Fare Cochleae iç kulak doku mühendisliği için Decellularizing için bir iletişim kuralı
January 1st, 2018
Bu iletişim kuralının amacı decellularize ve fare cochleae doku mühendisliği uygulamaları için iskele olarak kullanımı için decalcify için etkili bir yöntem göstermektir.
Bu prosedürün genel amacı, iç kulak dokusu mühendisliği uygulamaları için bir iskele kullanmak üzere fare koklealarını hücrelerden arındırmak ve kireçten arındırmak için etkili bir yöntem göstermektir. Bu yöntem, işitsel ve doku mühendisliği alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin, 3D koklea ve hücre dışı matrisin çeşitli bileşenleri kök hücre farklılaşmasını nasıl etkiler? Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacının, hücrelerin duyusal epitel oluşturmak için kokleanın hücre dışı matrisi ile doğrudan nasıl etkileşime girdiğini incelemesini sağlamasıdır.
Temporal kemik izolasyonu ve hücre profüzyon aparatının yalnızca metin açıklamalarına dayalı olarak doğru bir şekilde görselleştirilmesi zor olabileceğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu işleme başlamak için, keskin bir çift cerrahi makas kullanarak kafatasını orta sagital düzlemde ikiye bölün. Ardından, beyin dokusunu kafatasından çıkarın.
Daha sonra kafatasının iç kısmındaki işitme ve vestibüler sinir köklerinin ve dıştan kulak kanalının varlığı yoluyla temporal kemiği tanımlayın. Temporal kemiği kafatasının geri kalanından izole etmek için kafatasını dikkatlice kesin. Daha sonra, ince forsepsleri kulak kanalının açıklığına yaklaşık beş milimetre sokun, böylece uçlar kokleayı delme riski taşımaz.
Bola kemiğini nazikçe kırın, böylece kırılır. İnce forseps kullanarak, bolanın geri kalanını temporal kemikten kaldırın ve kokleanın kemikli labirentini açığa çıkarın. Daha sonra, temporal kemiği kokleanın oval ve yuvarlak pencereleri yukarı bakacak şekilde PBS'ye batırın.
Ultra ince bir forseps çifti kullanarak, stapeslerden geçen stapedial arteri çıkarın. Daha sonra ultra ince forsepslerin bir ucunu arterin geçtiği stapes kemerinden geçirin ve stapesleri nazikçe yukarı doğru kaldırın. Bunu takiben, oval ve yuvarlak pencereleri delin.
Daha sonra, PBS dolgulu 28.5 gauge şırıngaya bağlı olan boruyu oval pencerenin üzerine yerleştirin. Perilenf'i çıkarmak için kokleadan beş dakika boyunca PBS'de iki milimetre% 10 Antibiyotik-Atimikotik ve% 10 Penisilin-Streptomisin bol miktarda dökün. Ardından kalan kas dokusunu ve kemik parçalarını çıkarın ve atın.
Hücrelerden arındırma için, transfer pipetini kullanarak kokleayı nazikçe pipetin içine çekin, böylece kesilen kenarı birkaç milimetre geçer. Ardından, kokleayı %1'lik SDS solüsyonu dolu sintilasyon şişesine boşaltın. Deiyonize su içinde iki mililitre% 1 SDS'yi bir transfer pipeti kullanarak sintilasyon şişesindeki koklea boyunca dolaştırın.
Sintilasyon şişesini bir döndürücüye yerleştirin ve oda sıcaklığında 72 saat boyunca 10 RPM'de dönmesine izin verin. 72 saatlik bir süre boyunca her 24 saatte bir taze, %1'lik SDS solüsyonu ile değiştirin ve solüsyon değişimi sırasında kokleayı havaya maruz bırakmamaya dikkat edin. Bundan sonra, kokleayı aynı sintilasyon şişesinde her biri 30 dakika boyunca DI suyunda üç kez yıkayın.
Bu aşamada, koklea hücrelerden arındırılmalıdır. Dekalsifikasyon için, kalan DI suyunu sintilasyon şişesinden çıkarın ve kokleayı su altında tutmaya yetecek kadar bırakın. Dekalsifikasyona başlamak için, koklea içeren sintilasyon şişesine beş mililitre% 10 EDTA ve DI suyu ekleyin.
Deiyonize su içinde iki mililitre% 10 EDTA'yı bir transfer pipeti kullanarak sintilasyon şişesindeki koklea boyunca dolaştırın. Sintilasyon şişesini döndürücüye geri yerleştirin ve sintilasyon şişesinin oda sıcaklığında 72 saat boyunca 10 RPM'de dönmesine izin verin. %10 EDTA çözeltisini 72 saatlik bir süre boyunca her 24 saatte bir değiştirin.
Solüsyonları değiştirirken kokleanın havaya maruz kalmamasına dikkat edin. Daha sonra kokleayı iki saat boyunca üç kez, her biri PBS ile durulayın. Bu aşamada, koklea kireçten arındırılmalıdır.
Hücreleri infüze etmeden önce, hücresinden arındırılmış ve kireçten arındırılmış kokleayı %5 Karbondioksit, 37 santigrat derece hücre kültürü inkübatöründe en az bir saat inkübe ederek başlayın. Kokleaları çoğaltmak için, herhangi bir kokleanın kurumasını önlemek için her kokleaya bir damla MSCGM ekleyin. Bunları bir transfer pipeti kullanarak 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın.
Oval ve yuvarlak pencereler yukarı bakacak şekilde ultra ince forseps kullanarak kokleayı hassas bir şekilde yönlendirin. Daha sonra, bağlı borulu steril bir 28.5 gauge İnsülin şırıngası kullanarak, 0.2 mililitre yeniden askıya alınmış İnsan Wharton jöle hücrelerini çizin. Daha sonra, sterilize edilmiş ince forseps kullanarak boruyu oval pencerenin üzerine yerleştirin.
Beş dakika boyunca 0.2 mililitre yeniden süspanse edilmiş İnsan Wharton jöle hücreleri ile kokleayı nazikçe ve yavaşça doldurun. Bu bolluk basamağı önemlidir. Koklea yoluyla sıvıların başarılı bir şekilde bollaşması, bu protokolün sonucunu büyük ölçüde etkiler.
Füzyondan sonra, toplam hacmi bir mililitreye getirmek için koklea içeren kuyuya 0.8 mililitre 37 santigrat derece önceden ısıtılmış MSCGM ekleyin. Her koklea için prosedürü tekrarlayın. Her seferinde yeni bir şırınga ve boru kullanarak.
Bol kokleayı 37 santigrat derece hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin ve ortamı haftada üç kez değiştirin. Burada, herhangi bir enjekte edilmiş hücre olmadan bir fare kokleasının başarılı bir şekilde hücreden arındırılması ve dekalsifikasyonu gösterilmektedir. Genel olarak, koklea anatomisi, lekelenme olmadan kalan boşluklarla korunur.
İşte bir koklea iskelesi üzerinde başarılı bir şekilde kültürlenmiş Human Wharton jöle hücrelerinin temsili sonuçları. Koklea boyunca ve dış kemik yüzeyinde bol miktarda lekelenme görülür. Bireysel dönüşlerin daha yakından incelenmesi, decellularizasyon ve dekalsifikasyondan sonra ince koklea yapılarının korunduğunu ve enjekte edilen hücrelerin doğal koklea hücre dışı matrisine bağlandığını ve/veya onunla etkileşime girdiğini ortaya koymaktadır.
Sonraki hücre kültüründe dehücreselleşme de H&E boyama kullanılarak araştırıldı. Decellularize koklea, doğal koklea hücrelerinin hiçbirini içermiyordu, ancak hücre dışı matris kaldığı için Corti organının anatomisinin çoğunu koruyordu. Kültürlenmiş hücrelere enjekte edilen, hücreden arındırılmış hücre dışı matris ile etkileşime giren Corti organı aracılığıyla gözlemlenebilir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, hücrelerin hücrelerden arındırılmış bir kokleaya yayılması, koklea önceden hazırlanmışsa ve gerekli araçlar uygun şekilde yerleştirilmişse yaklaşık 10 ila 15 dakika sürebilir. Bu prosedürü denerken, kırılgan olduğu için kokleayı dikkatli bir şekilde kullanmak önemlidir. Kabarcıklar bolluk sırasında sıvı akışını engelleyeceğinden, kokleaya hava girmesini önlemek de önemlidir.
Bu genel prosedür diğer türlerin koklealarına uygulanabilir ve çok çeşitli hücre tipleri de enjekte edilebilir. Spesifik hücre giderme ve dekalsifikasyon süreleri muhtemelen değişecektir, ancak altta yatan kavramlar aynı kalacaktır. Minnesota Üniversitesi'nden Dr. Peter Santi başlangıçta bu protokol için modifiye ettiğimiz hücre çözme tekniğini geliştirdi.
Koklea iskelesi üzerindeki tekniğimizi ve hücre kültürümüzü diğer doku mühendislerinin de kullanımına sunmayı umuyoruz. Bu videoyu izledikten sonra, kültür deneylerinde kullanılmak üzere hücreleri enjekte etmeden önce temporal kemikleri nasıl başarılı bir şekilde izole edeceğinizi, hücreden arındıracağınızı ve kireçten arındıracağınızı iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, doku mühendisliği uygulamalarında iskele olarak kullanılmak üzere fare koklearının etkili bir şekilde desellizasyonu ve dekalsifikasyonu yöntemini gösterir. Bu teknik, araştırmacıların hücreler ile koklear hücre dışı matris arasındaki etkileşimi incelemelerine olanak tanır ve bu da duyusal epitel oluşumu anlamında çok önemlidir.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Doku Mühendisliği
- İşitme Araştırması
- Hücresel Etkileşimler
Arka Plan
- Desellizasyon ve dekalsifikasyon, iskele oluşturmak için gereklidir.
- Koklear yapıyı anlamak, iç kulak araştırmaları için hayati önem taşır.
- Kök hücre farklılaşması, hücre dışı matris tarafından etkilenir.
- Görsel yöntemler, karmaşık prosedürlerin anlaşılmasını artırır.
Çalışmanın Amacı
- Koklear iskele hazırlaması için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Koklear hücre etkileşimleri üzerinde araştırmayı kolaylaştırmak.
- İşitme ve doku mühendisliği alanlarındaki bilgiyi geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Zamansal kemiğin kafatasından izole edilmesi.
- Koklearların desellizasyonu.
- İskele hazırlaması için dekalsifikasyon süreci.
- Prosedürün açıklığa kavuşturulması için görsel gösterim.
Ana Sonuçlar
- Fare koklearlarının başarılı bir şekilde desellizasyonu ve dekalsifikasyonu.
- Hücre-hücre dışı matris etkileşimleri hakkında daha gelişmiş anlayış.
- Duyusal epitel oluşumu çalışmalarında iyileştirilmiş yöntemler.
- Görsel yardımcıların prosedürel anlamayı önemli ölçüde artırdığı.
Sonuçlar
- Bu yöntem, iç kulak araştırmaları için değerli bir araç sağlar.
- Koklear iskelelerde kök hücre davranışının incelenmesi için yeni yollar açar.
- Görsel gösterimler, karmaşık biyolojik prosedürler için çok önemlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to generate physiologically relevant cochlear scaffolds for studying stem cell interactions with native extracellular matrix, supporting target validation in auditory regenerative medicine. By preserving extracellular matrix architecture while removing cellular components, the method provides a defined system to de-risk mechanistic hypotheses about matrix-mediated cell behavior in inner ear tissue engineering. The approach supports preclinical model development for hearing loss therapeutics by allowing controlled evaluation of cell-scaffold dynamics in a 3D disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding extracellular matrix influence on stem cell differentiation and sensory epithelium formation.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets by isolating matrix-specific effects from cellular variables in a controlled scaffold system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, reproducible biological systems for quantitative assessment of cell invasion, proliferation, and matrix interaction.
- Operational Value: Supports assay scalability and platform reuse through consistent decellularization and decalcification outputs across multiple cochleae.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system continuity from discovery through preclinical validation by maintaining native cochlear architecture.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by enabling longitudinal observation of cell-scaffold interactions over 30-day culture periods.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing extracellular matrix scaffolds post-isolation, enabling hypothesis testing in lead identification stages before preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by allowing direct study of cell-extracellular matrix interactions without confounding cellular debris.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized scaffold preparation that preserves structural integrity for reliable compound or cell evaluation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via cell invasion depth, proliferation rates, and matrix interaction patterns observable through staining and imaging.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining organ of Corti structure, enabling extrapolation to in vivo-like environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable scaffold platform applicable across cell types and species, reducing redundant isolation efforts in auditory tissue engineering programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in extracellular matrix-mediated cell behavior.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined decellularization (72-hour SDS rotation) and decalcification (72-hour EDTA rotation) protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling early assessment of matrix-dependent cell responses, reducing late-stage biological risk in auditory regenerative programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of stem cell or matrix-modulating candidates based on scaffold-based functional readouts.
Implementation Considerations
- Required expertise in microsurgical temporal bone isolation and sterile cell perfusion techniques.
- Instrumentation needs include ultra-fine forceps, transfer pipets, rotators, and sterile syringe perfusion systems.
- Cross-team standardization requires adherence to solution exchange schedules and air-exposure avoidance during decellularization/decaltification.
- Adaptation considerations include species-specific timing adjustments and validation of scaffold integrity for alternative cell types beyond Wharton's jelly-derived MSCs.
- Practical limitations include cochlear fragility necessitating careful handling to prevent structural damage during isolation and perfusion.
