Name: Sentez ve rutenyum tabanlı mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Öğrenin, mitokondrial kalsiyum alımını inhibe eden rutenyum 360 analogunun sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu. Bu yöntem, ticari olarak mevcut inhibitörlerden 10 kat daha etkili saf ve güçlü bir ürün sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Cornell Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Bu eser Cornell Merkezi malzemeleri araştırma paylaşılan Tesisatı, NSF MRSEC programı (Grant DMR-1120296) ile desteklenen için kullanın yaptı. S.R.N. destek bir NSF yüksek lisans araştırma bursu (Grant DGE - 1650441) ve Dr Dave Holowka kalsiyum deneyler hakkında yardım almak için kabul eder. Herhangi bir görüş, bulgular ve sonuç ya da öneriler bu malzeme ifade yazarlar (s) ve mutlaka Ulusal Bilim Vakfı görüşlerini yansıtmamaktadır.

Not: Konsantre asitler ve bazlar bu sentezinde kullanılır. Mühendislik kontrolleri (duman hood) ve koruyucu gözlük, eldiven, önlük, tam uzunlukta pantolon ve kapalı-toe ayakkabı da dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanımı gibi tepki yerine getirirken tüm uygun güvenlik uygulamaları kullanın.
 1. hazırlanması [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (μ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>sentez [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 12 <ol>RuCl 3 · n H 2 O <li>erimesi 1.00 g (% 40 ağırlık Ru, 4.1 mmol) H 2 O. serin bir buz banyosu 0 ° C'de koyu kahverengi çözümü 5 ml. 11 mL (0,23 mol) % 80 hidrazin hidrat çözüm dropwise bir şekilde ekleyin. İlk tepki kahverengi bir çözümde kaynaklanan evrim gaz ile güçlü olacak. 16 h için oda sıcaklığında karıştırın elde edilen çözüm izin; nihai çözüm koyu kırmızı olacak 
		Dikkat: Hidrazin akut toksik ve kanserojen. Ayrıca, susuz Bu reaktif patlayıcı biçimleridir. Her zaman olduğu gibi uygun KKE ve duman davlumbaz işlerken kullanın. Bu çözümler kuruluk için konsantre değil.</li>
		<li>Bu, yaklaşık 5-10 mL konsantre HCL pH 2 ayarlamak için ekleyin. Bu noktada, belgili tanımlık eriyik-ecek var olmak sarı-kahverengi renkte.</li>
		<li>Bu çözüm karıştırarak 1-2 h için ise 105 ° c ısı. Sarı bir katı eriyik dışarı çökelti. Zaman artık gözle görülür formları çökelti, ısı kaldırmak.</li>
		<li>Her etanol ve Dietil eter oda sıcaklığına kadar serin ve 10 dk. toplamak için vakum filtrasyon ve yıkama ile 5 mL sarı katı bir 0 ° C buz banyosunda koyun reaksiyon karışım izin verin.</li>
		<li>15-25 ml sıcak su ham ürün tamamen erimesi. 10 mL konsantre HCl bir çözüm bir filtre şişesi içinde bir buz banyosu yerleştirerek chill. Sarı çözüm soğutulmuş HCl çözüm içine soluk sarı saf sağlam bir yağış ikna etmek için filtre. Bu çökelti filtre ve yıkama 5 mL ile her 0,5 M HCl, etanol ve eter.</li>
		<li>Bileşik kullanarak karakterize IR spektroskopisi. By 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 ve 801 cm -1 germe frekanslarda tanımlaması saflık doğrulayın. 2069 cm -1, ortak bir küçük kirlilik [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3 ' e atanır.</li>
	</ol></li> <li>[(OH 2) (NH 3) 4 (μ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 sentezi <ol><li>100 mg (0,34 mmol) dağıtılması [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 50 mL / 1 M NH 4 OH 200 mL ağır duvar yuvarlak popolu basınç gemi içinde. Gevşek bir tıpa ile balonun kap ve 75 ° C 6 h. Kaldır ısı için tepki karisimin ısı ve koyu yeşil çözüm verim 4 gün için oda sıcaklığında karıştırın. 
		Dikkat! Basınç birikmesi mühürlü gemi sonuçlarında Isıtma. Uygun basınç güvenli cam kullandığınızdan emin olun. Bu reaksiyon, gaz halinde olan yakıtlar NH 3 kaybını en aza indirmek için gemi sızdırmazlık amaçlı var. Bu nedenle, gevşek aşırı baskı yayın için izin vermek için tıpa yerleştirin.</li>
	</ol></li> <li>Arıtma katyon değişim Kromatografi tarafından <ol><li>25 mL kabı içinde 5 g katyon değişim reçine askıya alma (10 ml 0.1 M Örneğin, kafes (H + form) Dowex 50WX2 200-400 HCl.</li>
		<li>50 mL çözelti su deposu ile yapıştırılmış bu Bulamaç bir 10 mL sütununa (10 mm çap, 15 cm yükseklik) yükleyin. Eluate renksiz olana reçine ile yaklaşık 20-30 mL 0.1 M HCL, yıka.</li>
		1.2.1. adımda izole yeşil tepki çözüm <li>dönün. Bu, konsantre HCl pH 2, hangi noktasında çözüm renk değiştirir Brown'a ayarlamak için çözüm.</li>
		<li>Bu acidified çözüm adım 1.3.2 yavaşça üzerine reçine pipetting tarafından hazırlanan katyon değişim reçine sütuna yerleştirin. Tamamen drenaj ve çözüm yüklemeye devam eluate izin ver. Tüm çözüm eklenene kadar bu işlemi yineleyin. Reçine üst koyu kahverengi/siyah olacak. Reçine hacmindeki biraz azalacak.</li>
		<li>Reçine üst kapsayacak şekilde kullanım cam boncuk. Bunlar-ecek önlemek reçine yeni çözümler eklendiğinde rahatsız.</li>
		<li>20 mL 1 M HCL sütunla elute.</li>
		<li>Elute sütun ile bir artan 1,5 M HCl konsantrasyonu (&#8776; 50 mL). Sarı bir çözüm sütun gelmeye başlayacak. 2 m HCl konsantrasyonu artırmak ve devam eluate renksiz olana eluting veya bir çok soluk yeşil-sarı. 150-200 mL toplam hacmi bu işlem için gerekli olacak.</li>
		<li>2.5 m (20-50 mL) HCl konsantrasyonu artırmak. Kesirler testi tüpler olarak eluate toplamak. 3 M HCl artırın. Ürün sütundan bir yeşil-kahverengi çözüm olarak elute. Kırmızı-kahverengi kesir de uzakta-in sütun gelmeye başlayabilir. Bu kesirler oksitlenmiş rutenyum kırmızı kirleri olduğundan, yeşil-kahverengi kesirler ile havuz değil.</li>
	</ol></li> <li>Karakterizasyonu ve doğrulama saflık [(OH 2) (NH 3) 4 (μ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>kesirler Test Adım 1.3.8. UV-VIS spektroskopisi tarafından. Bu görevi gerçekleştirmek için belirli bir kısmını 100 µL 3 M NH3 2 mL ekleyin ve UV-VIS spektroskopisi tarafından analiz. Saf ürün içeren kesirleri 360'a büyük Absorbans grubu olacak nm ve daha az yoğun Absorbans 600 nm. 480 veya 533 nm Absorbans oksitlenmiş rutenyum kırmızı ve rutenyum kırmızı kirleri, gösterge sırasıyla.</li>
		<li>Saf ürün içeren kesirleri havuz ve kuruluk çözümü tarafından döner buharlaşma buharlaşır. Ürün bir yeşil-kahverengi katı izole olacak. Verimleri genellikle 5-15 mg (% 10-20 verim) sırasına bulunmaktadır. Tek kristalleri, x-ışını kırınımı için uygun etanol buharı difüzyon bahçedeki sulu çözümler içine tarafından elde edilebilir.</li>
		Saflık, doğrulamak için <li>UV-VIS spektroskopisi bir çözüm pH 7.4 fosfat tamponlu tuz (PBS) tarafından bileşik analiz. Saflık-var değerlendirildi 360 yoğunluğu oranı alarak nm ve 600 nm tepeler. Bu oran saf bir bileşiği 31'dir. Saf olmayan bileşikler için oranı daha küçük olur.</li>
		<li>Katı hal örnek tarafından IR spektroskopi analiz. Tanılama bantları 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 ve 815 cm -1 vardır. Ortak kirlilik bantları 1762 cm -1 ve 1400 cm -1 de görülür, NH karakteristik 4 CL rutenyum kırmızı bantları 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 ve 800 cm -1 belirlenebilir.</li>
	</ol></li> <li>Mitokondrial kalsiyum alımını inhibisyon Floresans spektroskopisi tarafından değerlendirilmesi dikkat! Memeli hücreleri aşağıdaki yordamları kullanın. İş yürütülen biyolojik güvenlik seviye için 2 (BSL2) araştırma sertifikalıdır uygun laminar akış davlumbaz içinde. 
	&#8203; Not: [(OH 2) (NH 3) 4 (μ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 atıfta [Ru] Bu bölümde <ol><li>arabelleğe alınmış olun glikoz içeren tuzlu çözüm (BGSS) olarak tahlil medya. BGSS bir çözümdür oluşan 110 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 5 mM sodyum süksinat, 30 µM etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N &#39;, N &#39;-tetraacetic asit (EGTA). EGTA dışında her şeyi birleştirmek, pH 7.4 için ayarlayın. EGTA ekleyin ve pH 7.4 için yeniden ayarlayabilirsiniz. Tahlil medya için 50 mL 0.5 mL 1 mg/mL glikoz ekleyin.</li>
		<li>Kültür HeLa hücreleri 500 cm 2 Petri yemeklerinde Dulbecco &#39; s % 10 fetal sığır serum (FBS) ile % 5 CO 2 tohum tarafından bir 100 mm Petri kabına büyüyen 37 ° c yükseltmek HeLa hücreleri de oksijen bir kuluçka ile modifiye kartal orta (DMEM) Onları bir 500 cm 2 Petri içinde. 115 mL büyük tabak içinde toplam medya birimdir. Her büyük çanak yaklaşık 18 milyon hücre, iki Floresans spektroskopisi deneyler için yeterli verim.
		<ol><li>Büyümek hücreleri % 90-95 ulaşana kadar confluency. Medyayı çıkarın ve 15 mL pH 7.4 PBS hücrelerle durulayın. PBS içinde 15 mL 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin ve hücreleri ayırmak 10 dakikadır kuluçkaya. Hücreleri alt Şahin tüpler yuvarlak 14 mL transfer</li></ol></li> <li>Say trypan mavi ve bir hemasitometre ile ters bir mikroskop kullanarak hücreleri ve hücre ve toplam 7.5 milyon hücre 1,8 mL birim başına ulaşması için gerekli ortam hacmi hesaplamak Orta. Hücreler için 5310 × g. Decant süpernatant, 10 dk santrifüj kapasitesi ve BGSS hesaplanan hacmi ekleyin. Hücreleri nazikçe resuspend.
		<ol><li>Bu tahlil için Dimetil sülfoksit (DMSO), 1 mM kalsiyum yeşil-5N H 2 O ve 10 mM CaCl 2 H 2 o [Ru] hisse senedi çözümlerinde, 40 mM digitonin hisse senedi çözümler saf suda hazırlanan hazırlamak, 1-3 mM arasında değişen olabilir. 
			&#8203; Not: kalsiyum yeşil-5N ışığa duyarlı. Saklamak karanlıkta ve pozlama ışık en aza indirgemek.</li>
		</ol></li> <li>Fluorimeter 506 nm ve okuma 532, emisyon heyecanlandırmak için kurulum nm ile 37, kontrollü küvet tutucu ° C. hazırlayın bir heyecan bar veya tekerlek, 1,8 mL hücre süspansiyon 1.5.2 yukarıda, 1.8 µL digitonin çözüm, 3.6 üzerinden bir akrilik küvet ve #181; L kalsiyum yeşil-5N (çözüm) ve 9 µL [Ru] (1 mM hisse senedi çözüm, 5 µM son konsantrasyonu için). Hücreler fluorimeter 15dk için kuluçkaya.
		<ol><li>Veri ham emme yerine uyarma/emisyon oranı olarak okuyun. Bu uygulama ışık kaynağı şiddeti dalgalanmalar ile ilişkili hatalar en aza indirir.</li>
			<li>Hücreleri yanıt CaCl 2 ek etkisini ölçmek için [Ru] yokluğunda ilk örnek analizi gerçekleştirmek.</li>
			<li>Begin analiz 1.5.4 içinde açıklanan ayarları ile fluorimeter. Bir sabit emisyon temel kurmak için yaklaşık 2 dakika bekleyin ve sonra 1.8 µL CaCl 2 (10 µM son konsantrasyonu) ekleyin. Emisyon yoğunluğu hemen CaCl 2 eklenmesi artacak ve kalsiyum iyonları mitokondri girerken sonra dakika boyunca çürüme. Çürüme işlemini tamamlayana kadar bekleyin (&#8776; 5 dk). Mitokondrial kalsiyum alımını yanıt [Ru] tedavi değil hücre belirlemek için ek kalsiyum boluses eklemek.</li>
		</ol></li> <li>1.5.4.3 içinde yukarıda açıklandığı gibi başka bir küvet içinde deneme tekrar 5 mikron [Ru], içeren. İnhibitörü huzurunda emisyon yoğunluğu artırmak ama değil çürük. Bu gözlem ettiğinizi mitokondrial kalsiyum alımı bloke.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enjoy+the+trip%3A+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li>
<li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+calcium+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li>
<li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+homeostasis+as+potential+target+for+mitochondrial+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine.</a> Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).</li>
<li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li>
<li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).</li>
<li>Kamer, K. J., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).</li>
<li>Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport+by+an+oxo-bridged+dinuclear+ruthenium+ammine+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex.</a> Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).</li>
<li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/244437951_The_component_of_ruthenium_red_responsible_for_inhibition_of_mitochondrial_calcium_ion_transport_Spectra_electrochemistry_and_aquation_kinetics_Crystal_structure_of_m-O-HCO2NH34Ru2Cl_3">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li>
<li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-bridged+Dinuclear+Ruthenium+Amine+Complex+Specifically+Inhibits+Ca2%2B+Uptake+into+Mitochondria+in+Vitro+and+in+Situ+in+Single+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes.</a> J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360%2C+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li>
<li>Allen, A. D., Senoff, C. V. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v67-220#.WW5AYYjyvIU">Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III).</a> Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Deak, A. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25631032">Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake.</a> Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 sentezlenmiş [Ru (NH3)5Cl] Cl2, iyi bilinen bir ruthenium(III) olabilir malzeme, bu yordamda açıklandığı gibi başladı. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 sentezi kolayca küçük zorlukla elde edilir. 16 h için RuCl3 hidrazin içinde karıştırma sonra hidrat, çözüm pH HCl ile 2 değeri için ayarlanmalıdır. PH b...

Mitokondrial kalsiyum enerji üretimi ve Apoptozis dahil olmak üzere normal hücre işlevi için kritik süreçlerin bir dizi için anahtar bir düzenleyicisidir. 1 , 2 , 3 mitokondrial kalsiyum uniporter (MCU), iç mitokondrial membran üzerinde bulunduğu bir iyon taşıyıcı protein kalsiyum iyonları akını mitokondri düzenlemektedir. 4 , 5 , 6 MCU kimyasal inhibitörleri çalışmaları bu taşıma protein ve mitokondrial kalsiyum hücresel roller ve işlev çalışmaya devam değerli araçlardır. Bileşik [(HCO2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, MCU bildirilen Kd değeri olan 24 µM.7 için tek bilinen seçici inhibitörleri biridir Bu karmaşık ortak bir kirlilik ticari formülasyonları ve rutenyum kırmızı (RuRed), bir triruthenium di-μ-oxo bulunan ,8,9,10 köprü hexacation Formula [(NH3) 5 Aynı zamanda kalsiyum alımını inhibitörü olarak kullanılan (μ-O) Ru Ru (NH3)4(μ-O) Ru (NH3)5)]6 +. Ru360 ticari olarak mevcut olmasına rağmen çok pahalıya mal olur. Ayrıca, sentez ve Ru360 yalıtım, meydan zor arıtma işlemleri ve belirsiz karakterizasyon yöntemleri tarafından.
Son zamanlarda bir Ru360 analog, [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5erişmek için alternatif prosedürler bildirdin. 11 bu bileşik ile yüksek afinite, Ru360 için benzer MCU engeller. Bu protokol için [Ru (NH3)5Cl] Cl2den başlar bizim en etkili sentezi olan bu bileşik anlatacağız. Arıtma kesinlikle asidik katyon değişim reçine kullanarak ürün ile birlikte ortak tuzaklar bu yordam için detaylı. Ayrıca, karakterizasyonu ve bileşik saflık değerlendirme yöntemleri sunmak ve mitokondrial kalsiyum alımını engelleme onun etkinliğini test etmek için basit bir yaklaşım betimlemek.

<table><tbody><tr><td>Rutenyum Triklorür hidrat</td><td>Basınç Kimyasalı</td><td>3750</td><td></td></tr><tr><td>Konsantre hidroklorik asit</td><td>J.T. Baker</td><td>9535</td><td></td></tr><tr><td>Konsantre amonyum hidroksit</td><td>Mallinckrodt Kimyasal İşler</td><td>A669C-2 1</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50 WX2 200-400 Mesh</td><td>Alfa Aesar</td><td>13945</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Yeşili 5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Aldrich</td><td>260746</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Aldrich</td><td>471267</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>USB</td><td>20598</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fluka</td><td>54466</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Süksinat</td><td>Alfa Aesar</td><td>33386</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Aldrich</td><td>G5000</td><td></td></tr><tr><td>200 Yuvarlak tabanlı şişe</td><td>ChemGlass</td><td>CG-1506-14</td><td></td></tr><tr><td>Cam tıpa</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3000-05</td><td></td></tr><tr><td>10 mm x 15 cm rezervuarlı cam kolon</td><td>Özel - Chemglass sütunlarına benzer</td><td>CG-1203-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı Şahin tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>500 cm2 petri kapları</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Hematitometre</td><td>Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Akrilik Küvetler</td><td>VWR&nbsp;</td><td>58017-875</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spektrometresi</td><td>Agilent Model Cary 8454&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektroflorimetre</td><td>SLM Model 8100C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR spektrometresi</td><td>Bruker Hyprion FTIR ATR eki</td><td></td><td></td>ile</tr><tr><td>Santrifüj</td><td>ALC Modeli PM140R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters ışık mikroskobu</td><td>VWR ve nbsp;</td><td>89404-462</td><td></td></tr></tbody></table>

sentez ve rutenyum tabanlı mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü değerlendirilmesi

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Sentez ve bir mitokondri kalsiyum alımını inhibitörü, [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)]5 +arıtma ayrıntı. Bu bileşik bir en iyi duruma getirilmiş sentez [Ru (NH3)5Cl] Cl2 den 1 M NH4OH yeşil bir çözüm verimli kapalı bir kap içinde başlar. Arıtma katyon değişim Kromatografi ile gerçekleştirilir. Bu bileşik ile karakterize olan ve saf olmak UV-VIS ve IR spektroskopisi tarafından doğrulandı. Mitokondrial kalsiyum alımını inhibitör özellikleri permeabilized HeLa hücreleri Floresans spektroskopisi tarafından değerlendirilir.

Bu yöntem bir sentez [Ru (NH3)5Cl] Cl2başlayarak mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 açıklar bir iyi bilinen ruthenium(III) başlangıç materyali. [Ru (NH3)5Cl] CL2 IR spektroskopisi, 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1ve 798 cm-1 (şekil 1</str...

Bir protokol, arıtma, malzemelerin ve rutenyum tabanlı inhibitörü olan mitokondrial kalsiyum alımı için sunulmaktadır. Permeabilized memeli hücrelerinde onun etkinliğini değerlendirmek için bir yordam gösterilmiştir.

Sentez ve rutenyum tabanlı mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü değerlendirilmesi

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

Sentez ve saflaştırmanın genel amacı, ticari olarak temin edilebilen rutenyum 360'tan 10 kat daha etkili olan mitokondriyal kalsiyum alım testlerinde kullanılan bir rutenyum 360 analogunu nispeten kolay bir şekilde üretmektir. Bu yöntem, saf bir mitokondriyal kalsiyum alımı inhibitörü sağlayarak mitokondriyal kalsiyum biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nihai ürünün hem çok güçlü hem de saf olmasıdır.Bu yönteme yeni olan kişiler, arınma zaman ve sabır gerektirdiği için mücadele edebilir. Yapımcıyı göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Sarah Nathan olacak. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi pentaamin kloro rutenyum diklorür sentezi ile başlayın.100 miligram pentaamin kloro rutenyum diklorürü, 200 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişede 50 mililitre bir molar amonyum hidroksit çözeltisi içinde çözün. Şişeyi bir cam tıpa ile gevşek bir şekilde kapatın ve reaksiyon karışımını altı saat boyunca 75 santigrat derecede ısıtın. Sızdırmaz bir kabın ısıtılması, basınç oluşumuna neden olur.Fazla basıncın serbest bırakılmasını sağlamak için cam tıpanın gevşek olduğundan emin olun. Altı saat sonra reaksiyon karışımını ocaktan alın. Ve koyu yeşil bir çözelti elde etmek için dört gün oda sıcaklığında karıştırın.Elde edilen trans-diaqua okto amin mu-okso dirutenyum pentaklorürü katyon değişim kromatografisi ile saflaştırmak için, önce 25 mililitrelik bir beherde 10 mililitre 0.1 molar HCL içinde beş gram ağ katyon değişim reçinesini askıya alın. Bu bulamacı 50 mililitrelik bir solvent haznesi ile yapıştırılmış 10 mililitrelik bir sütuna yükleyin. Reçineyi, elute renksiz olana kadar yaklaşık 20 ila 30 mililitre 0.1 molar HCL ile yıkayın.Daha sonra, PH'ı ikiye ayarlamak için önceden izole edilmiş yeşil reaksiyon çözeltisine konsantre HCL ekleyin, bu noktada çözelti rengi kahverengiye döner. Bu asitleştirilmiş çözeltiyi, reçinenin üzerine hafifçe pipetleyerek katyon değiştirici reçine kolonuna yükleyin. Elute'un tamamen boşalmasına izin verin ve çözeltiyi yüklemeye devam edin.Çözümün tamamı eklenene kadar bu işlemi tekrarlayın. Reçinenin üst kısmı koyu kahverengi veya siyah olacaktır. Reçine hacim olarak biraz azalacaktır.Daha sonra, yeni çözeltiler eklendiğinde reçinenin bozulmasını önlemek için reçinenin üstünü cam boncuklarla kaplayın. Sütunu 20 mililitre bir molar HCL ile yükseltin. Daha sonra kolonu 50 mililitre 1.5 molar artmış HCL konsantrasyonu ile elüte edin.Sütundan sarı bir çözelti çıkmaya başlayacaktır. Daha sonra HCL konsantrasyonunu iki molar ile arttırın ve 150 ila 200 mililitre ile elüsyona devam edin. Eluant çok soluk bir sarı olarak başlayacak ve parlak sarıya dönecektir.Sütundan gelen eluant tekrar çok soluk olana kadar bekleyin. Bu adımda sabır çok önemlidir. Eluant çok soluk olmalı.HCL konsantrasyonunu 2,5 molar kısma kadar arttırın. Eluantı test tüplerinde fraksiyonlar halinde toplayın. Son olarak, konsantrasyonu üç molar HCL'ye yükseltin.Ürün, kolondan yeşil-kahverengi bir çözelti olarak çıkacaktır. Kırmızı-kahverengi bir fraksiyon da sütundan çıkmaya başlayabilir. Bu fraksiyonlar rutenyum kahverengi safsızlıklarıdır ve yeşil-kahverengi fraksiyonlarla bir araya getirilmemelidir.Tüm fraksiyonları UV-Vis spektroskopisi ile test etmek için, belirli bir fraksiyonun 100 mikrolitresini iki mililitre üç molar amonyağa ekleyin. Daha sonra karışımı UV-Vis spektroskopisi ile analiz edin. Saf ürün içeren fraksiyonlar, 360 nanometrede büyük bir emicilik bandına ve 600 nanometrede daha az yoğun bir emiciliğe sahip olacaktır.480 nanometredeki absorbans, rutenyum kahverengisinin göstergesidir ve 533 nanometredeki absorbans, rutenyum kırmızısı safsızlıklarını temsil eder. Diğer safsızlıklar 300 nanometreden daha az absorbansta görülür. Saf ürün içeren havuz fraksiyonları ve IR spektroskopisi ile katı haldeki numunenin analizinden önce döner buharlaştırma ile çözeltiyi kuruyana kadar buharlaştırın.Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi floresan spektroskopisi ile mitokondriyal kalsiyum alım inhibisyonunu değerlendirmeye devam edin. Saflaştırılmış trans-diaqua okto amin mu-okso dirutenyum pentaklorürün UV-Vis spektrumları, sırasıyla 360 nanometre ve 600 nanometrede majör ve minör absorpsiyonlar ile karakterize edilir. Tersine, saf olmayan bir karışım, rutenyum kırmızısı safsızlıklarından 533 nanometrede ve başlangıç malzemesinden 275 ila 300 nanometrede absorpsiyon bantları gösterir.Kızılötesi spektroskopi kullanılarak katı hal karakterizasyonu, aminlerden beklenen gerilmelere sahiptir. Rutenyumun yanı sıra, oksijen rutenyum 850 ters santimetrede gerilir. Kalsiyuma duyarlı bir floresan boya ve trans-diaqua okto amin mu-okso dirutenyum pentaklorür ile muamele edilen permeabalize HeLa hücreleri, mitokondriye kalsiyum alımının inhibisyonunu gösterir.Prosedürü denerken, kesirlerin tamamen eline geçmesine izin vermeyi unutmamak önemlidir. Sabır saf bir ürün verecektir. Bu videoyu izledikten sonra, bu güçlü rutenyum 360 analogunun nasıl sentezleneceğini, saflaştırılacağını ve karakterize edileceğini iyi anlamalısınız.Mitokondriyal kalsiyum seviyeleri, biyoenerjetik ve kontrollü hücre ölümü dahil olmak üzere çok çeşitli hücreler arası süreçleri düzenler. Bu yöntemden üretilen inhibitör, mitokondriyal kalsiyum biyolojisinin diğer biyolojik süreçlere aracılık etmedeki rolünü anlamak için yapılan çalışmalarda uygulanabilir. Konsantre asit ve bazlarla çalışmanın aşındırıcı olduğunu ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman uygun KKD giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

synthesis-evaluation-ruthenium-based-mitochondrial-calcium-uptake

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bu protokol, mitokondriyal kalsiyum akıları floresan görüntüleme ile gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem açıklanır. Yöntemi seçici mitokondri ifade dairesel permutated bir çift uyarma YFP tabanlı oranlı metrik kalsiyum sensör (oranlı metrik pericam-mt) yararlanır.

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm...

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

Bu videoda, izole mitokondride mitokondriyal kalsiyum alımını ölçmek için plaka okuyucu tabanlı bir test açıklanmaktadır. Tahlil, mitokondriyal kalsiyum alımının ve aşırı kalsiyum yükünün kinetiğini incelemek için kalsiyuma duyarlı bir floresan boyanın floresan sinyalini analiz eder.

Mitokondriyal Kalsiyum Alım Testi: İzole Mitokondride Kalsiyum Alımını Ölçmek İçin Plaka Okuyucu Tabanlı Bir Yöntem

Bu videoda, kültürlenmiş hücrelerde mitokondriyal kalsiyum alımını ölçmek için konfokal mikroskopi görüntülemeye dayalı bir test açıklanmaktadır. Test, geçirgenleştirilmiş kültürlenmiş hücrelerdeki mitokondriyal kalsiyumu ölçmek için kalsiyuma duyarlı floresan boya Rhod-2 /'yi kullanır.

Kültürlenmiş Hücrelerde Mitokondriyal Kalsiyum Alımını Ölçmek için Kalsiyum Akışı Testi

Rutenyum fosfin kompleksleri yaygın olarak sıvılaştırma homojen katalitik reaksiyonlar için kullanılmaktadır. N -triphos ligand N (CH2 PPh 2) 3 taşıyan yeni üç dişli rutenyum komplekslerinin bir dizi sentezi rapor edilmiştir. Buna ek olarak, levulinik asit ile dihidrid Ru- N -triphos kompleksinin stoikiometrik reaksiyon tarif edilmiştir.

Rutenyum bir Serisi Sentezi, Karakterizasyonu ve Tepkime<em&gt; K</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; Kompleksi

Mitokondri onları sitozolik Ca şekillendirmek için 2+ hücre içinde sinyal sağlayan (2+ Ca) kalsiyum tecrit kendi iç zarı (Δ Ψm) arasında elektrokimyasal potansiyeli kullanabilir. Floresan boyalar ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler eş zamanlı olarak ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m için bir yöntem tarif eder.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +incelemek için bir yöntemi açıklamak için bu protokolü amaçlamaktadır - mitokondrial SH-SY5Y izole mitokondri şişme adım adım hücreleri tetikledi.

Mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi tahlil ve Ca2 +-mitokondrial şişme tahlil tetiklenen

Burada, iki protokol mitokondrial Ca2 + akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için mevcut. İzole mitokondri için biz bir plaka okuyucu tabanlı Ca2 + alma detaylı tahlil Ca2 + hassas kullanarak boya kalsiyum yeşil-5N. Kültürlü hücreler için Ca2 + boya Rhod-2/AM kullanarak bir confocal mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır.

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Bu proktokol, astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.

Genetik Olarak Kodlanmış Ca2+ Göstergeleri (GECI'ler) Kullanarak Astrositlerde ve Nöronlarda Mitokondriyal Ca2+ Alımı Görüntüleme

Metabolik adaptasyon, farklılaşmayı, kalıcılığı ve sitotoksisiteyi belirlediği için T hücreleri için temeldir. Burada, ex vivo sitokin farklılaşmış insan primer T hücrelerinde mitokondriyal solunumu izlemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Sitokin Diferansiye İnsan Primer T Hücrelerinde Mitokondriyal Solunumun Gerçek Zamanlı İzlenmesi

Öğrenin, mitokondrial kalsiyum alımını inhibe eden rutenyum 360 analogunun sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu. Bu yöntem, ticari olarak mevcut inhibitörlerden 10 kat daha etkili saf ve güçlü bir ürün sunar.

Sentez ve rutenyum tabanlı mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet