4.11: ATP Biyolüminesans Testi

ATP biyolüminesans testi, ATP seviyelerini ölçmek ve canlı, metabolik olarak aktif hücreleri tespit etmek için kullanılan yaygın bir tekniktir. ATP veya adenozin trifosfat, tüm canlı organizmalar için birincil enerji kaynağıdır ve "hepsi" ile TÜMÜNÜ kastediyoruz. Hücresel düzeyde ATP, hücresel solunum adı verilen bir dizi metabolik süreçle üretilir.

Bugün, hücresel solunumla ilgili yolları kısaca tartışacağız. Daha sonra, ATP biyolüminesans testinin arkasındaki ilkeleri tanıtacağız ve bu yöntemi gerçekleştirmek için adım adım bir protokolden geçeceğiz. Son olarak, bilim adamlarının bu tekniği mevcut araştırmalarında nasıl uyguladıklarını göreceğiz.

Hücresel solunumu tanıtarak başlayalım. Bu fenomen birkaç metabolik süreci içerir, ancak biz glikoz metabolizması ile ilgili olana odaklanacağız.

Sitoplazmada, glikoliz yolu glikozu piruvata dönüştürür ve bu süreçte iki ATP molekülü üretir. Pirüvat mitokondriye taşınır ve burada asetil-koenzim A'ya dönüştürülür - aynı zamanda karbondioksit üreten bir süreç. Hala mitokondri içindeyken, asetil-koenzim A daha sonra trikarboksilik asit veya TCA döngüsüne girer, bu sırada NADH ve FADH2'nin yüksek enerjili molekülleri gibi tekrar karbondioksit üretilir. Bu moleküller nihayetinde elektronları elektron taşıma zincirine veya ETC'ye "taşır".

ETC içinde elektronlar, oksijeni suya dönüştürmeden önce iç mitokondriyal zardaki farklı protein kompleksleri arasında sırayla aktarılır. Bu işlem sırasında, protonlar mitokondrinin zarlar arası boşluğuna "pompalanır". ATP aslında bu protonlar ATP sentaz adı verilen bir proteinden geçerken mitokondriyal matrise geri girdiklerinde üretilir. Birlikte, TCA döngüsü ve ETC, 36 ATP molekülünün sentezi ile sonuçlanır. Yağlar ve proteinler gibi diğer besin moleküllerinin parçalanması da TCA döngüsüne ve ETC'ye beslenerek ATP üretimine yol açabilir.

Artık hücrelerin ATP'yi nasıl ürettiğini bildiğimize göre, bu molekülün hücre içi seviyelerini ölçmek için yaygın olarak kullanılan ATP biyolüminesans testinin arkasındaki ilkeleri öğrenelim.

Yapısal olarak, ATP'nin bir adenin bazı, bir riboz şekeri ve üç fosfat grubu vardır - bunların ikincisi yüksek enerjili bağlarla bağlanır. Bu bağlar kırıldığında enerji açığa çıkarır ve ATP biyolüminesans testi bu enerjiden yararlanır.

Temel olarak, bu tahlil, ateşböcekleri gibi "parlayan" organizmalardan elde edilen lusiferin bileşiğini ve buna karşılık gelen lusiferaz adı verilen katalizör enzimini gerektirir. Oksijen varlığında, lusiferaz ATP'den enerji elde eder ve lusiferini oksilusiferine dönüştürür. Bu reaksiyonun yan ürünleri, ATP'den elde edilen iki fosfat grubu olan pirofosfattır - onu adenozin monofosfat veya AMP'ye dönüştüren karbon dioksit ve ışık veya lüminesans. Lüminesans, ışık emisyonunu ölçen bir makine olan bir luminometre tarafından okunur. Üretilen lüminesans miktarı ATP miktarı ile doğru orantılı olduğundan, bu hücre canlılığı ve metabolizmasının iyi bir göstergesidir.

Artık ATP biyolüminesans testinin arkasındaki ilkeleri anladığınıza göre, genel bir protokolün ana hatlarını çizelim.

İlk olarak, hücreler kültür ortamı içeren 96 oyuklu bir plakaya ekilir. Hücreler, yoğunluğa bağlı varyasyonu hesaba katmak için üç kopya halinde çeşitli yoğunluklarda kaplanır. En dıştaki kuyuların etrafı dört taraftan da başka kuyularla çevrili olmadığı için bu kuyulardaki sıcaklık ve buharlaşma hızı değişken olabilir. Bu nedenle, hücreler dış kuyucuklarda kaplanmaz ve bunun yerine reaksiyonu etkileyebilecek plaka çapında buharlaşma ve sıcaklık değişimini önlemek için su ile doldurulur. Plakalar daha sonra hücrelerin kültür plakalarına yapışmasını sağlamak için gece boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.

Daha sonra, ortam çıkarılır, her bir oyuğa lusiferaz ve lusiferin eklenir ve reaksiyonu kolaylaştırmak için plaka 5-15 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirilir. Daha sonra, her bir oyuktan gelen karışımın bir kısmı 96 oyuklu beyaz bir plakaya aktarılır; Beyaz plakalar, ışığı yukarı doğru yansıttıkları ve daha doğru lüminesans okumalarına izin verdikleri için sıklıkla kullanılır. Ek olarak, sonraki analizlere müdahale edebilecekleri için baloncuklardan kaçınılmalıdır. Lüminesans sinyali zamanla azalabileceğinden, plaka bir luminometrede 10-12 dakika içinde okunur.

Luminometre sonuçlarını analiz etmek için, aynı hücre yoğunluğuna sahip kuyulardan ortalama bir lüminesans değeri hesaplanır. Araştırmacılar, hem sağlıklı kontrol örneklerinden hem de tedavi edilen hücrelerden bu şekilde toplanan lüminesans verilerini karşılaştırarak, belirli bir tedavinin canlılık ve metabolizma üzerindeki etkilerini, özellikle deney grubunda azalmış lüminesans arayarak değerlendirebilirler.

Artık bir ATP biyolüminesans testinin nasıl gerçekleştirileceğini gördüğünüze göre, araştırma uygulamalarını tartışalım.

Bilim adamları her zaman konakçı hücrelere zarar vermeyen veya öldürmeyen yeni antiviraller geliştirmeye çalışıyorlar. Bu çalışmada, memeli hücreleri çok kuyulu bir plakaya ekildi ve spesifik bir virüs ile enfekte edildi. Bu örneklere çeşitli antiviral bileşikler eklendi ve etkili konsantrasyonu elli veya EC50'yi hesaplamak için log konsantrasyon-yanıt eğrileri oluşturuldu. EC50, hücre canlılığının yüzde 50 olduğu bileşiğin konsantrasyonudur. Bu, bir bileşiğin sitotoksisitesini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir parametredir.

ATP seviyeleri ayrıca çeşitli koşullar altında mitokondriyal aktivite hakkında ipuçları verebilir. Burada, ATP biyolüminesans testi, kemirgen karaciğer ve kas hücrelerinden türetilen mitokondri preparatları üzerinde gerçekleştirildi ve bu da araştırmacıların normal dokulardaki mitokondriyal fonksiyonun derecesini değerlendirmesine yardımcı oldu. Daha da önemlisi, bu protokol hastalık durumlarında mitokondriyal fonksiyonu incelemek için bir yol sağlamak üzere genişletilebilir.

Bilim adamları ayrıca bu testi in vivo sistemlerde potansiyel kanser tedavilerini araştırmak için kullanıyorlar. Bu örnekte, insan tümör hücreleri lusiferazı eksprese edecek şekilde modifiye edildi ve canlı farelerin beyinlerine enjekte edildi. Bu hayvanlarda tümör hücreleri yerleştikten sonra, bir anti-kanser ilacı ile tedavi edildiler. Sonraki bir in vivo ATP biyolüminesans testi, ilaca maruz kalan farelerdeki tümör hücrelerinin daha düşük ATP seviyelerine sahip olduğunu ortaya koydu.

JoVE'nin ATP biyolüminesans testine girişini yeni izlediniz. Artık hücresel solunum yollarına ve bu yolların son ürünü olan ATP'yi ölçmek için kullanılan protokole aşina olmalısınız. ATP biyolüminesans testi, fizyolojik ve patolojik faktörlerin hücre metabolizması ve canlılığı üzerindeki etkisini incelemekle ilgilenen hücre biyologları için mükemmel bir tarama aracı olarak hizmet eder. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!