Sentez ve rutenyum tabanlı mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü değerlendirilmesi

Sentez ve saflaştırmanın genel amacı, ticari olarak temin edilebilen rutenyum 360'tan 10 kat daha etkili olan mitokondriyal kalsiyum alım testlerinde kullanılan bir rutenyum 360 analogunu nispeten kolay bir şekilde üretmektir. Bu yöntem, saf bir mitokondriyal kalsiyum alımı inhibitörü sağlayarak mitokondriyal kalsiyum biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nihai ürünün hem çok güçlü hem de saf olmasıdır.

Bu yönteme yeni olan kişiler, arınma zaman ve sabır gerektirdiği için mücadele edebilir. Yapımcıyı göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Sarah Nathan olacak. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi pentaamin kloro rutenyum diklorür sentezi ile başlayın.

100 miligram pentaamin kloro rutenyum diklorürü, 200 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişede 50 mililitre bir molar amonyum hidroksit çözeltisi içinde çözün. Şişeyi bir cam tıpa ile gevşek bir şekilde kapatın ve reaksiyon karışımını altı saat boyunca 75 santigrat derecede ısıtın. Sızdırmaz bir kabın ısıtılması, basınç oluşumuna neden olur.

Fazla basıncın serbest bırakılmasını sağlamak için cam tıpanın gevşek olduğundan emin olun. Altı saat sonra reaksiyon karışımını ocaktan alın. Ve koyu yeşil bir çözelti elde etmek için dört gün oda sıcaklığında karıştırın.

Elde edilen trans-diaqua okto amin mu-okso dirutenyum pentaklorürü katyon değişim kromatografisi ile saflaştırmak için, önce 25 mililitrelik bir beherde 10 mililitre 0.1 molar HCL içinde beş gram ağ katyon değişim reçinesini askıya alın. Bu bulamacı 50 mililitrelik bir solvent haznesi ile yapıştırılmış 10 mililitrelik bir sütuna yükleyin. Reçineyi, elute renksiz olana kadar yaklaşık 20 ila 30 mililitre 0.1 molar HCL ile yıkayın.

Daha sonra, PH'ı ikiye ayarlamak için önceden izole edilmiş yeşil reaksiyon çözeltisine konsantre HCL ekleyin, bu noktada çözelti rengi kahverengiye döner. Bu asitleştirilmiş çözeltiyi, reçinenin üzerine hafifçe pipetleyerek katyon değiştirici reçine kolonuna yükleyin. Elute'un tamamen boşalmasına izin verin ve çözeltiyi yüklemeye devam edin.

Çözümün tamamı eklenene kadar bu işlemi tekrarlayın. Reçinenin üst kısmı koyu kahverengi veya siyah olacaktır. Reçine hacim olarak biraz azalacaktır.

Daha sonra, yeni çözeltiler eklendiğinde reçinenin bozulmasını önlemek için reçinenin üstünü cam boncuklarla kaplayın. Sütunu 20 mililitre bir molar HCL ile yükseltin. Daha sonra kolonu 50 mililitre 1.5 molar artmış HCL konsantrasyonu ile elüte edin.

Sütundan sarı bir çözelti çıkmaya başlayacaktır. Daha sonra HCL konsantrasyonunu iki molar ile arttırın ve 150 ila 200 mililitre ile elüsyona devam edin. Eluant çok soluk bir sarı olarak başlayacak ve parlak sarıya dönecektir.

Sütundan gelen eluant tekrar çok soluk olana kadar bekleyin. Bu adımda sabır çok önemlidir. Eluant çok soluk olmalı.

HCL konsantrasyonunu 2,5 molar kısma kadar arttırın. Eluantı test tüplerinde fraksiyonlar halinde toplayın. Son olarak, konsantrasyonu üç molar HCL'ye yükseltin.

Ürün, kolondan yeşil-kahverengi bir çözelti olarak çıkacaktır. Kırmızı-kahverengi bir fraksiyon da sütundan çıkmaya başlayabilir. Bu fraksiyonlar rutenyum kahverengi safsızlıklarıdır ve yeşil-kahverengi fraksiyonlarla bir araya getirilmemelidir.

Tüm fraksiyonları UV-Vis spektroskopisi ile test etmek için, belirli bir fraksiyonun 100 mikrolitresini iki mililitre üç molar amonyağa ekleyin. Daha sonra karışımı UV-Vis spektroskopisi ile analiz edin. Saf ürün içeren fraksiyonlar, 360 nanometrede büyük bir emicilik bandına ve 600 nanometrede daha az yoğun bir emiciliğe sahip olacaktır.

480 nanometredeki absorbans, rutenyum kahverengisinin göstergesidir ve 533 nanometredeki absorbans, rutenyum kırmızısı safsızlıklarını temsil eder. Diğer safsızlıklar 300 nanometreden daha az absorbansta görülür. Saf ürün içeren havuz fraksiyonları ve IR spektroskopisi ile katı haldeki numunenin analizinden önce döner buharlaştırma ile çözeltiyi kuruyana kadar buharlaştırın.

Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi floresan spektroskopisi ile mitokondriyal kalsiyum alım inhibisyonunu değerlendirmeye devam edin. Saflaştırılmış trans-diaqua okto amin mu-okso dirutenyum pentaklorürün UV-Vis spektrumları, sırasıyla 360 nanometre ve 600 nanometrede majör ve minör absorpsiyonlar ile karakterize edilir. Tersine, saf olmayan bir karışım, rutenyum kırmızısı safsızlıklarından 533 nanometrede ve başlangıç malzemesinden 275 ila 300 nanometrede absorpsiyon bantları gösterir.

Kızılötesi spektroskopi kullanılarak katı hal karakterizasyonu, aminlerden beklenen gerilmelere sahiptir. Rutenyumun yanı sıra, oksijen rutenyum 850 ters santimetrede gerilir. Kalsiyuma duyarlı bir floresan boya ve trans-diaqua okto amin mu-okso dirutenyum pentaklorür ile muamele edilen permeabalize HeLa hücreleri, mitokondriye kalsiyum alımının inhibisyonunu gösterir.

Prosedürü denerken, kesirlerin tamamen eline geçmesine izin vermeyi unutmamak önemlidir. Sabır saf bir ürün verecektir. Bu videoyu izledikten sonra, bu güçlü rutenyum 360 analogunun nasıl sentezleneceğini, saflaştırılacağını ve karakterize edileceğini iyi anlamalısınız.

Mitokondriyal kalsiyum seviyeleri, biyoenerjetik ve kontrollü hücre ölümü dahil olmak üzere çok çeşitli hücreler arası süreçleri düzenler. Bu yöntemden üretilen inhibitör, mitokondriyal kalsiyum biyolojisinin diğer biyolojik süreçlere aracılık etmedeki rolünü anlamak için yapılan çalışmalarda uygulanabilir. Konsantre asit ve bazlarla çalışmanın aşındırıcı olduğunu ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman uygun KKD giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.