DNA Formazan yağış mavi ışığa maruz tarafından indüklenen esas alarak yöntemini boyama
28 Ocak 2018
Bu yöntem bir SYBR yeşil jel ıslatarak seçici boyama ve jelleri içinde DNA'ın miktar sağlar ben / Nitro mavi Tetrazolium çözüm ve sonra güneş ışığı ya da mavi bir ışık kaynağına maruz. Bu işlem görünür bir çökelti oluşturur ve alan kullanımı için ideal hale neredeyse hiçbir ekipman.
DNA boyama protokolünün üç genel adımı vardır. Birincisi, jeli NBT olarak da bilinen bir SYBR Green I ve nitro mavi tetrazium çözeltisine koymaktır. Jel daha sonra poliakrilamid jel ise 25 dakika ve agaroz jel ise bir saat karıştırılır.
Son adım, jeli mavi LED'ler veya güneş ışığı gibi mavi bir ışık kaynağına maruz bırakmaktır. Bu adım sırasında bazı çökelti bantları ortaya çıkar. Bu bantların DNA konsantrasyonu ile doğrudan bir ilişkisi vardır ve jel daha sonra DNA'yı ölçmek için bir ofis tarayıcısında dijitalleştirilebilir.
Poliakrilamid jel için denatüre olmayan bir poliakrilamid jel hazırlanır. Jel daha sonra numunelerle yüklenir ve elektroforez işlemi başlar. SYBR Green I, 1.2X'e seyreltiliyor ve NBT 20 milimolar çözeltiler şimdi hazırlanıyor.
Jel plastik bir kaba konur ve 16.75 mil seyreltilmiş SYBR Green I ve 20 milimolar'da 325 mil NBT eklenir. Daha sonra kap Parafilm ve alüminyum folyo ile kaplanır ve 60 rpm'de 25 dakika karıştırılır. Son olarak, alüminyum folyo ve bir Parafilm çıkarılır ve jel güneş ışığına veya mavi bir ışık kaynağına maruz bırakılır.
Bant ölçümü ve kalibrasyon eğrileri için, jel bir ofis tarayıcısına konur, daha sonra görüntü bir görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Son olarak, konsantrasyona karşı normalleştirilmiş bir sinyal grefti yapılır. Bir agaroz jeli yapılır.
Kuyucuklar, ampisilin direncine sahip bir plazmit ile yüklenir ve jel, her biri farklı bir leke ile boyanmış iki parçaya kesilir. Daha sonra plazmit bandı ekstrakte edilir ve kimyasal dönüşüm yoluyla ampisilin içeren ortamlara sahip yetkin hücrelere dönüştürülür. TAE 1X tamponunda %1'lik bir agaroz jeli hazırlanır ve mikrolitre başına yaklaşık 100 nanogramda dört mikrolitre plazmit ile yüklenir.
Elektroforez odasındaki jel daha sonra bir saat boyunca 100 voltta çalıştırılır. Jelin yarısı SYBR Green I ve NBT metodu ile, diğer yarısı ise SYBR Green I UV metodu ile boyanır. Agaroz jel için, SYBR Green I NBT yöntemi, 1.2X konsantrasyonda SBYR Green I ve 2 milimolar'da NBT kullanılarak gerçekleştirilir.
Jel plastik bir kaba konur ve çözelti hacmi jeli kaplayacak şekilde ölçeklendirilir ve karıştırma süresi bir saate kadar uzatılır. Agaroz jeller için, yaygın olarak kullanılan SYBR Green I yöntemi, jelin 1X SYBR Green I solüsyonu ile kaplanması ve bir saat karıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra jel, iki dakika boyunca bant görselleştirme için bir UV transillightöre maruz bırakılır.
Jel boyandıktan sonra, plazmit bandı bir neşter ile kesilir ve plazmit ticari bir ekstraksiyon kiti ile ekstrakte edilir. DNA, kimyasal yetkin Escherichia coli XL 10 bakterisini dönüştürmek için mikrolitre başına 9.1 nanograma normalize edilir. Son olarak, koloniler sayılır.
Koloni oluşturan birimler hesaplanır. Sonuç aşılanır ve SYBR Green I NBT ve SYBR Green I UV'den elde edilen sonuçlar karşılaştırılır. DNA'nın bulunduğu yerde mor bir formazan çökeltisi belirir.
Deneyde, 1.500 baz çiftinde 192 pikogramlık bir tespit limiti ile bir kalibrasyon eğrisi yapmak için bir DNA merdiveni yüklendi. Agaroz jellerin kullanılması, ticari olarak temin edilebilen kit kullanılarak numunenin geri kazanılmasına izin verir ve ekstraksiyona müdahale etmez. Mavi LED ile bu yöntem kullanılarak yapılan bazı geri kazanımlar, transilluminatör kullanan SYBR Green I'e kıyasla daha iyi kalite ile sonuçlanır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu yöntem, SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium solüsyonu kullanılarak jellerdeki DNA'nın seçici olarak boyanmasını ve miktarının belirlenmesini sağlar. İşlem minimum ekipman gerektirdiğinden saha uygulamaları için uygundur.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Moleküler Biyoloji
- Saha Uygulamaları
Arka Plan
- DNA kantifikasyonu çeşitli biyolojik çalışmalar için temel öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler genellikle karmaşık ekipmanlar gerektirir.
- Bu yöntem, süreci önemli ölçüde basitleştirir.
- Etkili sonuçlar için yaygın reaktifler kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- DNA boyama için basit bir yöntem geliştirmek.
- Farklı jel türlerinde DNA miktarının belirlenmesini sağlamak.
- Minimum ekipman gereksinimi ile saha çalışmalarını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Jelin SYBR Green I ve NBT çözeltisine batırılması.
- Jelin 25 dakika (poliakrilamid) veya 1 saat (agaroz) boyunca karıştırılması.
- Jelin mavi ışık kaynağına veya güneş ışığına maruz bırakılması.
- DNA miktar tayini için jelin dijitalleştirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Görünen çökelti bantları DNA konsantrasyonu ile ilişkilidir.
- Minimum ekipmanla etkili boyama gerçekleştirilmiştir.
- Sonuçlar standart ofis tarayıcıları kullanılarak nicelendirilebilir.
- Yöntem, saha koşullarında güvenilirlik göstermektedir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, DNA miktar tayini için pratik bir yaklaşım sunar.
- Çeşitli jel tipleri ve saha uygulamaları için uygundur.
- Uzak konumlardaki araştırmacılar için erişilebilirliği artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Bu DNA boyama yöntemi, nükleik asitlerin özel ekipman gerektirmeden doğrudan görselleştirilmesine ve miktarının belirlenmesine olanak tanıyarak, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda hızlı hedef doğrulamasını destekler. UV transilüminatörlere olan bağımlılığı ortadan kaldırarak, erken keşif iş akışlarındaki güvenlik risklerini ve operasyonel karmaşıklığı azaltır. Bu yaklaşım, DNA konsantrasyonu ile tekrarlanabilir, boya tabanlı sinyal korelasyonu aracılığıyla öngörü güvenini artırarak, aday belirleme süreçlerindeki "devam et/etme" kararlarını kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Formazan çökeltisi yoğunluğu ile DNA konsantrasyonu arasındaki doğrudan korelasyon yoluyla hipotez testine olanak tanır ve hedef etkileşim değerlendirmesini destekler.
- Operasyonel Değer: Tehlikeli UV protokollerinden ve özel görüntüleme ekipmanlarından kaçınarak, oda sıcaklığında karıştırma ve mavi ışık maruziyeti kullanır.
- Tahmin Edici Değer: Ofis tarayıcıları ile uyumlu kantitatif çıktı sağlar ve farklı deneysel koşullar arasındaki nükleik asit verimlerinin hızlıca karşılaştırılmasına izin verir.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Yüksek kapasiteli nükleik asit tarama formatları için standart okumalar görevi gören kararlı, görünür çökelek bantları oluşturur.
- Tekrarlanabilirlik: Belirlenmiş karıştırma süreleri (poliakrilamid için 25 dk, agaroz için 60 dk) ve ölçeklenebilir reaktif konsantrasyonları, partiler arasında tutarlı sinyal oluşumunu sağlar.
- Platform Uyumluluğu: Hem agaroz hem de poliakrilamid jellerle çalışarak, varyant veya plazmit analizi için mevcut elektroforez iş akışlarına sorunsuz entegrasyon sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonal Süreklilik: UV tabanlı yöntemlere kıyasla daha yüksek koloni oluşturan birimlerle kanıtlandığı üzere, boyama sonrası fonksiyonel plazmidlerin geri kazanımını destekleyerek aşağı akış fonksiyonel doğrulamasına olanak tanır.
- Mekanistik Risk Azaltma: UV kaynaklı DNA hasarını önleyerek, fenotipik tarama analizlerinde doğru genotip-fenotip korelasyonu için örnek bütünlüğünü korur.
- Preklinik Kullanım: Laboratuvar altyapısı gerektirmeksizin, preklinik modellerde gen ekspresyon konstrüktlarının veya viral titrelerin sahada uygulanabilir kantifikasyonuna imkan sağlar.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle ekipman erişiminin sınırlı olduğu veya hızlı iterasyonun gerektiği durumlarda, nükleik asit ekstraksiyonundan fonksiyonel analiz doğrulamasına kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Yolak modülasyon çalışmalarında transkripsiyonel veya düzenleme verimliliği ile korele olan, ölçülebilir DNA okumaları sağlayarak hedef doğrulamayı destekler.
- Tarama: CRISPR veya aşırı ifade kütüphanelerinde hit onayı için standartlaştırılmış nükleik asit kantifikasyonuna olanak tanıyarak analiz tekrarlanabilirliğini artırır.
- Analitikler: Ofis tipi tarayıcı görüntülemesi aracılığıyla doğrusal sinyal-konsantrasyon eğrileri oluşturarak, çok kuyucuklu plaka veya jel tabanlı formatlar genelinde veri normalizasyonunu destekler.
- Translasyonel Araştırma: In vitro fonksiyonel analizler için sağlam nükleik asitlerin geri kazanımını kolaylaştırarak, keşif aşaması ile preklinik etkinlik testleri arasında köprü kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Yalnızca SYBR Green I, NBT ve mavi ışık kaynağı gerektirir, bu da onu birden fazla proje ekibi arasında düşük maliyetli ve yeniden kullanılabilir bir modül haline getirir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: UV kaynaklı artefaktları önleyerek mekanistik belirsizliği azaltır ve hedef doğrulama deneylerinde veri güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Karanlık oda veya transilüminatör ihtiyacını ortadan kaldırarak işlem hacmini artırır ve ortak kullanım alanlarındaki darboğazları azaltır.
- Stratejik Değer: Nükleik asit miktar tayini için gereken sermaye harcamalarını düşürerek, uydu laboratuvarlarda veya iş birliği merkezlerinde merkezi olmayan testlerin yapılmasına olanak tanır.
- Portföy Etkisi: Alt akış saflaştırma işlemlerine yatırım yapmadan önce konstrükt veriminin erken ve ekipmandan bağımsız şekilde onaylanmasını sağlayarak riskle uyumlu ilerlemeyi destekler.
Uygulama Dikkat Noktaları
- Jel hazırlama ve elektroforez için temel moleküler biyoloji eğitimi gereklidir.
- Mavi ışık kaynağına (örneğin, 470 nm LED'ler) veya güneş ışığına ve standart laboratuvar karıştırma ekipmanına erişim gereklidir.
- Laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği sağlamak için standardize edilmiş boyama süreleri ve reaktif konsantrasyonları gereklidir.
- Manuel jel taşıma adımları nedeniyle yüksek kapasiteli formatlar için optimizasyon gerekebilir.
- Nükleik asit tespiti ile sınırlıdır; adaptasyon olmadan protein veya küçük molekül analizleri için uygun değildir.
