NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem

Bu prosedürün genel amacı, bu ölümcül hastalıkla ilgili araştırmaların büyük önem taşıdığı CAEBV hastalarından NK veya T hücre hatları elde etmektir. Bu yöntem, hücre proliferasyonu üzerinde ham VBV'nin incelenmesi, NK/T hücre proliferasyonuna müdahale eden inhibitörlerin taranması gibi CAEBV mekanizması üzerine araştırmalar için NK veya T hücre hatlarının elde edilmesine yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, CAEBV hastalarından NK veya T hücre hatları oluşturmak için sadece az miktarda periferik kan ve düşük dozda demir gerektiren çok basit ve etkili olmasıdır.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü kültürün ilk iki haftasında hücre sağkalımı belirsizdir ve bu yöntem size erken kültürün hücre proliferasyonunu nasıl belirleyeceğinizi gösterecektir. Bu yöntem için ilk fikrimiz olduğunda, insan serumu demir iki'nin iki haftaya kadar PBMC içerebileceğini gördük. Bu yöntemin gösterilmesinin kritik olduğunu gösterdik, çünkü hücrelerin şeklini ve çoğalma nedenini gösteriyor.

Ve hücrelerin bu uzantısı ve Y-bar hücrelerinin numaralandırılması Bu işleme başlamak için, birincil PBMC'yi gradyan santrifüjleme ile CAEBV hastalarının iki mililitre tam kanından saflaştırın. Alternatif olarak, kriyo ile korunmuş PBMC'yi RPMI-1640 ortamı ile sıvı nitrojenden çözün. Daha sonra, hücreleri üç dakika boyunca lekelemek için 18 mikrolitre hücre süspansiyonuna iki mikrolitre% 0.4 tripan mavisi ekleyin, ardından süspansiyonu hücre sayaç plakasına aktarın ve otomatik bir hücre sayacı ile hücre konsantrasyonunu ve canlılığını ölçün.

Hücre süspansiyonunu, %20 insan serumu, iki milimolar L-glutamin ve antibiyotik içeren tam RPMI-1640 kültür ortamı ile desteklenmiş, mililitre başına 10 ila altıncı hücre yoğunluğunda hazırlayın. Bunu takiben, 24 kuyulu hücre kültürü plakasına oyuk başına bir mililitre PBMC süspansiyonu tohumlayın. Daha sonra, her kuyucuğa mililitre rhIL-2 başına 150 birim ekleyin.

Kültür plakalarını 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatöre yerleştirin. İkinci günde, hücre morfolojisini mikroskop altında 200 kat büyütmede gözlemleyin. Hücreler parlak ve yuvarlak olduklarında iyi durumdadır.

Bu adımda, 18 mikrolitre hücre süspansiyonuna iki mikrolitre% 0.4 tripan mavisi ekleyin ve hücrelerin konsantrasyonunu hesaplayın. Ardından, hücre morfolojisini gözlemleyin ve ortamı değiştirmeden önce hücreleri numaralandırarak hücre büyümesinin durumunu izleyin. Hücre morfolojisini ve durumunu izlemek önemlidir.

Hücrelerin polimorfik hücreler tarafından hayatta kalıp kalmadığına ve hücrelerin bir kültürün erken aşamasındaki durumuna karar verebiliriz. Daha sonra, 24 oyuklu plakanın her bir oyuğundan 500 mikrolitre besiyerini çıkarın ve buna 500 mikrolitre taze tam kültür ortamı ekleyin. Daha sonra her kuyucuğa mililitre rhIL-2 başına 150 birim ekleyin.

Ortamı haftada iki kez değiştirin. Hücre büyüme eğrisini çizin. Canlı hücre konsantrasyonu mililitre başına 10 ila altıncı hücrenin beş katını aştığında, hücreleri her bir kuyucukta mililitre başına bir ila iki kez 10 ila altıncı hücre konsantrasyonunda yeni kuyucuklara bölün.

Bu işlem iki ila dört hafta sürer. Hücreler genişlediğinde, hücre dizilerinin fenotiplerini belirlemek için bir kere 10'a altıncı hücre toplayın. NKNT hücrelerini çökeltmek için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 240 kez g'de santrifüjleyin.

Bundan sonra, süpernatanı atın, yedi mililitre PBS ekleyerek çökeltmeyi yıkayın. Oda sıcaklığında 240 zaman g'de beş dakika santrifüjleyin. İşlemi bir kez daha tekrarlayın, ardından her tüpe 200 mikrolitre insan serumu ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 240 kez g'de santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve hücreleri soğuk PBSA ile mililitrede 10 ila altıncı hücrede bir kez yeniden askıya alın. Daha sonra, hücreleri her biri iki kez 10'a beşte bir hücre içeren beş tüpe bölün. Bundan sonra, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 240 kez g'de santrifüjleyin Süpernatanı atın ve hücreleri, T veya NK hücrelerinin hücre reseptörlerini boyamak için 10 mikrolitre PE ve 10 mikrolitre FITC etiketli antikor içeren PBSA tamponu veya PBSA ile yeniden askıya alın.

PBSA tamponu ile süspanse edilen hücreler negatif kontrol olarak kullanılır. Daha sonra, hücreleri karanlıkta buz üzerinde 20 ila 30 dakika boyunca antikorlarla inkübe edin. Hücreleri soğuk PBSA ile iki kez yıkayın ve akış sitometresi ile analizden önce hücreleri 300 mikrolitre soğuk PBSA ile tekrar süspanse edin.

Hücre fenotip analizi tamamlandığında, süpernatantın yarısını dikkatlice çıkarın ve plakanın altındaki hücrelere dokunmaktan kaçının. Plakalara mililitre başına 300 birim rhIL-2 içeren aynı hacimde taze kültür ortamı ekleyin, ardından hücre kümeleri mikroskop altında açıkça görünene kadar ortamın yarısını her üç günde bir değiştirin. Bundan sonra, aynı soyun farklı oyuklarını karıştırdıktan sonra hücreleri 24 oyuklu plakalardan T-25 kültür şişelerine aktarın.

Ortamın hacmi 10 ila 15 mililitreye genişleyene kadar sararırken kültür ortamının hacmini iki katına çıkarın. Bunu takiben, mililitre başına 150 birim konsantrasyonda rhIL-2 ekleyin. Hücre kütlesinin çıplak gözle görülebildiği iki ila üç hafta büyüdükten sonra donmadan 24 saat önce ortamı değiştirin.

Hücre sayacı ile hücre konsantrasyonunu ölçün. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 240 kez g'da beş dakika boyunca santrifüjleyin ve hücre peletini% 90 fetal sığır serumu ve% 10 DMSO içeren donmuş stok çözeltisi ile mililitre başına beş ila 10 kez 10 ila altıncı hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın. Dakikada bir santigrat derece ila eksi 80 santigrat derece arasında dondurun ve ardından doğrudan sıvı nitrojene aktarın.

Hücre hatlarının kurulması sırasında üç günlük kültürden sonra, polimorfik hücreler ortaya çıkmaya başlar. Yedi gün sonra, hücrelerin hem sayısı hem de canlılığı yüksek oranda arttığı için hücreler hızla büyür. Küçük hücre kümeleri, 10 ila 14 gün büyüdükten sonra, hücre konsantrasyonu üç ila altı kez 10 ila altıyı aştığında açıkça görülebilir.

Bu dönemde hücreler, kültür plakasının iki veya üç oyuğuna bölünerek genişletilmelidir. Yaklaşık bir ay sonra, hücre sayısı üç ila beş çarpı 10'a yediye ulaştığında, sayı koruma için yeterince yüksektir. Bir diğer önemli konu ise hücrelerin başarılı bir şekilde kültüre edilmesinden sonra fenotiplerin belirlenmesidir.

Sonuçlarımız, T ve NK hücrelerinin yukarıda açıklanan yöntemle kültürlenebileceğini ve hücreler iyi durumda üç aydan fazla büyüdükçe bu teknikle hücre dizilerinin oluşturulabileceğini göstermektedir. Bu yöntem, bu teknik daha da yapılabilir. Düzgün bir şekilde gerçekleştirmek kolaydır.

Bu prosedürü denerken, PBMC'nin değişkenliğini korumayı unutmamak önemlidir. Bu prosedür için, MTT-tahlil kiti 8 gibi her iki yöntem de, evlat edinen immünoterapi için kullanılabilecek NK veya T hücre hatlarının toksisitesi gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Her gelişmeden sonra, bu teknik, CAEBV alanındaki araştırmacıların, hücre model sisteminde operatif hastalıkları içeren EBV ile ilişkili NK/T mekanizmasını keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, bu protokolü izleyerek NK ve T hücre hatlarını nasıl genişleteceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bir patojenle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygularken her zaman önlem alınması gerektiğini unutmayın.