkı kontrol. 5 sırasında meme tumorigenesis, ECM ifade ve yıkımı dengesi bozulur. Bu nedenle, meme tümörleri bol ECM proteinler collagens, fibronektin ve tenascin-C diğerleri arasında gibi hızlı bildirilmiştir. 6 meme tümör ilerleme, metastaz ve terapi direnç1,3, tanıtmak için matris crosslinking artan şekillerinin yanı sıra bu proteinlerin anormal ifade belgelenmiş oldu 4,7,8,9.
ECM kompozisyon ve duktal Morfoloji değerlendirmek için olduğu gibi meme dokuları yalıtım gerçekleştirildi. Burada, caveolin-1 için kadın nulliparous fareler eksik kullanılan, agresif için bağlı bir integral membran protein meme tümör imza10,11,12ve kadın nulliparous B6 kontrol fareler. Histolojik işleme ve bu dokularda boyama duktal Morfoloji karakterizasyonu birlikte birkaç ECM proteinler tanımlaması izin.
Genel olarak, Bütün, olduğu gibi meme dokuları yalıtım araştırmacılar eksojen veya endojen faktörler cevaben meydana gelen doku çapında morfolojik veya hücresel değişiklikleri öğrenmek için fırsat verir. Dezavantaj-in teknik analizleri 2 Boyut (2D) doku bölümleri karşı karmaşık morfolojisi duktal ağacının daha kapsamlı bir resmi verim bir 3D perspektif ile ilişkilidir. Meme bezi gerçekleşecek hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimleri karmaşıklığı göz önüne alındığında, Bütün, bozulmamış bezlerinin yalıtım verimli duktal morfoloji ve protein ifade çeşitli bölgelerde meme antikorundan analiz etmek için avantajlıdır bezi.

<table><tbody><tr><td>Işık Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Kamera</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü Analiz Yazılımı</td><td>Olympus</td><td>cellSens Giriş yazılımı</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>3.5x-R Cerrahi Mikro Büyüteçler</td><td>Gül Mikro Çözeltileri</td><td></td><td>Araştırmacının tercihine göre büyütme</td></tr><tr><td>Mayo Makas</td><td>Medline</td><td>DYND04035</td><td></td></tr><tr><td>Boyama Rafı</td><td>Fisher Scientific</td><td>121</td><td></td></tr><tr><td>Boyama Kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>112</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Kavanozları</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Dokuya uygun boyut</td></tr><tr><td>IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+)</td><td>Dako</td><td>K400611-2</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Kırmızı Kit</td><td>Abcam</td><td>AB150681</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y, alkolik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoksilen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Serumu</td><td>EMD Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>%10 Nötr Tamponlu Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Ksilenler, Reaktif Sınıfı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr>Etanol, moleküler <td>biyoloji için uygun</td><td>200 kanıt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin, 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Sitrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Karbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202932</td><td></td></tr><tr><td>Kalıcı Montaj Ortamı</td><td>Dako</td><td>S1964</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt'in Montaj Ortamı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin antikoru</td><td>Abcam</td><td>AB23750</td><td></td></tr><tr><td>Tenascin-C antikoru</td><td>Abcam</td><td>AB108930</td><td></td></tr><tr><td>Alfa Düz Kas Aktin antikoru</td><td>Abcam</td><td>AB124964</td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision Çift Bağlantı Sistemi HRP</td><td>Dako</td><td>K4065</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

sağlam, bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi morfoloji analizi için

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

#4 karın meme dokuları kadın nulliparous fareler gelen ECM ifade ve duktal mimari değerlendirmek için hasat için bu yordamı amacı oldu. Burada, deri altında küçük bir cep Mayo makas, subkutan doku içinde bezlerinin ayrılması temel karın zarını izin kullanılarak oluşturulmuş. Görselleştirme bezlerinin 3.5 kullanımı ile destekli x-R cerrahi mikro büyüteçler. Pelt ters ve geri izin olduğu gibi meme yağ yastıkları tanımlaması tutturulmuş. Her #4 karın bezlerinin açık açık neşter bıçak yanal subkutan katman ve bezleri arasında kaydırarak disseke. Hemen hasat sonrası, bezleri % 10 tarafsız tampon formalin sonraki doku işleme için yerleştirildi. Eksizyon tüm bezinin avantajlı çünkü öncelikle duktal epitel hücreleri ve kısmi biyopsi cevapsız microenvironmental diğer hücresel nüfus arasındaki önemli doku çapında etkileşimler hariç riskini ortadan kaldırır. Bir metodoloji analizleri duktal morfogenez ve protein ifade bezinin ayrı yerlere sınırlayan sabit dokular seri bölümleri kullanımını dezavantajıdır. Bu nedenle, 3 boyutlu (3D) duktal mimarisi ve protein ifadesindeki değişiklikleri kolayca elde edilebilecek değil. Genel olarak, teknik gelişim duktal morfogenez veya meme kanseri gibi aşağı akım araştırmalar için bütün olduğu gibi fare meme dokuları gerektiren çalışmalar için geçerlidir.

Dişi fareler meme dokuları 5 çift var. Özellikle, servikal bezleri (1), iki çift göğüs bezlerinin (#2 ve #3), karın bezleri (#4) bir çift ve kasık bezleri (#5) (Resim 1A) 1 Çift bir çift vardır. Burada, kolayca tanımlanabilir oldukları gibi #4 bezleri izole. İkisi arasında ayrım zor olduğu gibi bazı durumlarda, #4 ve #5 bezleri birlikte izole edildi. Sağlam #4 karın yalıtmak için meme dokuları, pelt tutturulmuş ve dikkatli bir şekilde (<stron...

Burada, hücre dışı Matriks (ECM) ifade ve duktal Morfoloji araştırmak için meme dokuları bütün, olduğu gibi fare yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Fare #4 karın bezleri tarafsız tampon formalin içinde sabit kesitli ve ECM proteinler için immünhistokimya kullanarak lekeli 8-10 hafta eski kadın nulliparous fareler, elde.

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Bu tüm meme bezi toplama tekniğinin genel amacı, ex-vivo olarak sağlam bir bezden meme dokusunun histolojik sunumunun analizini kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, tümörlerde stromal dokunun nasıl yeniden şekillendiği veya anormal gen veya protein ekspresyonunun meme duktal mimarisini nasıl değiştirdiği gibi tümör biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacılara sağlıklı ve hastalıklı farelerin tüm meme bezlerinde protein ekspresyonunu ve duktal mimariyi karakterize etme ve ölçme yeteneği vermesidir.Bu tekniği gösteren, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Chris Thompson olacak. Metin protokolüne göre sekiz ila 10 haftalık dişi nullipar fareleri kurban ettikten sonra, karkası sırtüstü pozisyonda sabitleyin ve doyurmak için% 70 etanol kullanın. Postu kasıkların hemen üzerine sıkıştırmak için forseps kullanın ve küçük cerrahi makasla çentikleyin.Daha sonra, makası döndürerek, postu ventral orta hat boyunca kesin ve kaudali kraniyal hareket ettirin. Daha büyük bir makas veya hemostat ile, peritonu delmemeye dikkat ederek deri altı fasyayı iki taraflı olarak kör bir şekilde inceleyin. Kesiğin her iki distal ucundaki y

isolation-intact-whole-mouse-mammary-glands-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yöntem, farelerde meme bezi gelişimi ve işlevi incelemek ve değerlendirmek anlatılmaktadır. Eksize meme bezleri süt ejeksiyon bir oksitosin tabanlı miyoepitelyal hücre daralma tahlil kullanılarak değerlendirilmiştir ise bütün montaj kullanarak geliştirme derecesi değerlendirilir.

Fare Modeller Meme Bezi Geliştirme ve Fonksiyon Değerlendirme

Time-lapse görüntüleme özgü davranışsal parametreler ve farklı genetik lezyonlar arasında bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için meme kanseri riskinin genetik fare modelleri türetilmiştir birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılır.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Bu makalede açıklanan dolaylı immünfloresan protokol algılama ve fare meme bezinde proteinlerin yerelleştirme verir. Tam bir yöntem olup, meme bezi örnekleri hazırlamak için floresan mikroskobu ile görüntü, doku kesitlerinde immunhistokimya gerçekleştirmek için ve görüntüleri yeniden verilir.

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

Bu protokol, adherent / mezenkimal meme epitel hücrelerinden ekstraselüler veziküller (EV) / ekzozomların arıtılması, nicelendirilmesi ve karakterize edilmesine yönelik yöntemleri ve meme bezi oluşturma yeteneğini luminal meme epitel hücrelerine aktarmak için kullanmayı açıklamaktadır. Gövde benzeri meme epitel hücrelerinden türetilmiş EVs / eksozomlar, bu hücre özelliğini EV'leri / eksosomları emen hücrelere aktarabilir.

Membran Bazal Epitelyal Hücreler ile Membran Luminal Hücreler Arasındaki Meme Bezi Oluşturma Yeteneğinin Ekstraselüler Vesiküller / Ekzozomlar Yoluyla Transferi

Kemirgen içindeki meme bezi gelişimi tipik olarak tanımlayıcı değerlendirmeler kullanılarak veya temel fiziksel özellikleri ölçerek değerlendirilmiştir. Dallanma yoğunluğu, meme gelişiminin objektif olarak ölçülmesi güç bir göstergesidir. Bu protokol, meme bezi dallanma özelliklerinin niceliksel değerlendirmesi için güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır.

Sıçan Memesi Bezinde Dallanma Yoğunluğunun Nicelleştirilmesi Sholl Analiz Yöntemini Kullanarak Bütünüyle Tutturulur

Başlangıçta slaytlar üzerinde sabitlenmiş olan meme dokusunu histopatolojik değerlendirme için başarıyla çıkarmak, işlemek, kesmek ve lekelenmek için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, üreme ve gelişimsel test kılavuz çalışmalarında meme bezlerinin tümünün monte edilmesini ve değerlendirilmesini teşvik edebilir.

Lezyon Tanımlaması için Meme Bandı Bütün Dağılımları

Meme bezi, dış miyoepitelyal ve iç luminal epitel hücrelerinden oluşan çift katmanlı bir yapıdır. Sunulan diferansiyel trippsinizasyon kullanarak organoidler hazırlamak için bir protokoldür. Bu verimli yöntem araştırmacılar ayrı ayrı meme bezi formu ve fonksiyonu rollerini ile ilgili soruları keşfetmek için bu iki hücre türleri işlemek için izin verir.

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

Burada tarif edilen intravital görüntüleme yöntemi, 4D intravital görüntülerin derinlemesine analizi için etiketlenmemiş bir tümör mikroçevresini tümör, stromal ve vasküler kompartmanlara invaziv olmayan bir şekilde segmentlere ayırmak için metabolik ko-faktör NAD (P) H'den kollajen ikinci harmonik jenerasyonu ve endojen floresanı kullanır.

Meme Tümörü Mikroçevresinin İntravital Görüntülemesi için Etiketsiz Bir Segmentasyon Yaklaşımı

Mevcut protokol, lazer taramalı konfokal ve multifoton mikroskobu ile emziren fare meme bezinin intravital görüntülenmesi için kolay bir tekniği tanımlamaktadır.

Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

Bu protokol, diferansiyel santrifüjleme yoluyla primer normal ve tümör meme dokusundan epitel organoidleri üretmek için bir yaklaşımı tartışmaktadır. Ayrıca, gömülü organoidlerin immünofloresan görüntülenmesinin yanı sıra üç boyutlu kültürleme için talimatlar da dahil edilmiştir.

Normal ve tümörlü meme dokusundan fare ve insan epitel organoidlerinin passiz olmadan üretilmesi ve görüntülenmesi

Bu protokol, fare meme bezinde paralel in vivo gen nakavt ve aktivasyon çalışmalarını mümkün kılan ölçeklenebilir bir intraduktal CRISPR tarama yaklaşımını tanımlar.

Fare Meme Bezinde Gen Nakavt ve Aktivasyonun Paraleli In Vivo Taraması

Öğrenin, fare meme bezlerinin bütün halde izole edilmesi ve hücre dışı matriks protein ekspresyonu ile duktal morfolojinin analizi için immunohistokimyasal yöntemleri. Bu teknik, gelişim biyolojisi ve tümör araştırmalarında doku mimarisini incelemeyi kolaylaştırır.

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

Daha fazla video keşfet