Name: NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Öğrenin, kronik aktif Epstein-Barr virüsü hastalarından NK ve T hücre hatları elde etmek için basit ve verimli bir yöntemi. Bu teknik, az miktarda periferik kan ve düşük doz IL-2 kullanarak immünoloji araştırmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser anahtar projeleri, Çin Bilimler Akademisi (KFZD-Batı-205), stratejik biyolojik kaynakların teknoloji destek sistemi, Çin Bilimler Akademisi (CZBZX-1 ve ZSSB-004) ve hibe tarafından desteklenmiştir Ulusal Bilim Vakfı Çin () 81401640) ve Şangay Doğa Bilimleri Fonu (14ZR1434800).

Bu çalışmada genetik Enstitüsü ve gelişim biyolojisi, Çin Bilimler Akademisi Etik Kurulu tarafından kabul edildi ve protokol insan refahı için kurumsal kuralları izler.
Not: Bkz. şekil 1 iş akışı bir şematik için.
1. PBMC CAEBV hastaların izolasyonu
<ol><li>Tam kan CAEBV hastaların 2 mL gelen birincil PBMC degrade tarafından (örneğin, Ficoll-plak) arındırmak Santrifüjü üreticinin yönergeleri izleyin. Alternatif olarak, tezcan nitrojen RPMI 1640 orta ile gelen PBMC cryopreserved.</li>
	<li>Hücreleri leke için hücre sayaç plaka süspansiyon aktarıp hücre toplama ve canlılığı bir otomatik hücre sayacı ile ölçmek için 3 dakika bekleyin, trypan mavi, 2 µL (% 0,4) 18 µL hücre süspansiyon için ekleyin.</li>
	<li>2-3 × 106 hücre/mL tam RPMI 1640 kültür % 20 insan serumu (ısı) 56 ° C'de inaktive olur, 2 mM L-glutamin içeren orta ile desteklenmiş bir yoğunluğu, hücre süspansiyon hazırlamak ve antibiyotik (100 µg/mL streptomisin, 100 U/mL penisilin). Tohum PBMC süspansiyon 24-şey hücre kültür plakaları kuyuya başına 1 mL.</li>
	<li>150 U rhIL-2 de başına ekleyin.</li>
	<li>37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka kültür tabak yerleştirin</li>
	<li>Gün 2, (200 X büyütme); mikroskopla hücre morfolojisi gözlemlemek Ne zaman onlar are parlak ve yuvarlak iyi durumda hücrelerdir.</li>
</ol>2. hücre ve hücrelerin numaralandırma genişlemesi
<ol><li>Hücre morfolojisi (200 X büyütme) mikroskopla gözlemlemek ve orta değiştirmeden önce hücreleri numaralandırma tarafından hücre büyümesini durumunu izlemek: trypan mavi (% 0,4) 2 µL 18 µL hücre süspansiyon için ekleyin ve hücre toplama hesaplamak (1.2, bkz: Şekil 2).</li>
	<li>24-şey plaka ortamda 500 µL atmak ve 500 µL taze tam kültür orta ekleyin. 150U rhIL-2 de başına ekleyin.</li>
	<li>Orta haftada iki kez adım 2.2 olarak değiştirin.</li>
	<li>Hücre büyüme eğrisi (şekil 3) çizin.</li>
	<li>Geçerli hücre konsantrasyonu 5 × 106/mL aştığında, yeni kuyu, 1-2 × 106 hücre/mL her iyi bir konsantrasyon hücreleri bölün. Bu işlem 2-4 hafta sürer.</li>
</ol>3. hücre fenotipleme Akış Sitometresi tarafından
<ol><li>Hücreleri genişletildiğinde, 1 × 106 hücre hücre hatları fenotipleri belirlemek için toplamak. Santrifüj kapasitesi 240 x g oda sıcaklığında 5 min için hücreleri (NK/T hücrelerinin tüpün dibinde çökelti).</li>
	<li>Süpernatant atmak, yağış 7 mL PBS ekleyerek yıka. Santrifüj vasıl 240 x g oda sıcaklığında 5 min için. Bir kez yinelenir.</li>
	<li>200 µL insan serumu her tüpün ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
	<li>Senaryo Özeti 240 x g oda sıcaklığında 5 min için santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve 1 × 106/mL ile soğuk PBSA Web site (PBS+0.2%BSA), hücreleri yeniden askıya alma. Hücreleri her tüpün 2 × 105 hücreleri içeren 5 tüpler içine bölün.</li>
	<li>240 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj hücreleri Süpernatant atmak ve PBSA Web site arabellek veya 10 µL PE (veya PE-Cy7) içeren PBSA Web site içeren hücreleri yeniden askıya alma ve 10 µL FITC etiketli antikorlar hücre reseptörleri buz üzerinde T veya NK hücrelerin şekil 4tarafından belirtildiği şekilde leke. PBSA Web site arabellek ile askıya hücreler bir negatif kontrol kullanılır.</li>
	<li>20-30 dk içinde belgili tanımlık karanlık buzda antikor hücrelerle kuluçkaya.</li>
	<li>Hücreleri iki kez soğuk PBSA Web site ile yıkayın, 300 µL hücrelerle yeniden askıya soğuk PBSA Web site.</li>
	<li>Akış Sitometresi ile hücre fenotip analiz.<ol>
<li>"Çalışma oluşturmak" durumda Akış Sitometresi ayarlayın. Yan dağılım (SSC) karşı ileri dağılım (FSC) görüntüler bir nokta arsa ile deneysel şablonu ayarlayın.</li>
		<li>FSC ve SSC gerilim en iyi duruma getirmek için izotip kontrol tüp yük ve enkaz faiz hücre nüfusu ile engel olmadan ortadan kaldırmak için FSC eşik değerini en iyi duruma getirme. FSC, SSC, FITC, PE ve PE-Cy7 dışında tüm parametreleri silin.</li>
		<li>Tazminat her 2-renk analiz grubundaki izotip kontrol ve tek bir olumlu denetim kullanarak gerçekleştirin.</li>
		<li>Örnekleri yükleme ve HLA-DR VS CD19 oluşturduğunuzda, hücre farklı nüfus gösterilen CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 ve CD3 VS CD16 nokta çizer. Not: PBMC negatif/izotip kontrol ve tek olumlu denetimi kullanarak tazminat gerçekleştirmek için kullanılmıştır. 2-renk ayirt Akış Sitometresi ile düzenli olarak yüzey işaretlerinin ifade analiz etmek için kullanıldı. Aşağıdaki antikorlar bulunur: anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 Birleşik floresein isothiocyanate (FITC), anti-CD8, anti-CD56, phycoerythrin (PE) ile Birleşik CD3 ve anti-CD19 PE-Cy7 ile Birleşik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Genleşme ve dondurma NK/T hücreleri
<ol><li>Hücre fenotip analiz tamamlandığında orta değiştirin. Dikkatle yarısı süpernatant kaldırmak ve alt plaka hücreleri dokunmaktan kaçının. Taze kültür içeren hücre plakaları 300 U/mL rhIL-2 Orta aynı hacmi ekleyin.</li>
	<li>Orta yarısı değiştirmek (2.2) olarak her 3 gün kadar hücre kümeleri (Şekil 2) mikroskop altında açıkça görülebilir. Tipik olarak, bu işlem 2-3 hafta sürer.</li>
	<li>Hücreleri farklı wells aynı soydan karıştırdıktan sonra T25 kültür Şişeler için 24-şey plakaları aktarın. Görünüşe göre sarı orta hacmi kadar Çift kültür orta hacmi 10-15 mL için genişletir. RhIL-2 150 U/mL konsantrasyonu ile ekleyin.</li>
	<li>2-3 hafta sonra büyüyen, buz gibi önce Orta 24 h değiştirmek zaman hücre kütlesi çıplak gözle görülebilir. Hücre konsantrasyonu hücre sayacı ile ölçmek.</li>
	<li>Hücre süspansiyon için 240 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet 5-10 x 106 hücre/mL fetal sığır serum % 90 ve % 10 dimethylsulfoxide (DMSO) içeren dondurulmuş hisse senedi Çözümle yoğunluğu, yeniden askıya alma. -80 ° c min başına 1 ° C oranında donma ve ardından doğrudan sıvı azot aktarın.</li>
</ol>

<ol><li>Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus infection.</a> N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).</li>
<li>Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-associated+lymphoproliferative+disease+in+non-immunocompromised+hosts%3A+a+status+report+and+summary+of+an+international+meeting%2C+8-9+September+2008%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008.</a> Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).</li>
<li>Oshimi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+and+managing+natural+killer-cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies.</a> Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).</li>
<li>Kawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+allergy+and+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease.</a> Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).</li>
<li>Kimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%3A+is+this+an+infectious+disease%2C+lymphoproliferative+disorder%2C+or+immunodeficiency%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?</a> Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).</li>
<li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+virologic+characteristics+of+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 98 (2), 280-286 (2001).</li>
<li>Ohshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+categorization+of+pathological+states+of+EBV-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disorder+%28LPD%29+in+children+and+young+adults%3A+overlap+with+chronic+active+EBV+infection+and+infantile+fulminant+EBV+T-LPD%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD.</a> Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).</li>
<li>Okano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+and+problematic+standpoints+of+severe+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).</li>
<li>Straus, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronic+mononucleosis+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The chronic mononucleosis syndrome.</a> J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).</li>
<li>Jones, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+lymphomas+containing+Epstein-Barr+viral+DNA+in+patients+with+chronic+Epstein-Barr+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections.</a> N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).</li>
<li>Kikuta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+genome-positive+T+lymphocytes+in+a+boy+with+chronic+active+EBV+infection+associated+with+Kawasaki-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease.</a> Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).</li>
<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+natural+killer+%28NK%29-cell+and+gammadelta+T-cell+lines+established+from+primary+lesions+of+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas+associated+with+the+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus.</a> Blood. 97 (3), 708-713 (2001).</li>
<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+natural+killer-cell+clones+with+variable+proliferative+capacity+in+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).</li>
<li>Tabata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroa+vacciniforme-like+lymphomatoid+papulosis+in+a+Japanese+child%3A+a+new+subset%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset.</a> J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).</li>
<li>Tsuchiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+human+natural+killer-cell+line+%28NK-YS%29+established+from+natural+killer+cell+lymphoma%2Fleukemia+associated+with+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).</li>
<li>Tsuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-infected+natural+killer+%28NK%29+cell+proliferation+in+patients+with+severe+mosquito+allergy%3B+establishment+of+an+IL-2-dependent+NK-like+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line.</a> Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+cytological+and+cytogenetic+features+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-positive+natural+killer+%28NK%29+cells+and+cell+lines+derived+from+patients+with+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas%2C+chronic+active+EBV+infection+and+hydroa+vacciniforme-like+eruptions%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions.</a> Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).</li>
<li>Oyoshi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+expansion+of+Vgamma9-JgammaP%2FVdelta2-Jdelta3+gammadelta+T+cells+in+nasal+T-cell+lymphoma+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).</li>
<li>Imadome, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+xenograft+models+reveal+a+critical+role+of+CD4%2B+T+cells+in+the+proliferation+of+EBV-infected+T+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).</li>
<li>Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine+requirement+for+the+generation+of+natural+killer+cells+from+CD34%2B+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).</li>
<li>Spits, H., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Human+T+and+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cloning of Human T and Natural Killer Cells.</a> Methods. 9 (3), 416-421 (1996).</li>
<li>Liu, X., Xu, C., Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Red+Blood+Cell+Lysis+Method+for+the+Establishment+of+B+Lymphoblastoid+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Kawabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+flow+cytometric+in+situ+hybridization+assay+to+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer+cell+lymphoproliferative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases.</a> Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).</li>
</ol>

D.Z., X.Z. ve X.C. yardımcı mucitler üzerinde bekleyen patent başvuruları NK/T hücre satırları ve bu çalışmada kurulan hücre satırları oluşturmak için bu yöntemin olası kullanımlar kapsayan vardır. D.Z., X.Z. ve X.C. bu çalışmalarında rakip hiçbir mali çıkarlarının bildirin. Kalan yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bu protokol için tam kan CAEBV hastaların NK/T hücre satırlarından kurmak için yeni bir yöntem geliştirmiş. Yüksek başarı oranı ve iyi koşullarda hücre canlılık sergiler Ise mevcut yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntemin en büyük avantajı sadeliği ve kan, sadece küçük bir ses onun şartı var. Ayrıca, NK/T hücre hatları hücre tipleri gizlice peşin, enfekte belirlenmesi EBV daha fazla kan ve kültür önce zaman tüketmek belirlenmesi olmadan PBMC kültür tarafından kurulabilir. Alternatif olarak, hücre hatları için ana...

Epstein - Barr virüsü (EBV) her yerde birden bulunan ve sadece B hücreleri, ama aynı zamanda T ve doğal öldürücü (NK) hücreleri, EBV ilişkili NK/T lenfoproliferatif hastalıklar (LPD) ve lenfoma/lösemi, EBV ilişkili Hemofagositik gibi bir dizi neden bozar hücre lösemi1,2,3Lenfohistiyositozis, hydroa vacciniforme benzeri lenfoma, Ekstranodal NK/T hücreli lenfoma, burun türü ve saldırgan NK. Bunlar arasında özellikle Doğu Asya'da olay olduğu ve hangi şimdi EBV-enfekte T veya NK hücreleri4,5,6, klonal genişleme neden bir LPD olarak kabul edilir şiddetli kronik aktif EBV (SCAEBV), bir hastalıktır 7, ama belirgin immün yetmezlik olmadan mevcut Enfeksiyöz Mononükleoz (IM)-ısrarla veya yerleştirilmiştir ateş, hepatosplenomegali, lenfadenopati ve karaciğer fonksiyon bozukluğu gibi belirtiler yanı sıra yüksek EBV-DNA yüklemek gibi periferik kan8,9. CAEBV olan hastalarda bir kötü prognoz10,11ve onun Patogenez ve EBV rol belirsizdir. Bu nedenle, EBV ilişkili NK/T lenfoproliferatif hastalıklar elde edilen satırları hücre ve EBV mekanizmasının açıklığa kavuşturulması NK veya T hücre çoğalması ve ilişkisini indüklenen yüksek insidansı lösemi için lenfomalarin bazilarinin hücre modelleri çok yararlı veya Lenfoma.
Bugüne kadar birçok hücre satır farklı teknikler12,13,14,15,16ile kurulmuştur. Bir insan NK hücre kültürünü, NK-YS, NK hücre Lenfoma/lösemi, bir fare stromal hücre satırıyla besleyici olarak ve rhIL-2 mL15başına 20U bir konsantrasyon, huzurunda ortak kültürü çalışmalarının tarafından kurulmuştur. KAI3 oldu hasta şiddetli sivrisinek anti ile veya SCAEBV ile Otolog lymphoblastoid hücre kültürünü (LCL), kurulan başka bir NK hücre kültürünü B hücreleri EBV, besleyici hücreler ve rhIL-2 100U/mL16ek olarak değiştirdi. SNK6 ve SNT8 burun NK/T Hücre Lenfomasi hastalar tümör dokulardan yüksek doz rhIL-2 (700U/mL)12ekleyerek elde edilmiştir. Benzer tekniği ile SNK-1 T hücreleri kaldırıp 700U/mL rhIL-213,17ekleyerek PBMC kültürlü CAEBV hastalardan hücresiydi. SNT13 ve SNT15 CD4 + ve CD8 + hücreleri18çıkarma tarafından kurulmuştur. Şimdiye kadar diğer T hücre ve NK hücre hatları EBV-NK/T LPD hastaların tüm bu yöntemi19ile geliştirilmiştir.
Yukarıda belirtilen varolan yöntemleri dezavantajları besleyici hücreler, istihdam yüksek doz IL-2, olduğu kadar 10 mL tam kan kullanımı veya arıtma NK/T hücrelerinin şartı vardır nedeniyle klinikte çok zor bulunur hangi tip-in o EBV gizlice hücre doğrulama gerekliliği başlamadan kültürüne bozar. Olarak CAEBV ağırlıklı olarak Asya çocuklarda ortaya çıkar, 10 mL kan tüm bölgelerde elde etmek kolay değil. Bu çalışmada, düşük doz rhIL2 ve 2 mL tam kan hacmi olmayan besleyici hücreler kullanarak CAEBV hastaların PBMC kültür tarafından NK ve/veya T hücre hatları kurmak için yüksek başarı oranı ile yeni basit bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemi sonuçları, yüksek verimlilik ve zaman tasarrufu kanıtlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>FACS için Hu HLA-DR FITC</td><td>BD</td><td></td> 560944 <td>antikoru</td></tr><tr><td>Hu CD4 FITC</td><td>BD</td><td>555346</td><td>FACS için antikor</td></tr><tr><td>Hu/NHP CD8 PE</td><td>BD</td><td>557086</td><td>antikoru FACS için</td></tr><tr><td>Hu CD3 PE</td><td>BD</td><td>555340</td><td>antikoru FACS</td></tr><tr><td>için Hu CD16 FITC 3G8</td><td>BD</td><td>555406</td> antikoru Hu/<td></td></tr><tr><td>NHP CD56 PE MY31</td><td>BD</td> <td>için antikorFACS</td><td></td></tr><tr><td>hu/CD19 için 556647 antikoru PE-Cy7</td><td>BD</td><td>FACS</td><td></td></tr><tr><td>insan IL-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>insan serumu</td><td></td><td>MRC CCC118-125</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td> için 560728 antikoru <td>SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>Santrifüj</td></tr><tr><td>mikroskobu</td><td>OLYMPUS CKX53</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Countstar</td><td>IC 1000</td><td>Hücre sayımı için</td></tr><tr><td>24 kuyulu hücre kültürü kümesi</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>Polistiren plakalar</td></tr><tr><td>25cm2 hücre kültürü şişesi</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>Polistiren</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Hücre ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>RPMI Orta 1640</td><td>yaşam</td><td>22400089</td><td>Hücre ortamı için</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Amresco</td><td>374</td><td>Hücre ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>100 x streptomisin penisilin çözeltisi BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>Hücre ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Lenfositin in vitro izolasyonu için</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Hücrelerin</td></tr> <tr><td>dondurulması içinakış sitometresi</td><td>BD</td><td>BD FACSAria II</td><td></td></tr><tr><td>yazılım</td><td>BD</td><td>BD FACSDiva yazılım</td><td>FACS analizi</td></tr></tbody></table>

nk ve kronik aktif epstein - barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda t hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Birkaç yöntem NK/T Hücre Lenfomasi veya lenfoproliferatif sendromu olan hastalar satırlarından kurmak için tarif edilmiştir. Bu yöntemler besleyici hücreler, 10 mL kan olduğu kadar arıtılmış NK veya T hücreleri veya yüksek doz IL-2. Bu çalışmada periferik kültür tarafından NK ve T hücre hatları mononükleer hücreler (PBMC) kan rekombinant insan IL-2 (rhIL-2) eklenmesi ile kurmak için güçlü ve basit bir strateji ile yeni bir yöntem sunar ve tam kan 2 mL kadar az kullanır. Hücreleri hızlı bir şekilde iki hafta içinde çoğalırlar ve 3 aydan fazla muhafaza. Bu yöntemle, 7 NK veya T hücre hatları yüksek başarı oranı ile kurulmuştur. Bu yöntem basit, güvenilir ve hücre hatları CAEBV veya NK/T Hücre Lenfomasi olan durum daha kurulması için geçerli.

3 gün hücre hatları kurulması sırasında kültür sonra çok biçimli hücreler (Şekil 2) görünmesini başlar. Yüksek bir oranda (şekil 3) hücre canlılığı ve numarası arttıkça 7 gün sonra hücreleri hızlı bir şekilde büyümek. Hücre küçük kümeleri 10-14 gün sonra büyüyen, 3-6 × 106hücre konsantrasyonu aştığında açıkça görülebilir. Bu dönemde, hücre kültür plaka iki ya da üç kuyu içine bölümü tarafından genişletilip. Yaklaşık bi...

NK ve T Hücre klonlar CAEBV hastalardan elde etmek için basit bir yöntem yüksek verimlilik, periferik kan küçük bir miktar ve düşük doz IL-2 ile geliştirilmiştir.

NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Bu prosedürün genel amacı, bu ölümcül hastalıkla ilgili araştırmaların büyük önem taşıdığı CAEBV hastalarından NK veya T hücre hatları elde etmektir. Bu yöntem, hücre proliferasyonu üzerinde ham VBV'nin incelenmesi, NK/T hücre proliferasyonuna müdahale eden inhibitörlerin taranması gibi CAEBV mekanizması üzerine araştırmalar için NK veya T hücre hatlarının elde edilmesine yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, CAEBV hastalarından NK veya T hücre hatları oluşturmak için sadece az miktarda periferik kan ve düşük dozda demir gerektiren çok basit ve etkili olmasıdır.Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü kültürün ilk iki haftasında hücre sağkalımı belirsizdir ve bu yöntem size erken kültürün hücre proliferasyonunu nasıl belirleyeceğinizi gösterecektir. Bu yöntem için ilk fikrimiz olduğunda, insan serumu demir iki'nin iki haftaya kadar PBMC içerebileceğini gördük. Bu yöntemin gösterilmesinin kritik olduğunu gösterdik, çünkü hücrelerin şeklini ve çoğalma nedenini gösteriyor.Ve hücrelerin bu uzantısı ve Y-bar hücrelerinin numaralandırılması Bu işleme başlamak için, birincil PBMC'yi gradyan santrifüjleme ile CAEBV hastalarının iki mililitre tam kanından saflaştırın. Alternatif olarak, kriyo ile korunmuş PBMC'yi RPMI-1640 ortamı ile sıvı nitrojenden çözün. Daha sonra, hücreleri üç dakika boyunca lekelemek için 18 mikrolitre hücre süspansiyonuna iki mikrolitre% 0.4 tripan mavisi ekleyin, ardından süspansiyonu hücre sayaç plakasına aktarın ve otomatik bir hücre sayacı ile hücre konsantrasyonunu ve canlılığını ölçün.Hücre süspansiyonunu, %20 insan serumu, iki milimolar L-glutamin ve antibiyotik içeren tam RPMI-1640 kültür ortamı ile desteklenmiş, mililitre başına 10 ila altıncı hücre yoğunluğunda hazırlayın. Bunu takiben, 24 kuyulu hücre kültürü plakasına oyuk başına bir mililitre PBMC süspansiyonu tohumlayın. Daha sonra, her kuyucuğa mililitre rhIL-2 başına 150 birim ekleyin.Kültür plakalarını 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatöre yerleştirin. İkinci günde, hücre morfolojisini mikroskop altında 200 kat büyütmede gözlemleyin. Hücreler parlak ve yuvarlak olduklarında iyi durumdadır.Bu adımda, 18 mikrolitre hücre süspansiyonuna iki mikrolitre% 0.4 tripan mavisi ekleyin ve hücrelerin konsantrasyonunu hesaplayın. Ardından, hücre morfolojisini gözlemleyin ve ortamı değiştirmeden önce hücreleri numaralandırarak hücre büyümesinin durumunu izleyin. Hücre morfolojisini ve durumunu izlemek önemlidir.Hücrelerin polimorfik hücreler tarafından hayatta kalıp kalmadığına ve hücrelerin bir kültürün erken aşamasındaki durumuna karar verebiliriz. Daha sonra, 24 oyuklu plakanın her bir oyuğundan 500 mikrolitre besiyerini çıkarın ve buna 500 mikrolitre taze tam kültür ortamı ekleyin. Daha sonra her kuyucuğa mililitre rhIL-2 başına 150 birim ekleyin.Ortamı haftada iki kez değiştirin. Hücre büyüme eğrisini çizin. Canlı hücre konsantrasyonu mililitre başına 10 ila altıncı hücrenin beş katını aştığında, hücreleri her bir kuyucukta mililitre başına bir ila iki kez 10 ila altıncı hücre konsantrasyonunda yeni kuyucuklara bölün.Bu işlem iki ila dört hafta sürer. Hücreler genişlediğinde, hücre dizilerinin fenotiplerini belirlemek için bir kere 10'a altıncı hücre toplayın. NKNT hücrelerini çökeltmek için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 240 kez g'de santrifüjleyin.Bundan sonra, süpernatanı atın, yedi mililitre PBS ekleyerek çökeltmeyi yıkayın. Oda sıcaklığında 240 zaman g'de beş dakika santrifüjleyin. İşlemi bir kez daha tekrarlayın, ardından her tüpe 200 mikrolitre insan serumu ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 240 kez g'de santrifüjleyin.Süpernatanı atın ve hücreleri soğuk PBSA ile mililitrede 10 ila altıncı hücrede bir kez yeniden askıya alın. Daha sonra, hücreleri her biri iki kez 10'a beşte bir hücre içeren beş tüpe bölün. Bundan sonra, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 240 kez g'de santrifüjleyin Süpernatanı atın ve hücreleri, T veya NK hücrelerinin hücre reseptörlerini boyamak için 10 mikrolitre PE ve 10 mikrolitre FITC etiketli antikor içeren PBSA tamponu veya PBSA ile yeniden askıya alın.PBSA tamponu ile süspanse edilen hücreler negatif kontrol olarak kullanılır. Daha sonra, hücreleri karanlıkta buz üzerinde 20 ila 30 dakika boyunca antikorlarla inkübe edin. Hücreleri soğuk PBSA ile iki kez yıkayın ve akış sitometresi ile analizden önce hücreleri 300 mikrolitre soğuk PBSA ile tekrar süspanse edin.Hücre fenotip analizi tamamlandığında, süpernatantın yarısını dikkatlice çıkarın ve plakanın altındaki hücrelere dokunmaktan kaçının. Plakalara mililitre başına 300 birim rhIL-2 içeren aynı hacimde taze kültür ortamı ekleyin, ardından hücre kümeleri mikroskop altında açıkça görünene kadar ortamın yarısını her üç günde bir değiştirin. Bundan sonra, aynı soyun farklı oyuklarını karıştırdıktan sonra hücreleri 24 oyuklu plakalardan T-25 kültür şişelerine aktarın.Ortamın hacmi 10 ila 15 mililitreye genişleyene kadar sararırken kültür ortamının hacmini iki katına çıkarın. Bunu takiben, mililitre başına 150 birim konsantrasyonda rhIL-2 ekleyin. Hücre kütlesinin çıplak gözle görülebildiği iki ila üç hafta büyüdükten sonra donmadan 24 saat önce ortamı değiştirin.Hücre sayacı ile hücre konsantrasyonunu ölçün. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 240 kez g'da beş dakika boyunca santrifüjleyin ve hücre peletini% 90 fetal sığır serumu ve% 10 DMSO içeren donmuş stok çözeltisi ile mililitre başına beş ila 10 kez 10 ila altıncı hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın. Dakikada bir santigrat derece ila eksi 80 santigrat derece arasında dondurun ve ardından doğrudan sıvı nitrojene aktarın.Hücre hatlarının kurulması sırasında üç günlük kültürden sonra, polimorfik hücreler ortaya çıkmaya başlar. Yedi gün sonra, hücrelerin hem sayısı hem de canlılığı yüksek oranda arttığı için hücreler hızla büyür. Küçük hücre kümeleri, 10 ila 14 gün büyüdükten sonra, hücre konsantrasyonu üç ila altı kez 10 ila altıyı aştığında açıkça görülebilir.Bu dönemde hücreler, kültür plakasının iki veya üç oyuğuna bölünerek genişletilmelidir. Yaklaşık bir ay sonra, hücre sayısı üç ila beş çarpı 10'a yediye ulaştığında, sayı koruma için yeterince yüksektir. Bir diğer önemli konu ise hücrelerin başarılı bir şekilde kültüre edilmesinden sonra fenotiplerin belirlenmesidir.Sonuçlarımız, T ve NK hücrelerinin yukarıda açıklanan yöntemle kültürlenebileceğini ve hücreler iyi durumda üç aydan fazla büyüdükçe bu teknikle hücre dizilerinin oluşturulabileceğini göstermektedir. Bu yöntem, bu teknik daha da yapılabilir. Düzgün bir şekilde gerçekleştirmek kolaydır.Bu prosedürü denerken, PBMC'nin değişkenliğini korumayı unutmamak önemlidir. Bu prosedür için, MTT-tahlil kiti 8 gibi her iki yöntem de, evlat edinen immünoterapi için kullanılabilecek NK veya T hücre hatlarının toksisitesi gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Her gelişmeden sonra, bu teknik, CAEBV alanındaki araştırmacıların, hücre model sisteminde operatif hastalıkları içeren EBV ile ilişkili NK/T mekanizmasını keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, bu protokolü izleyerek NK ve T hücre hatlarını nasıl genişleteceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bir patojenle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygularken her zaman önlem alınması gerektiğini unutmayın.

an-efficient-simple-method-to-establish-nk-t-cell-lines-from-patients

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Üretimi için hızlı, basit ve maliyet-etkin bir protokol, CMV, İlan EBV enfeksiyonları yakalanma riski altında allojeneik hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) alıcıları infüzyon için donör kaynaklı multivirus spesifik CTL (rCTL). Bu üretim sürecine GMP uyumlu ve T-hücre immünoterapi uzmanlaşmış merkezlerde ötesinde daha geniş bir şekilde uygulanmasını sağlamak olmalıdır.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Epstein-Barr virüsü ile transforme B hücre hatları üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, üç gün sonra enfeksiyon gibi erken olarak dönüşüm geçirmesi mukadder B hücreleri belirleyebilir bir roman tahlil göstermektedir.

Epstein-Barr Virus Büyüme dönüştürülmüş lenfoblastoid hücre dizilerinde kurulması

Burada ilk iyi üretim uygulamaları (GMP) uyumlu göbek kordon kanı, ağırlıklı naif T hücrelerinin kaynağı virüs-spesifik sitotoksik T lenfositler (CTL) üretme yöntemi açıklar.

Kordon Kanı adlı Sitotoksik T lenfositler genişletilmesi olduğunu Hedef Sitomegalovirüs, Epstein-Barr Virus ve Adenovirüs

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Kaposi sarkomu (KS) enfeksiyon oncogenic virüs insan herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) ile indüklenen bir tümördür. Burada açıklanan endotel hücre kültür model benzersiz olarak hangi konak hücreleri KSHV dönüşümleri mekanizmaları eğitim için uygundur.

Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli

B-LCLs'in kurulması için basit bir kırmızı kan hücre parçalama yöntemi kan küçük bir miktar gerektiren ve dondurarak saklama için başlangıcından itibaren zaman tasarrufu, yüksek ölümsüzleşme verimliliği ile geliştirilmiştir.

B lenfoblastoid hücre dizilerinde Kurulması için Basit Kırmızı Kan Hücresi Lizis Yöntemi

Burada Epstein Barr Virüs ölümsüzleştirilmiş insan B-lenfositler ve miyotubes içine farklılaştırılmış kas biyopsisi türetilmiş uydu hücreleri endojen olarak ifade edilen RYR1 mutasyonlarının fonksiyonel etkisini incelemek için kullanılan yöntemler açıklanmıştır.

Endojen Olarak İfade Edilen İnsan RYR1 Varyantlarının İşlevsel Karakterizasyonu

Burada, periferik kan doğal öldürücü (PBNK), karaciğer dokularından NK hücreleri ve periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) veya kordon kanından (CB) türetilen kimerik antijen reseptörü (CAR)-NK hücrelerini genişletmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, genişlemiş NK hücrelerinin optimize edilmiş saflığına ek olarak, 221-mIL-21 besleyici hücreler kullanılarak NK ve CAR-NK hücrelerinin genişlemesini göstermektedir.

Doğal Öldürücü (NK) ve Membran Bound-IL-21-Modifiye B Hücre Hattı Kullanarak CAR-NK Hücre Genleşme Yöntemi

Periferik kan mononükleer hücrelerinin (monositler, CD4 + T hücreleri, CD8 + T hücreleri, B hücreleri ve doğal öldürücü hücreler) tanımlanmış bağışıklık hücresi alt popülasyonlarını izole etmek ve analiz etmek için immünomanyetik boncukları ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamasını birleştiren bir yöntem tanımladık. Bu yöntemi kullanarak, manyetik ve floresan olarak etiketlenmiş hücreler saflaştırılabilir ve analiz edilebilir.

Enfeksiyöz Mononükleozlu Çocuklardan Periferik Kan Örneklerinde İmmün Hücre Alt Popülasyonlarının Ayrılması

Bu protokol, Epstein-Barr virüs parçacıklarının, forbol 12-miristat 13-asetat ile viral litik döngüyü indükledikten sonra insan P3HR1 hücre hattından izole edilmesine izin verir. DNA daha sonra viral preparattan çıkarılır ve viral parçacık konsantrasyonunu ölçmek için gerçek zamanlı PCR'ye tabi tutulur.

Epstein-Barr Virüsünün P3HR1 Hücre Hattından İzolasyonu ve Nicelleştirilmesi

Öğrenin, kronik aktif Epstein-Barr virüsü hastalarından NK ve T hücre hatları elde etmek için basit ve verimli bir yöntemi. Bu teknik, az miktarda periferik kan ve düşük doz IL-2 kullanarak immünoloji araştırmalarını kolaylaştırır.

NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem (Video) | JoVE Journal

NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem

Daha fazla video keşfet