Name: Fare Cochleae iç kulak doku mühendisliği için Decellularizing için bir iletişim kuralı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Keşfedin fare kokleasının hücre dışı matrisiyle etkileşimleri incelemek için doku mühendisliği uygulamalarında kullanılan dehüllerleştirme ve dekalsifikasyon yöntemini. Bu teknik duyu epiteli oluşumunu araştırmaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Geçerli proje kavramı Fonu University of Kansas kanıtı tarafından finanse edildi. Biz bize cochleae kültürleri ile yardım için insan göbek bağları ve David Jorgensen elde yardımcı olmak için KUMC (Kansas City, KS) hemşirelerin teşekkür etmek istiyorum.

Tüm yordamları, hayvan ötenazi, dahil olmak üzere onaylanmış kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) iletişim kuralı (ACUP #2014-2234) Kansas Üniversitesi Tıp Merkezi (KUMC) göre yapılmıştır.
Not: HWJCs Onam sağlanan hastalar tarafından bağışlandı insan göbek bağları yalıtılmış ve numuneler Kansas Üniversitesi insan denekler Komitesi tarafından (KU-IRB #15402) onaylanmış protokolleri uygun olarak kullanılmıştır.
1. Temporal kemik hasat ve koklea yalıtım
<ol>
	<li>Cerrahi makas keskin bir çift ile kafatası ve ilk servikal omur arasında keserek uygun şekilde ötenazi, 15-hafta-yaşlı fare başını kesmek, o zaman (şekil 1A) dezenfekte için % 70 etanol ile baş aşağı sprey.</li>
	<li>Cerrahi makas (şekil 1B-C, kesik çizgiler) aynı keskin çiftini kullanarak bir-sagittal düzlemde kafatası bisect.</li>
	<li>Beyin dokusu forseps (şekil 1 d, ok ucu) bir çift kullanarak kafatasından kaldırın.</li>
	<li>Temporal kemik işitsel varlığı ve kafatası ve (şekil 1F, ok) dış kulak kanalına iç vestibular sinir kökleri (şekil 1E-F, ok uçları) tanımlayın. Dikkatle kafatası kafatası (şekil 1G) kalan şakak kemiğinden yalıtmak için kesti. Not: bazı durumlarda, ince kesim gerek kalmadan kafatası temporal kemik uzak çevresindeki kemiklerin burnumu sokmak mümkün olabilir.</li>
	<li>Böylece ipuçları koklea delinme riski değil iyi forseps kulak kanalına yaklaşık 5 mm (şekil 1 H), açılış içine ekle. Yavaşça bulla (şekil 1 H, en iyi kırmızı gölgeli alan) kemik kır aç (noktalı1I rakam, kırmızı hat) kırıkları bu yüzden. Not: gerekirse, diseksiyon mikroskop bu süreçte doğru yerleştirme ve işleme aletleri sağlamak için yardımcı olabilir.</li>
	<li>İyi forseps kullanarak, uzak bulla temporal kemikten, koklea (şekil 1J, kırmızı köşeli ayraçlar) kemik labirent maruz kalan gözetlemek.</li>
	<li>Temporal kemik alacak kadar büyük bir Petri kabına yerleştirin (örneğin, 30 mm veya daha büyük) altında diseksiyon kapsam görüş alanı ve yeterli fosfat tamponlu tuz (temporal kemik (örneğin, 0.5-1 mL) kapsayacak şekilde PBS ile) doldurun.</li>
	<li>Yukarı dönük olacak şekilde koklea oval ve yuvarlak pencerelerle PBS kaldırıldı bulla ile temporal kemik daldırın. Not: Vestibüler sistem manipüle ve koklea (1I anlamaya ve şekil 2B) özelliklerini yönlendirme için de bir kolu olarak hizmet vermektedir olarak koklea Vestibüler sistemden kaldırılması gerekli değildir.</li>
	<li>Forseps Ultra-ince bir çifti kullanarak, stapes geçer stapedial arter kaldırın.</li>
	<li>Ultra-ince forseps nerede arter geçtiğini üzengi kemer aracılığıyla bir ucu yerleştirin ve ince üzengi yukarı doğru kaldırın. Disarticulated üzengi oval pencere kapalı kaldırmak.</li>
	<li>Ultra-ince forseps bir ucu kullanarak, oval ponksiyon ve windows yuvarlak.</li>
	<li>1 x PBS kullanarak 28.5'lik şırınga ile tüp dolu (iç çap 0,28 mm, dış çap 0,61 mm) bağlı, tüp oval penceresinin üzerine getirin (şekil 2A -B). Not: Tüp açılış yardımcı olmak doğru yerleşim sağlamak için ultra-ince forseps kullanarak manipüle edilebilir.<ol>
		<li>Temiz şırınga ve boru her koklea için kullanın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>% 10 antibiyotik antimycotic (anti-anti) ve % 10 penisilin-streptomisin (kalem-strep) PBS içinde koklea 5 dk ile perilymph kaldırmak için 2 mL sıvı. Çok hızlı çok fazla baskı ile Ventriküler koklea içinde güzel yapıları zarar verir. Not: bir perfüzyon pompası alternatif olarak kullanılabilir, ancak el ile el ile koklea yoluyla sıvı sıvı şırınga sürüş etkilidir.<ol>
		<li>El ile Ventriküler, koklea (şekil 2A) dengelemeye forseps perfüzyon sırasında kendi kendine kapanış temporal kemik Vestibüler bölümünü açgözlü bir çift iyi kullanın. Not: gerekli değildir, ancak bu iki el aletleri işlemek serbest bırakır; bir yandan diğer tüp konumlandırabilirsiniz iken şırınga (şekil 2A) sürebilirim uygun şekilde (şekil 2B).</li>
		<li>Bu adım ileri, koklea gereksiz yere hava için kullanılmasını önlemek için dikkat ediniz. Hava kabarcıkları sıvı alanlarda tanıtımı sıvı dolaşımını engeller ve daha fazla kurumasını koklea içinde güzel yapıları zarar verir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kaldırmak ve iyi forseps kullanarak herhangi bir kalan kas doku ve kemik parçaları atın.</li>
	<li>Gerekirse, izole cochleae 4 ° C'de % 10 anti-anti ve % 10 kalem-strep çözümde PBS antibiyotik çözüm her 48 h normal değişikliklerle yedi güne kadar saklayın.</li>
</ol>
2. koklear işleme
<ol>
	<li>Decellularization
	<ol>
		<li>Her koklea için dolgu 20 mL cam mercek şişe ile % 1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) çözüm koklea decellularize eskiden de-iyonize (DI) su içinde.</li>
		<li>Kapalı açılış geçmesine bir koklea için yeterli büyüklükte bir jilet kullanarak bir plastik 7-mL transfer pipet ucu kesilmiş.</li>
		<li>Sadece bir kaç milimetre kesme kenarına geçer böylece transfer pipet kullanarak yavaşça koklea pipet çizin.</li>
		<li>Koklea % 1 SDS çözüm dolu mercek flakon kovmak.</li>
		<li>2 mL % 1 SDS koklea transfer pipet kullanarak mercek şişe içinde de-iyonize (DI) su içinde dolaşımda.</li>
		<li>Mercek şişe bir rotator yerleştirin ve oda sıcaklığında 72 h için 10 RPM döndürmek mercek şişe sağlar.<ol>
			<li>% 1 SDS çözüm her 24 h bir 72 saat süre içinde değiştirin. SDS koklea hava için pilleri değiştirirken dikkat et.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Koklea üç kez için 30 dk her DI su ile yıkayın.</li></ol></li></ol>SDS giderler için kullanılan aynı mercek şişe yıkama gerçekleştirmek; Bu aşamada, koklea decellularized.
	
	
	<li>Kalsiyumun
	<ol>
		<li>Kalan DI su batık koklea tutmak yeterli bırakarak mercek şişeyi kaldırın.</li>
		<li>Kalsiyumun başlamak için koklea içeren mercek şişeyi DI suda 5 mL % 10 ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (0,02 M) de ekleyin.</li>
		<li>2 mL % 10 EDTA DI suyun içinden bir transfer pipet kullanarak mercek şişe koklea içinde dolaşımda.</li>
		<li>Mercek şişeyi geri rotator içinde yerleştirin ve oda sıcaklığında 72 h için 10 RPM döndürmek mercek şişe sağlar. % 10 EDTA çözüm her 24 h bir 72 saat süre içinde değiştirin. Böylece koklea havaya maruz değil çözümleri değiştirirken dikkat et.</li>
		<li>1 x PBS ile her 2 h için 3 kez koklea durulayın; Bu aşamada, koklea decalcified.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Depolama
	<ol>
		<li>Cochleae en fazla 72 saat için % 10 anti-anti, % 10 kalem-strep çözeltilerine PBS 4 ° C'de depolayın Not: Daha uzun depolama süre antibiyotik çözüm düzenli değişiklikler ile mümkün olabilir; Ancak, genişletilmiş depolama işlenmiş cochleae, bu protokol için doğrulanmadı.</li>
	</ol>
	</li>

3. satın alma ve hWJCs genişlemesi
<ol>
	<li>HWJCs göre daha önce yayımlanmış protokolleri22yalıtmak. Kısaca, göbek bağları 3 cm bölümlere kesiminde.</li>
	<li>Dikkatli bir neşter ile sığ bir kesi boyuna göz önüne sermek ve göbek kordonu Wharton'ın jöle maruz her göbek kordonu kesiminde olun. Forseps kan damarları kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>Göbek kordonu kesimleri yeterince PBS (örneğin, 60 mm Petri kabına 40 mL) ile iki kez doku daldırın yıkayın. İnce doku parçaları bir neşter ile kıyma. Sindirmek doku 100 mm Petri dish ile sindirim orta 50 mL (% 0,2 tip 2 collagenase, % 1 penisilin-streptomisin, düşük glikoz içinde Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM)).</li>
	<li>Doku bir orbital Çalkalayıcı geceleme bir % 5 CO2, 37 ° C kuluçka 50 RPM medyada sindirerek yerleştirin. Ertesi gün, seyreltik sindirim orta 1:16 antibiyotik-antimycotic PBS %2 oranında ve cips hücreleri tarafından Santrifüjü vasıl 500 x g oda sıcaklığında (~ 27 ° C) için 10 dk. atma süpernatant.</li>
	<li>Granül Mezenkimal Kök hücre büyüme orta (MSCGM) resuspend ve hücreleri birleştireceğimi. 7 x 103 hücreleri/cm2 doku kültürü'yoğunluğu plaka hücreleri T-75 şişeler tedavi. HWJCs MSCGM içinde kültür ve geçit 5 deneyler için genişletin. Not: HWJCs daha büyük T-şişeler alt kültürlü (örneğin, T-150, T-300) hWJCs deneyler için verimini artırmak için passaging zaman.</li>
</ol>
4. Decellularized Cochleae içine hWJCs infüzyonu
<ol>
	<li>Decellularized cochleae hazırlamak
	<ol>
		<li>Aseptik tekniği kullanarak, saklı cochleae 1 x PBS 30 dk için üç kez yıkayın.</li>
		<li>Cochleae 24-şey plaka ayrı kuyu aktarmak ve 37 ° C 1 mL ekleyin önceden MSCGM ısıttı.</li>
		<li>Cochleae bir % 5 CO2, 37 ° C hücre kültür kuluçka en az 1 h önce hücreleri infüzyonu kuluçkaya.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HWJCs ayırmak ve resuspend
	<ol>
		<li>Yıkama hWJCs 37 ° C ile 1 x PBS iki kez önceden ısıttı.</li>
		<li>Yeterli 37 ° C eklemek önceden tripsin hücre gemi yüzeyi kapsayacak şekilde % 0.5 EDTA ile ısıttı.</li>
		<li>HWJCs 5 dakikaya kadar bir % 5 CO2, 37 ° C hücre kültür kuluçka için kuluçkaya.<ol>
			<li>Ters bir mikroskop altında hücreler görüntüleyerek %90 hücre hücre kültür yüzeyden ayırdıktan doğrulayın. Not: Kültür gemi hafifçe vurdu olduğu zaman, hareket hücreleri ilişkisi kesildi. Sabit kalır, değil ayırdıktan hücreler.</li>
			<li>Daha fazla bağlı hücreler çıkarmak için balonun kenarlarına hafifçe dokunun.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aseptik teknik kullanılarak, kültür gemisinden transfer hWJCs içeren MSCGM eşdeğer bir birimi tripsin hacmiyle 50 mL konik tüp için hücreleri ayırmak için kullanılır.</li>
		<li>500 x g oda sıcaklığında, centrifuging tarafından hWJCs cips (~ 27 ° C) 5 min için.</li>
		<li>Süpernatant Aspire edin ve hWJCs bir konsantrasyon 500.000 hücre/mL MSCGM resuspend.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cochleae sıvı
	<ol>
		<li>Cochleae transfer pipet kullanarak yeni bir 24-şey tabağa aktarın.</li>
		<li>MSCGM bir damla herhangi bir koklea kurumasını önlemek için her koklea ekleyin.</li>
		<li>İnce oval ve yuvarlak windows karşı karşıya yükleyebilmeniz için ultra-ince forseps kullanarak koklea gelecek şekilde yönlendirin. Not: koklea kolayca zarar gibi her koklea doğrudan işlerken aşırı kendine iyi bak.</li>
		<li>Steril 28.5'lik insülin ile bağlı tüp kullanarak, 0.2 mL resuspended hWJCs (100.000 hücreleri) kadar çizin.</li>
		<li>Steril iyi forseps kullanarak, boru oval penceresinin üzerine getirin.</li>
		<li>İnce ve yavaş yavaş koklea ile resuspended hWJCs polietilen boru için bağlı 28.5'lik insülin kullanarak 0.2 mL sıvı (dış çap: 0,61 mm, iç çapı: 0,28 mm) yaklaşık 5 dk içinde.</li>
		<li>Perfüzyon sonra 37 ° C 0.8 mL ekleyin önceden sıcak MSCGM de 1 mL su kuyusunda Toplam hacim getirmek koklea içeren için.</li>
		<li>Adımları 4.3.3-4.3.7 taze bir Ģırınga kullanarak ve her zaman boru her koklea için yineleyin.</li>
		<li>Yer cochleae %5 CO2, 37 ° C hücre kültür kuluçka ve değişim medya haftada üç kez derin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. koklea hasat ve koruma
Not: Cochleae kültürlü olabilir ve herhangi bir zaman noktasında 30 gün sonrası perfüzyon hasat.
<ol>
	<li>Cochleae korumak için 1 x PBS gecede 4 ° C'de sallanan bir platformda %4 paraformaldehyde düzeltin.</li>
	<li>Fiksasyon sonra cochleae 1 x PBS 5 min için üç kez ile yıkayın.</li>
	<li>Yavaş yavaş koklea etanol ile kurutmak ve parafin içinde katıştırma önce bir Alifatik hidrokarbon çözücü ile temizleyin.</li>
	<li>Örnekleri için bir microtome kullanarak 10 µm kalınlığında bölüm ve cam mikroskop slaytlar üzerine monte edin. Not: Örnekleri için hazırsınız histolojik veya immunohistokimyasal işleme standart protokolleri kullanarak.</li>
</ol>

<ol><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+innervation+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).</li>
<li>LeMasurier, M., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-Cell+Mechanotransduction+and+Cochlear+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification.</a> Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).</li>
<li>Neal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+counts+in+a+rat+model+of+sound+damage%3A+Effects+of+tissue+preparation+%26+identification+of+regions+of+hair+cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss.</a> Hear Res. 328, 120-132 (2015).</li>
<li>Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss%3A+a+recreational+noise+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).</li>
<li>Stucken, E. Z., Hong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss%3A+an+occupational+medicine+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).</li>
<li>Dille, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinnitus+onset+rates+from+chemotherapeutic+agents+and+ototoxic+antibiotics%3A+results+of+a+large+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Audiol%22%5BJournal%5D)">Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study.</a> J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).</li>
<li>Sajjadi, H., Paparella, M. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18675691">Meniere's disease.</a> Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).</li>
<li>House, J. W., Brackmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinnitus%3A+surgical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Found+Symp%22%5BJournal%5D)">Tinnitus: surgical treatment.</a> Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure%3A+evidence+of+a+misspent+youth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li>
<li>Ryals, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+species+differences+in+susceptibility+to+noise+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Avian species differences in susceptibility to noise exposure.</a> Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).</li>
<li>Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+inner+ear+sensory+epithelia+from+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).</li>
<li>Sekiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transplantation+to+the+auditory+nerve+and+cochlear+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct.</a> Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).</li>
<li>Shi, F., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+replacement+of+auditory+neurons+by+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells.</a> Hear Res. 297, 106-112 (2013).</li>
<li>Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+decellularized+cochleae+as+scaffolds+for+inner+ear+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering.</a> Stem Cell Res Ther. 8, (2017).</li>
<li>Santi, P. A., Johnson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+ear+tissues+as+scaffolds+for+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).</li>
<li>Davies, D., Holley, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+alpha+3+and+alpha+6+integrins+in+the+developing+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear.</a> J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).</li>
<li>Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+extracellular+matrix+in+the+formation+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear.</a> Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).</li>
<li>Goodyear, R. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrices+associated+with+the+apical+surfaces+of+sensory+epithelia+in+the+inner+ear%3A+molecular+and+structural+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity.</a> J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).</li>
<li>Mellott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+Viability+and+Transfection+Efficiency+with+Human+Umbilical+Cord+Wharton%27s+Jelly+Cells+Through+Use+of+a+ROCK+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor.</a> Cell Reprogram. , (2014).</li>
<li>Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Photo-conversion%3A+A+second+chance+to+label+unique+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells.</a> Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).</li>
<li>Mitchell, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+cells+from+Wharton%27s+jelly+form+neurons+and+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia.</a> Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).</li>
<li>Mellott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+Reprogramming+of+Human+Wharton%27s+Jelly+Cells+Reveals+Differences+Between+ATOH1+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues.</a> Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).</li>
<li>Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+versus+sTSLIM+3D+imaging+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea.</a> J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).</li>
<li>Nonoyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+ototoxicity+of+gadoteridol+%28ProHance%29+and+gadodiamide+%28Omniscan%29+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice.</a> Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).</li>
<li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhesus+Cochlear+and+Vestibular+Functions+Are+Preserved+After+Inner+Ear+Injection+of+Saline+Volume+Sufficient+for+Gene+Therapy+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery.</a> J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).</li>
<li>Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bioactivity+of+cartilage+extracellular+matrix+in+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration.</a> Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yerel koklear hücreleri koklea koklea bir karmaşık, üç boyutlu doku iskele olarak kullanmak için izin verir bir decellularization süreci ile gelen kaldırılabilmesi için başarılı bir şekilde göstermiştir. Santi ve ark. 15 decellularizing cochleae için ilk yöntem geliştirdi ve birçok koklear yapıları birimleri hafif levha mikroskobu23yardımı ile doğru bir şekilde tahmin. Böyle erken dönem çalışmaları doku Mühendisliği ve burada sunulan hücre kültürü teknikleri için g...

Koklea temporal kemik bulundu bir karmaşık sarmal yapısıdır. Bir dış kemik labirent ve konsantrik, iç membranöz labirentin1oluşur. Membranöz labirentin üç sıvı boşluk oluşur: Scala vestibuli, Scala medya ve Scala tympani1. Çok sayıda hücre tiplerinin oluşmaktadır, duyu epiteli scala medya evler ama duyusal saç ses dalgaları sinir uyarılarının2mekanik enerji transduce, hücreleri (HC), belirli ilgi vardır. Akustik travma3,4,5, ilaç6, hastalık7,8ve yaşlanma9 maruz tüm Engelli işitsel işlevi HC ölüm ile sonuçlanabilir. Memelilerde saç hücre kaybı kalıcı yaralanma10' dan sonra yeniden oluşturabilirsiniz kuş HCs aksine.
Çağdaş araştırma çabalarının çeşitli çalışmışlardır kayıp HCs, geri yüklemek belirli deneysel yaklaşımlar farklılık. Duyu epiteli gen ifadesinde manipülasyon ve vücut dışında farklı kök hücre implantasyonu baskın yaklaşım alanında, kök hücre koklear organoids ayırt etmeye indüksiyon yöntemleri olmasına rağmen vardır 11,12,13çalıştı. Her bu yaklaşımların olması güvenen doğrudan kök hücre veya kök hücreleri tarafından; kullanılan gelişimsel ipuçları Ancak, bir saniye paylaşılan ve potansiyel olarak kritik koklea kendisi ECM öğedir14,15.
ECM sadece fiziksel için hücre ve doku, hücre adezyon, nükleer silahların yayılmasına karşı hayatta kalma ve geçiş için bir yüzey içerir, ancak aynı zamanda HCs ve sarmal ganglion15,16 gelişiminde önemli roller oynar destekler ,17. Doğal olarak meydana gelen ECM hücre fenotip belirlenmesi ve/veya hücre adezyon, yayılmasını önleme ve hayatta kalma18rehberlik endüktif sinyalleri sağlar. Sonuç olarak, kültürlü hWJCs ile birlikte decellularized koklea kullanımı ECM ve HC rejenerasyon rol keşfetmek için eşsiz bir fırsat sunuyoruz. HWJCs Mezenkimal Kök hücre19gibi davranan insan göbek bağları gelen izole bir hazır, tartışmalı olmayan hücre türü vardır. HWJCs neurosensory hücre soy20,21ayırt etmek için yetenek göstermiştir. Böylece, geçerli protokol izolasyon, decellularization ve cochleae C57BL fare leşleri ile iç kulak doku mühendisliği için hWJCs dan perfüzyon ayrıntıları.

<table><tbody><tr><td>Allegra X-14R Santrifüj</td><td>Beckman-Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic Yarı Sert Boru</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler</td><td>Eppendorf</td><td>M1190-0002</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>İnce Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Ultra İnce Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik Tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>U-100 İnsülin Şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td></td></tr><tr><td>Sintilasyon Flakonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-73</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-049</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş Bıçağı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>24 Kuyulu Plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost PLUS Cam Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046341</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Serisi II 3110 Su Jakuzili CO2 İnkübatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>Mezenkimal Kök Hücre Büyüme Ortamı</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-3232</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-75 Kültür Şişesi</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-150 Kültür Şişesi</td><td>MidSci</td><td>TP90151</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-300 Kültür Şişesi</td><td>MidSci</td><td>TP90301</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2R-FL Ters Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>MFA51010</td><td></td></tr><tr><td>NuAire Sınıf II, Tip A2 Biyogüvenlik Kabini</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>% 1 SDS Çözümü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143-100G</td><td></td></tr><tr><td>%10 EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

fare cochleae iç kulak doku mühendisliği için decellularizing için bir iletişim kuralı

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Memelilerde, işitme eksikliği yeniden yeteneği kolaylaştırmak mechanosensory saç hücreleri olan işitme kaybı için tedavi sınırlıdır. Geçerli rejeneratif tıp stratejileri kök hücre veya destek hücreleri değiştirme hasarlı kök hücrelerin işitme kaybı düzeltmek için teşvik etmek için iç kulak çevresindeki genetik manipülasyon nakli üzerinde odaklanmıştır. Henüz, hücre dışı Matriks (ECM) inducing ve saç hücreleri işlevini sürdürmek hayati bir rol oynayabilir ve değil de soruşturma. Koklear kullanarak nasıl kompozisyon ve ekstraselüler ortamın mimari AIDS hücreleri işitme fonksiyonu sürdürülmesi içine benzersiz anlayışlar ECM bir iskele olarak erişkin kök hücreleri büyümeye sağlayabilir. Burada izole ve cochleae üzerinden periosteum erişkin kök hücreleri kabul iskele kullanmak için fare decellularizing bir yöntem mevcut. Geçerli protokol cochleae decellularized ve decalcified euthanized fare, izole edilmiştir. Daha sonra göbek kordonu izole edildi insan Wharton'ın jöle hücreleri (hWJCs) dikkatle her koklea derin. Cochleae Biyoreaktörler kullanıldı ve analiz için işleme geçiren 30 gün için hücreler kültürlü. Decellularized cochleae olarak tanımlanabilir hücre dışı yapılar korunur ama hücrelerin varlığı veya DNA'ın dikkat çeken parçaları olmadığını göstermiştir. Koklea derin hücreler içte ve dışta koklea çoğunu işgal ve olay olmadan 30 gün süre içinde büyüdü. Böylece, geçerli yöntemi nasıl koklear ECM etkiler hücre gelişimi ve davranış çalışma için kullanılabilir.

Burada sunulan yöntemleri kullanarak, cochleae başarılı decellularization varlığı ya da yokluğu DNA ile 4', inceleyerek değerlendirildi 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) boyama. DNA decellularized koklea içinde tanımlanmamış Eğer cochleae tam olarak decellularized kabul edildi. Yerel bir koklea decellularization veya incelemelerine tabi değil bir önceki deneme olumlu bir denetim yapıları ve geleneksel olarak bir C57BL fare koklea içinde bulunan hücreleri göstermek için kullanıldı. İnfüzyo...

Bu iletişim kuralının amacı decellularize ve fare cochleae doku mühendisliği uygulamaları için iskele olarak kullanımı için decalcify için etkili bir yöntem göstermektir.

Fare Cochleae iç kulak doku mühendisliği için Decellularizing için bir iletişim kuralı

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Bu prosedürün genel amacı, iç kulak dokusu mühendisliği uygulamaları için bir iskele kullanmak üzere fare koklealarını hücrelerden arındırmak ve kireçten arındırmak için etkili bir yöntem göstermektir. Bu yöntem, işitsel ve doku mühendisliği alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin, 3D koklea ve hücre dışı matrisin çeşitli bileşenleri kök hücre farklılaşmasını nasıl etkiler? Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacının, hücrelerin duyusal epitel oluşturmak için kokleanın hücre dışı matrisi ile doğrudan nasıl etkileşime girdiğini incelemesini sağlamasıdır.Temporal kemik izolasyonu ve hücre profüzyon aparatının yalnızca metin açıklamalarına dayalı olarak doğru bir şekilde görselleştirilmesi zor olabileceğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu işleme başlamak için, keskin bir çift cerrahi makas kullanarak kafatasını orta sagital düzlemde ikiye bölün. Ardından, beyin dokusunu kafatasından çıkarın.Daha sonra kafatasının iç kısmındaki işitme ve vestibüler sinir köklerinin ve dıştan kulak kanalının varlığı yoluyla temporal kemiği tanımlayın. Temporal kemiği kafatasının geri kalanından izole etmek için kafatasını dikkatlice kesin. Daha so

a-protocol-for-decellularizing-mouse-cochleae-for-inner-ear-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Eldeki gelişimsel süreçleri on gün içinde bir zamansal degrade üzerinde çalışacak, çünkü embriyonik memeli Kokleanın Canlı görüntüleme zordur. Burada beş gün boyunca bir floresan raportör fare alınan embriyonik koklear eksplant doku görüntüleme sonra kültürleme ve için bir yöntem mevcut.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Embriyonik fare iç kulağından koklear eksplantların izolasyonunu ve kültürünü tanımlayan bir yöntem sunuyoruz.  Ayrıca, kare dalga elektroporasyon yoluyla koklear eksplantlara gen transferi için bir yöntem gösteriyoruz. Gen transfer tekniği ile birleştirilmiş in vitro eksplant kültürü, araştırmacıların gelişim sırasında gen ekspresyonunu değiştirmenin etkilerini incelemelerini sağlar.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Hayvan modellerinin koklealarına ototoksik ajanlar eklemek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Sunulan, ototoksik ajanların yuvarlak pencere nişine verilmesi için cerrahi bir protokoldür. Prosedür güvenilirdir, hedefe yönelik intra-koklear lezyonlar oluşturur ve mikromimaride mekanik hasarı önler. Koklear kendi kendine onarım/rejenerasyon muayenesi mümkündür.

Koklear Hücre Dejenerasyonu Inducing için hızlı ve Güvenilir Teknik: Ototoksik Ajan Teslimat için Fare Yuvarlak pencere Yaklaşımı

Birincil kirpikler çeşitli sinyal yollarını etkiler. Memeli kokleası, düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyalini incelemek için idealdir. Kirpikler disfonksiyonu koklear büyümeyi, hücresel paternlenmeyi ve saç hücresi oryantasyonunu, PCP okumalarını etkiler. Amacımız, fare kokleasında PCP sinyalizasyonunu fenotipik analiz, immünohistokimya ve taramalı elektron mikroskobu ile analiz etmektir.

Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

İç kulağa lokal ilaç verilmesi için iki mikrocerrahi yaklaşım burada tanımlanmış ve işitme parametreleri, koklear sitomimari ve inflamatuar belirteçlerin ekspresyonu üzerindeki etkisi açısından karşılaştırılmıştır.

Fare İç Kulak Hedefli İlaç Dağıtım Yöntemleri Karşılaştırmalı İncelemesi: Bullostomy Karşı Transtimpanik Enjeksiyon

Bu makalede, yetişkin fare kokleae immünohistokimya için 10 mm yuvarlak kapak fişleri koklear epitel parçaları yapıştırmak için bir hücre ve doku yapıştırıcı kullanımı ve kireçlenme gerektiren değiştirilmiş bir koklear yüzey hazırlama yöntemi sunar.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Burada, fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanalları ile işitsel saç hücrelerinde 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran alımını görselleştirmek için bir yöntem salıyoruz. Buna ek olarak, 3-10 kDa dekstrans saç endositoz ve Corti organının destekleyici hücreleri çalışmak için kullanılabilir.

Canlı ve Fonksiyonel Murine Koklear Saç Hücrelerinde Dekstran Etiketleme ve Alımı

Bu çalışmada, Corti organını içeren koklear epitel ile eks vivo inkübasyon ile hasarlı dokuya doğru hareket eden hücreleri gözlemlemek için konfokal mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı bir görüntüleme yöntemi sunuyoruz.

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

Mevcut protokol, önceki protokolleri güncellemekte ve yüksek kaliteli koklear eksplantların kültürlenmesi için nispeten basit yaklaşımlar içermektedir. Bu, canlı ve sabit hücrelerde güvenilir veri toplama ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Bu protokol, iç kulak hücrelerini incelemeye yönelik devam eden eğilimi desteklemektedir.

İn vitro Model Olarak Tüm Yenidoğan Koklear Eksplantları

Burada, farelerden birincil koklear saç hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Başlangıçta, Corti'nin organı yenidoğan (3-5 günlük) murin koklealarından mikroskop altında diseke edildi. Daha sonra, hücreler enzimatik olarak tek hücreli bir süspansiyona sindirildi ve kültürde birkaç gün sonra immünofloresan kullanılarak tanımlandı.

Yenidoğan Farelerden Primer Koklear Saç Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Fare iç kulak dokusunun acemi kullanıcıları için tasarlanan bu protokol, kesit immün boyama için farklı gelişim aşamalarında fare iç kulaklarının işlenmesine yönelik adımları kapsamlı bir şekilde detaylandırır.

Fare İç Kulak Dokusunun Kriyoseksiyon ve İmmün Boyama: Embriyonik Aşamalardan Yetişkin Aşamalarına

Keşfedin fare kokleasının hücre dışı matrisiyle etkileşimleri incelemek için doku mühendisliği uygulamalarında kullanılan dehüllerleştirme ve dekalsifikasyon yöntemini. Bu teknik duyu epiteli oluşumunu araştırmaya yardımcı olur.

Fare Cochleae iç kulak doku mühendisliği için Decellularizing için bir iletişim kuralı

Daha fazla video keşfet