Fare Cochleae iç kulak doku mühendisliği için Decellularizing için bir iletişim kuralı

Bu prosedürün genel amacı, iç kulak dokusu mühendisliği uygulamaları için bir iskele kullanmak üzere fare koklealarını hücrelerden arındırmak ve kireçten arındırmak için etkili bir yöntem göstermektir. Bu yöntem, işitsel ve doku mühendisliği alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin, 3D koklea ve hücre dışı matrisin çeşitli bileşenleri kök hücre farklılaşmasını nasıl etkiler? Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacının, hücrelerin duyusal epitel oluşturmak için kokleanın hücre dışı matrisi ile doğrudan nasıl etkileşime girdiğini incelemesini sağlamasıdır.

Temporal kemik izolasyonu ve hücre profüzyon aparatının yalnızca metin açıklamalarına dayalı olarak doğru bir şekilde görselleştirilmesi zor olabileceğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu işleme başlamak için, keskin bir çift cerrahi makas kullanarak kafatasını orta sagital düzlemde ikiye bölün. Ardından, beyin dokusunu kafatasından çıkarın.

Daha sonra kafatasının iç kısmındaki işitme ve vestibüler sinir köklerinin ve dıştan kulak kanalının varlığı yoluyla temporal kemiği tanımlayın. Temporal kemiği kafatasının geri kalanından izole etmek için kafatasını dikkatlice kesin. Daha sonra, ince forsepsleri kulak kanalının açıklığına yaklaşık beş milimetre sokun, böylece uçlar kokleayı delme riski taşımaz.

Bola kemiğini nazikçe kırın, böylece kırılır. İnce forseps kullanarak, bolanın geri kalanını temporal kemikten kaldırın ve kokleanın kemikli labirentini açığa çıkarın. Daha sonra, temporal kemiği kokleanın oval ve yuvarlak pencereleri yukarı bakacak şekilde PBS'ye batırın.

Ultra ince bir forseps çifti kullanarak, stapeslerden geçen stapedial arteri çıkarın. Daha sonra ultra ince forsepslerin bir ucunu arterin geçtiği stapes kemerinden geçirin ve stapesleri nazikçe yukarı doğru kaldırın. Bunu takiben, oval ve yuvarlak pencereleri delin.

Daha sonra, PBS dolgulu 28.5 gauge şırıngaya bağlı olan boruyu oval pencerenin üzerine yerleştirin. Perilenf'i çıkarmak için kokleadan beş dakika boyunca PBS'de iki milimetre% 10 Antibiyotik-Atimikotik ve% 10 Penisilin-Streptomisin bol miktarda dökün. Ardından kalan kas dokusunu ve kemik parçalarını çıkarın ve atın.

Hücrelerden arındırma için, transfer pipetini kullanarak kokleayı nazikçe pipetin içine çekin, böylece kesilen kenarı birkaç milimetre geçer. Ardından, kokleayı %1'lik SDS solüsyonu dolu sintilasyon şişesine boşaltın. Deiyonize su içinde iki mililitre% 1 SDS'yi bir transfer pipeti kullanarak sintilasyon şişesindeki koklea boyunca dolaştırın.

Sintilasyon şişesini bir döndürücüye yerleştirin ve oda sıcaklığında 72 saat boyunca 10 RPM'de dönmesine izin verin. 72 saatlik bir süre boyunca her 24 saatte bir taze, %1'lik SDS solüsyonu ile değiştirin ve solüsyon değişimi sırasında kokleayı havaya maruz bırakmamaya dikkat edin. Bundan sonra, kokleayı aynı sintilasyon şişesinde her biri 30 dakika boyunca DI suyunda üç kez yıkayın.

Bu aşamada, koklea hücrelerden arındırılmalıdır. Dekalsifikasyon için, kalan DI suyunu sintilasyon şişesinden çıkarın ve kokleayı su altında tutmaya yetecek kadar bırakın. Dekalsifikasyona başlamak için, koklea içeren sintilasyon şişesine beş mililitre% 10 EDTA ve DI suyu ekleyin.

Deiyonize su içinde iki mililitre% 10 EDTA'yı bir transfer pipeti kullanarak sintilasyon şişesindeki koklea boyunca dolaştırın. Sintilasyon şişesini döndürücüye geri yerleştirin ve sintilasyon şişesinin oda sıcaklığında 72 saat boyunca 10 RPM'de dönmesine izin verin. %10 EDTA çözeltisini 72 saatlik bir süre boyunca her 24 saatte bir değiştirin.

Solüsyonları değiştirirken kokleanın havaya maruz kalmamasına dikkat edin. Daha sonra kokleayı iki saat boyunca üç kez, her biri PBS ile durulayın. Bu aşamada, koklea kireçten arındırılmalıdır.

Hücreleri infüze etmeden önce, hücresinden arındırılmış ve kireçten arındırılmış kokleayı %5 Karbondioksit, 37 santigrat derece hücre kültürü inkübatöründe en az bir saat inkübe ederek başlayın. Kokleaları çoğaltmak için, herhangi bir kokleanın kurumasını önlemek için her kokleaya bir damla MSCGM ekleyin. Bunları bir transfer pipeti kullanarak 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın.

Oval ve yuvarlak pencereler yukarı bakacak şekilde ultra ince forseps kullanarak kokleayı hassas bir şekilde yönlendirin. Daha sonra, bağlı borulu steril bir 28.5 gauge İnsülin şırıngası kullanarak, 0.2 mililitre yeniden askıya alınmış İnsan Wharton jöle hücrelerini çizin. Daha sonra, sterilize edilmiş ince forseps kullanarak boruyu oval pencerenin üzerine yerleştirin.

Beş dakika boyunca 0.2 mililitre yeniden süspanse edilmiş İnsan Wharton jöle hücreleri ile kokleayı nazikçe ve yavaşça doldurun. Bu bolluk basamağı önemlidir. Koklea yoluyla sıvıların başarılı bir şekilde bollaşması, bu protokolün sonucunu büyük ölçüde etkiler.

Füzyondan sonra, toplam hacmi bir mililitreye getirmek için koklea içeren kuyuya 0.8 mililitre 37 santigrat derece önceden ısıtılmış MSCGM ekleyin. Her koklea için prosedürü tekrarlayın. Her seferinde yeni bir şırınga ve boru kullanarak.

Bol kokleayı 37 santigrat derece hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin ve ortamı haftada üç kez değiştirin. Burada, herhangi bir enjekte edilmiş hücre olmadan bir fare kokleasının başarılı bir şekilde hücreden arındırılması ve dekalsifikasyonu gösterilmektedir. Genel olarak, koklea anatomisi, lekelenme olmadan kalan boşluklarla korunur.

İşte bir koklea iskelesi üzerinde başarılı bir şekilde kültürlenmiş Human Wharton jöle hücrelerinin temsili sonuçları. Koklea boyunca ve dış kemik yüzeyinde bol miktarda lekelenme görülür. Bireysel dönüşlerin daha yakından incelenmesi, decellularizasyon ve dekalsifikasyondan sonra ince koklea yapılarının korunduğunu ve enjekte edilen hücrelerin doğal koklea hücre dışı matrisine bağlandığını ve/veya onunla etkileşime girdiğini ortaya koymaktadır.

Sonraki hücre kültüründe dehücreselleşme de H&E boyama kullanılarak araştırıldı. Decellularize koklea, doğal koklea hücrelerinin hiçbirini içermiyordu, ancak hücre dışı matris kaldığı için Corti organının anatomisinin çoğunu koruyordu. Kültürlenmiş hücrelere enjekte edilen, hücreden arındırılmış hücre dışı matris ile etkileşime giren Corti organı aracılığıyla gözlemlenebilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, hücrelerin hücrelerden arındırılmış bir kokleaya yayılması, koklea önceden hazırlanmışsa ve gerekli araçlar uygun şekilde yerleştirilmişse yaklaşık 10 ila 15 dakika sürebilir. Bu prosedürü denerken, kırılgan olduğu için kokleayı dikkatli bir şekilde kullanmak önemlidir. Kabarcıklar bolluk sırasında sıvı akışını engelleyeceğinden, kokleaya hava girmesini önlemek de önemlidir.

Bu genel prosedür diğer türlerin koklealarına uygulanabilir ve çok çeşitli hücre tipleri de enjekte edilebilir. Spesifik hücre giderme ve dekalsifikasyon süreleri muhtemelen değişecektir, ancak altta yatan kavramlar aynı kalacaktır. Minnesota Üniversitesi'nden Dr. Peter Santi başlangıçta bu protokol için modifiye ettiğimiz hücre çözme tekniğini geliştirdi.

Koklea iskelesi üzerindeki tekniğimizi ve hücre kültürümüzü diğer doku mühendislerinin de kullanımına sunmayı umuyoruz. Bu videoyu izledikten sonra, kültür deneylerinde kullanılmak üzere hücreleri enjekte etmeden önce temporal kemikleri nasıl başarılı bir şekilde izole edeceğinizi, hücreden arındıracağınızı ve kireçten arındıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.