Name: Doymuş yağ asitleri Ceramide ilişkili makrofaj hücre ölümüne neden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Öğrenin, kemik iliği kaynaklı makrofajları doymuş yağ asitleriyle tedavi ederek hücre ölümü ve ceramide birikimi arasındaki ilişkiyi nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem metabolik inflamasyon çalışmaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser kısmen Louisville Üniversitesi başlangıç fonlar tarafından desteklendi ve Ulusal Kanser Enstitüsü (Bethesda, MD) R01CA177679, R01CA180986 verir.

protokol kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Louisville Üniversitesi tarafından kabul edildi.
 1. fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar (BMDMs) <ol><li>Euthanize CO 2 kullanarak bir 6 - için 8-hafta-yaşlı, sağlıklı vahşi tip fare. Bir köpük tahta aşağı pin ve sırılsıklam olana % 70 etanol ile sprey. Tibia/uyluk kemikleri forseps ve makas ile kaldırın. Onları 5 mL 1 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile petri kabına koyardım. Steril koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirmek.</li>
	<li>Her iki ucunda da bir makas ile tibia/uyluk kemiği steril doku kültürü mahallede kesmiş. 15 mL tüp içine kemik PBS + % 2 fetal sığır serum (FBS) ile 25 G iğne ile flush.</li>
	<li>Kemik iliği hücreleri vasıl 500 x g, 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Hücre Pelet 1 mL kırmızı kan hücre lizis arabelleği kırmızı kan hücreleri (RBC) koşullar için daha az 1 dk. Dilute 9 mL 1 x PBS ile hemen resuspend. Santrifüj tekrar adım 1.3 olduğu gibi. Supernatants dikkatle boşaltmak.</li>
	<li>10 mL 1 x PBS içinde hücre Pelet resuspend, hücre süspansiyon hücre enkaz/kümeleri kaldırmak için başka bir 15 mL tüp içine steril 40 mikron naylon mesh aracılığıyla filtre. Santrifüj tekrar 1.3 olduğu gibi. Supernatants dikkatle boşaltmak.</li>
	<li>Hücre Pelet 15 mL Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI) % 5 ile 1640 FBS ve 10 μg/mL gentamisin, yüzen dışarı 100-mm doku kültürü çanak 37 o C İnkübatör, hücrelerde alın 60 dk. yavaşça girdap için çanak, tabak resuspend hücreleri ve bunları kabul.</li>
	<li>6 x 10 6 hücreler bir 100-mm tabak içinde 10 ng/mL rekombinant fare makrofaj ile medya (%5 FBS ve 10 μg/mL gentamisin, % 30 ' L929 şartına media 10 ile karışık RPMI 1640) ayırt 12 mL makrofaj ile plaka 2 gün için koloni uyarıcı faktör (M-CSF).</li>
	<li>% 5 CO 2 37 ° C kuluçka 2 gün boyunca kültür sonra her yemeğin medya 10 ng/mL M-CSF ile ayırt 6 mL taze makrofaj ile beslemek.</li>
	<li>5 günde 8 mL eski medya hücreleri rahatsız etmeden alıp 10 mL taze makrofaj medya 10 ng/mL M-CSF ile ayırt ekleyin.</li>
	<li>7 günde bir hücre lifter kullanarak kemik iliği türevi makrofajlar (BMDMs) hasat. 
	Not: Ekli makrofajlar da 5 mL 1 mM EDTA 1 x PBS için 5-10 dk içinde ile float hücreleri kaldırma ve iki kez 5 mL 1 x PBS ile tabak yıkama sonra ayrışmış. Adım 1.3 olduğu gibi hücreleri santrifüj kapasitesi., onları taze makrofaj medya ayırt resuspend ve bir hemasitometre ile Sayın.
	<ol><li>Onayla BMDMs &#39; fenotip Akış Sitometresi tarafından açıklanan 5. Türetilmiş fare makrofajlar aşağıdaki çalışmalar için belirli bir konsantrasyon hazırlayın.</li>
	</ol></li></ol> 2. BSA-yağ asit eşlenik hazırlık <ol><li>hazırla 2 mM BSA steril PBS. Örneğin, tartmak 6,65 g BSA, çözülmeye, 30 mL 1 x PBS eklemek sonra eklemek daha fazla PBS 50 mL kadar bileşenleri 2 mM BSA 1 x PBS yapmak için ölçekleme.</li>
	<li>Hazırlama 5 mM bireysel sodyum tuzu 2 mM BSA yağ asitlerinin. 37 ° C veya daha yüksek, gerekirse ısı ve net bir çözüm elde edilir kadar 2 mM BSA karışımı ve yağ asitlerinin sodyum tuzu solüsyon içeren temizleyicide. 
	Not: doymamış yağ asitleri için karşılaştırıldığında, doymuş yağ asitleri daha yüksek bir sıcaklık ve sonication zamana eriterek için gerek.</li>
	<li>Filtre bir 0,22 ile yağ-asit-BSA çözüme mikron filtre, aliquot 1,5 mL steril microcentrifuge içine borular, onları kısa süreli kullanım için 4 ° C'de veya uzun süreli depolama için-20 ° C'de ve saklayabilirsiniz. Hiç yağış depolama buzdolabında 4 ° C'de sonra dikkat edilmelidir.</li>
</ol> 3. Doymuş yağ asitleri neden hücre ölüm, fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar <ol><li>BMDMs 24-iyi doku kültürü plaka 10 6 /mL medya ayırt makrofaj olarak x 0.4 ile plaka.</li>
	<li>0.4 mM palmitik asit ve Stearik asit, 37 ° C kuluçka %5 CO 2 ile 16-24 h için hücrelerle tedavi. Negatif kontrol BSA kullanın.</li>
	<li>Tedaviden sonra hücre lifter hücrelerle hasat ve spin 500 x g, 4 ° C'de 5 dakika süreyle, hücreleri aşağı</li>
	<li>Annexin V-Alexa 488 ve 7-aminoactinomycin D (7-AAD) 100 hücrelerle leke μL V bağlama arabellek 15 dakika oda sıcaklığında annexin.</li>
	<li>Annexin-bağlama arabellek 200 µL örnekle sulandırmak, karışımı yavaşça, o zaman buz üzerinde örnekleri kuluçka süresinden sonra devam.</li>
	<li>Lekeli hücreleri en kısa zamanda Akış Sitometresi 5 tarafından analiz. V-Alexa 488 annexin FITC kanalda algılandığında ve 7-AAD PerCP/PerCP-Cy5.5 kanalda algılandı.</li>
</ol> 4. Hücre içi Ceramide boyama <ol><li>yağ asidi tedaviden sonra adım 3.3 olduğu gibi hücre hasat. % 4 paraformaldehyde 30 dakika süreyle hücreleri tamir</li>
	<li>Örnek 1 mL 1 x PBS ile yıkayın, aşağı spin olarak 3.3 içinde adım ve süpernatant dikkatle boşaltmak.</li>
	<li>100 μL 1 x permeabilization tampon 30 dakika süreyle anti-ceramide birincil antikor (1: 200 seyreltme) hücrelerle leke</li>
	<li>Yıkama ve spin aşağı hücreleri tekrar olduğu gibi adım 4.2.</li>
	<li>100 μL 1 x permeabilization tampon 30 dakika süreyle Anti-fare IgM ikincil antikor (1:500 seyreltme) hücrelerle leke</li>
	<li>Yıkama ve spin adım 4.2 olduğu gibi yine hücreleri aşağı. 250 μL 1 x PBS ekleyin ve lekeli hücreleri Akış Sitometresi 5 tarafından analiz. 
	Not: ekipmanları ve Kimyasalları tablosu ayrıntılı reaktif listesinde bakın.</li>
</ol>

<ol><li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+%28J774%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li>
<li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li>
<li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock%3A+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li>
<li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+as+fatty+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li>
<li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+%28sterol+carrier+protein-2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li>
<li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir maddi çıkar çatışmaları bildirin.

Yağ asidi çözüm uygun hazırlanması yağ asitlerinin biyolojik işlev eğitim için kritik öneme sahiptir. Yağ asidi nötralize sulu çözüm onun çözünürlük artar. Ancak, hala su veya PBS düşük çözünürlük, yağ asitlerinin, özellikle doymuş yağ asitleri, sodyum tuzları şunlardır biz gözlenen. Bir yöntem yağ asidi1dağıtılması yardımcı olmak için % 95-100 etanol kullanmaktır. Bu yöntemi kullanarak, hücrelere daha yüksek toksisite daha az toksik doymamış yağ asitleri için daha düşük konsantrasyonlarda bile gö...

Yağ asitleri enerji metabolizması ve farklı hücre membran fosfolipitler sentezi kritik bir rol oynamaktadır. Yağ asitleri sulu düşük bir çözünürlük var. Yağ asidi uygun hazırlanması biyolojik fonksiyonları memeli hücrelerinde yağ asitlerinin çalışmak için kritik önem taşıyor. Yağ asitleri etanol ile hazırlanır birçok yağ asitleri bile nispeten düşük konsantrasyonlarda1hücre zarının toksik sabun (deterjan) etkileri göstermek. Bir doğal, büyük taşıyıcı serum serbest yağ asitleri için serum albümin yağ asidi teslim vitro yağ asidi işlevi deneyleri için2,3,4için iyi bir taşıyıcı olarak kabul edilir. Birçok araştırma kağıtları yağ asitleri kullanarak yayımlanmış olsa bile ancak, yağ asidi ve serum albümin eşlenik hazırlanması ayrıntılarını genellikle kullanılabilir değil.
Makrofajlar epidermal yağ asidi bağlayıcı protein ve yağ yağ asidi bağlayıcı protein5,6,7,8son derece hızlı. Onlar aktif alımı doymuş ve doymamış yağ asitleri bağışıklık işlevleri düzenleyen. Makrofajlar ve diğer hücrelerin yağ asitlerinin etkisi çalışma için uygulanan1,7,9yağ asidi hazırlık farklı yöntemleri vardı. Yağ asitleri makrofaj fonksiyonları üzerine etkisini araştırmak için uygun şekilde hazırlanmış yağ asidi/serum albümin conjugates kullanarak biyolojik anlamlı veri almak üzere kritik önem taşımaktadır. Yağ asitleri makrofaj fonksiyonları üzerine etkisi üzerinde çalışmalar temel bilgi ve yağ asidi metabolizmasının hastalıklarda makrofaj söz konusu ile ilgili potansiyel tedavi hedefleri sağlar.

<table><tbody><tr><td>CPX Ultrasonik Banyo&nbsp;</td><td>Bransonic</td><td>Model 2800</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum palmitat (PA)</td><td>Nu-Chek Hazırlık, Inc.</td><td>S-1109</td><td>MW 278</td></tr><tr><td>Sodyum stearat (SA)</td> <td>Nu-Chek Hazırlık, Inc.</td><td>S-1111</td><td>M.W. 306</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA), yağ asidi içermez</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Fare makrofaj koloni uyarıcı faktör (mM-CSF)&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi, &nbsp; Inc.</td><td>5228</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>VWR Uluslararası</td><td>71002-878</td><td></td></tr><tr><td>Ek V, Alexa Fluor 488 eşlenik</td><td>Fisher Scientific</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal anti-seramid antikoru (fare IgM)</td> <td>Sigma</td><td>C8104-50TST</td><td>Klon: MID 15B4</td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare IgM Antikoru ve mikro; zincir, FITC konjuge</td><td>Sigma</td><td>AP128F</td><td></td></tr><tr><td>Fiksasyon tamponu</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>Geçirgenlik tamponu</td><td>Ebioscience</td><td>4307693</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tamponu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Bağlayıcı Tampon</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>L929 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Hücre Kaldırıcı&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-364</td><td></td></tr><tr><td>Not: MW moleküler ağırlık içindir.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

doymuş yağ asitleri ceramide ilişkili makrofaj hücre ölümüne neden

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Makrofajlar epidermal yağ asidi bağlayıcı protein ve yağ yağ asidi bağlayıcı protein son derece hızlı. Onlar aktif alımı doymuş ve doymamış yağ asitleri, bağışıklık fonksiyonları düzenlenmesinde önemli bir rol oynayabilir. Çok sayıda çalışmalar çeşitli yağ asitleri, doymuş olduğunu göstermiştir veya doymamış, Mayıs hücre büyümesi ve fonksiyonu farklı etkileri sahip. Ancak, yağ asidi hazırlık için kullanılan yaklaşımlar değişir, hangi fizyolojik olmayan sonuçlara neden olabilir. Serum albümin, memeli periferik kan, yağ asitleri için doğal bir taşıyıcı yağ asitlerinin sodyum tuzu ile karmaşık eşlenik şekillendirme için yağ asidi işlevinde böylece yağ asidi sabun toksisite en aza indirerek memeli hücreleri, eğitim için önerilir. Bu nedenle, basit, nispeten hızlı Isıtma ve yöntem sonicating geliştirilen ve burada BSA-yağ asit eşlenik oluşumu için sunulan. Doymuş yağ asitleri, özellikle Stearik asitler şiddetli hücre ölümü fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar içinde ikna etmek için bir iletişim kuralı'nı açıklar. Biz daha fazla doymuş yağ asidi indüklenen hücre ölümü olumlu birikmiş hücresel ceramide düzeyleri ile ilişkili olduğunu gösterir. Bu yöntem yağ asidi diğer memeli hücreleri üzerinde etkisini çalışmaları için genişletilebilir.

Obezite Serumda serbest yağ asitleri konsantrasyonları artar. Profesyonel fagositler makrofajlar aktif olarak ana bilgisayar homeostazı korumak için yağ asitleri götür. Bu işlemler sırasında aşırı yüklenmiş lipidler makrofaj hücre ölümüne neden olabilir. Bu amaçla, biz BMDMs vitro obez düzeyde diyet yağ asitleri ve akış sitometrik boyama kullanarak ölçülen makrofaj hücre ölümü ile kültürlü. Doymuş yağ asitleri, BSA denetimine göre özellikle Stearik asitler, indüklenen önemli hücr...

Kemik iliği hücrelerinden fare birincil makrofajlar türetmek için bir düz ileri yöntem göstermek ve BSA-yağ asidi hazırlamak için basit bir yöntem conjugates. Sonra doymuş yağ asitleri makrofaj hücre ölümüne neden olabilir ve bu tür hücre ölümü olumlu ceramide düzeyleri hücresel birikimi ile ilişkilidir gösterir.

Doymuş yağ asitleri Ceramide ilişkili makrofaj hücre ölümüne neden

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Makrofajların doymuş yağ asitleri ile muamele edildiği bu deneyin genel amacı, doymuş yağ asidinin neden olduğu makrofajların hücre ölümünün, birikmiş hücresel Seramid seviyeleri ile ilişkili olduğunu göstermektir. Bu yöntem, metabolik inflamasyon alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin: doymuş yağ asidinin neden olduğu hücre ölümü ve iltihaplanma.Bu tekniğin ana avantajı, BSA yağ asidi konjugatlarını ilerletmek için basit ama ayrıntılı bir yaklaşım sağlamaktır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, tutarlı sonuçlarla doğru stabil BSA yağ asidi konjuge çözeltisi hazırlamak zor olduğu için mücadele edeceklerdir. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi, ötenazi yapılmış altı ila sekiz haftalık sağlıklı bir vahşi tip fareden tibia ve femur kemiklerinin çıkarılmasıyla başlayın.Tibia ve femur kemiklerinin her iki ucunu bir makas ve steril bir Doku Kültürü Başlığı ile kesin. Kemikleri PBS'li 25 gauge iğne ve yüzde iki Fetal Sığır Serumu ile 15 mililitrelik bir tüpe yıkayın. Kemik iliği hücrelerini 500 g'da, dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.Daha sonra, kırmızı kan hücrelerini bir dakikadan daha kısa bir süre boyunca parçalamak için hücre peletini bir mililitre Kırmızı Kan Hücresi Lizis tamponunda yeniden askıya alın. Hücreleri hemen dokuz mililitre 1x PBS ile seyreltin. Daha önce olduğu gibi tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın.Hücre peletini 10 mililitre 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Ardından, hücre kalıntılarını ve topaklarını gidermek için hücre süspansiyonunu steril 40 mikron Naylon Mesh ile başka bir 15 mililitrelik tüpe süzün. Daha önce olduğu gibi santrifüjlemeyi takiben, hücre peletini 15 mililitre Roswell Park Memorial Institute ortamı 1640'ta yüzde beş FBS ve mililitre Gentamisin başına 10 mikrogram ile yeniden süspanse edin.Daha sonra, hücreleri 100 milimetrelik bir Doku Kültürü Kabına koyun ve 60 dakika boyunca 37 derecelik bir inkübatöre koyun. Çanağı yavaşça döndürün, yüzen hücreleri çıkarın ve sayın. Daha sonra, iki gün boyunca 12 mililitre Makrofaj Ayırt Edici Medya ve mililitre başına 10 nanogram rekombinant Fare Makrofaj Koloni Uyarıcı Faktör veya MCSF içeren 100 milimetrelik bir tabakta 6.000.000 hücreyi plakalayın.Yüzde beş CO2 içeren 37 santigrat derecelik bir inkübatörde iki gün boyunca kültürlendikten sonra, her bir tabağı mililitre MCSF başına 10 nanogram içeren altı mililitre taze Makrofaj Farklılaştırıcı Ortam ile besleyin. Beşinci günde, hücreleri rahatsız etmeden sekiz mililitre eski ortamı çıkarın ve mililitre MCSF başına 10 nanogram ile 10 militer taze Makrofaj Farklılaştırıcı Ortam ekleyin. Yedinci günde, bir hücre kaldırıcı kullanarak Kemik İliğinden Türetilmiş Makrofajları veya BMDM'leri hasat edin.Metin protokolünde atıfta bulunulduğu gibi BMDM'lerin fenotipini Akış Sitometrisi ile onaylayın. BSA Yağ Asidi Konjugatını hazırlamak için, iki milimolar BSA'da beş milimolar ayrı Yağ Asitleri Sodyum Tuzu hazırlayın. Gerekirse karışımı 37 santigrat dereceye veya daha yükseğe ısıtın.Daha sonra, berrak bir çözelti elde edilene kadar iki milimolar BSA ve Yağ Asitlerinin Sodyum Tuzu karışımını Sonic Isıtın. Sonikasyonun ardından, yağ asidi BSA çözeltisini 0.22 mikronluk bir filtreden süzün. Daha sonra, filtrelenmiş çözeltiyi 1.5 mililitrelik steril mikrosantrifüj tüplerine ayırın.Tüpleri kısa süreli kullanım için dört santigrat derecede veya uzun süreli depolama için eksi 20 santigrat derecede saklayın. Buzdolabında dört santigrat derecede saklandıktan sonra yağış gözlenmemelidir. BMDM'leri, makrofaj farklılaştırıcı ortamda mililitrede 0.4 milyon hücre içeren 24 oyuklu bir doku kültürü plakasında plakalayın.Hücreleri, yüzde beş CO2 ile 37 derecelik bir inkübatörde 16 ila 24 saat boyunca 0.4 milimolar Palmitik asit ve Stearik asit ile tedavi edin. Negatif kontrol olarak BSA'yı kullanın. Tedaviden sonra hücreleri bir hücre kaldırıcı ile hasat edin.Ardından, hücreleri beş dakika boyunca 500 g, dört santigrat derece döndürün. Hücreleri Annexin V-Alexa 488 ve 7-AAD ile 100 mikrolitre Annexin-V bağlayıcı tamponda oda sıcaklığında 15 dakika boyayın. Numuneyi 200 mikrolitre Annexin bağlayıcı tampon ile seyreltin ve hafifçe karıştırın.Kuluçka süresinden sonra numuneleri buz üzerinde tutun. Akış Sitometrisi ile lekeli hücreleri mümkün olan en kısa sürede analiz edin. Annexin V-Alexa 488, FITC kanalında ve 7-ADD, PerCP PerCP-Cy5.5 kanalında tespit edilir.Yağ asidi muamelesinden sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi hasat edin. Ardından, hücreleri 30 dakika boyunca yüzde dört Paraformaldehit içinde sabitleyin. Numuneyi daha önce olduğu gibi döndürmeden önce numuneyi bir militer 1x PBS ile yıkayın.Süpernatanı boşalttıktan sonra, hücreleri 100 mikrolitre 1x Geçirgenleştirme Tamponunda 30 dakika boyunca Anti-Seramid Birincil Antikor ile boyayın. Hücreleri daha önce olduğu gibi yıkadıktan ve santrifüj ettikten sonra, hücreleri 100 mikrolitre 1x Geçirgenlik Tamponu içinde 30 dakika boyunca Anti-Mouse IgM İkincil Antikor ile boyayın. Hücreleri daha önce olduğu gibi yıkayın ve tekrar döndürün.Daha sonra 250 mikrolitre 1x PBS ekleyin ve lekeli hücreleri Akış Sitometrisi ile analiz edin. BMDM'ler in-vitro olarak obez diyet yağ asitleri seviyeleri ile kültürlendi ve makrofaj hücre ölümü Flow Sitometrik boyama kullanılarak ölçüldü. BSA kontrolü ile karşılaştırıldığında, doymuş yağ asitleri, özellikle Sterik asitler, BMDM'lerde önemli hücre ölümüne neden olmuştur.Ölü hücreler, Annexin V ve 7-AAD ile boyanan çift pozitif popülasyon olarak gösterildi. Ayrıca, doymuş yağ asidinin neden olduğu hücre ölümü, makrofajlarda birikmiş hücresel Seramid seviyeleri ile pozitif ilişkilidir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre ölümü ve iltihabını incelemek için BSA Yağ Asidi Konjugasyonlarının nasıl hazırlanacağını ve makrofajların BSA Yağ Asidi Konjugatları ile nasıl tedavi edileceğini iyi anlamış olmalısınız.Geliştirilmesi üzerine, bu teknik, metabolik inflamasyon alanındaki araştırmacıların doymuş yağ asidinin neden olduğu hücre ölümünü ve obezitede inflamasyonu keşfetmelerinin yolunu açtı.

saturated-fatty-acids-induce-ceramide-associated-macrophage-cell-death

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

MACS ve Annexin V-konjuge manyetik boncuk ve hedef lipid ve Annexin V-bağlayıcı fosfatidilserin sentezlenen lipid veziküller hedef lipid protein etkileşim test etmek için. Ortak hedef lipid bağlı Proteinler saflaştırılmış ve boncuk elüsyon sonra analiz edilir.

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

Bu video, bimoleküler floresan tamamlama raportör proteinleri kullanılarak insan makrofajlarındaki kaspaz proteinlerinin aktivasyonunu göstermektedir. Kaspaz-1'in pro alanları, inflamatuar kompleksler için işe alınan Venüs proteinlerinin floresan olmayan fragmanları ile kaynaştırılır. İnflamatuarların yakınlığı, Venüs parçalarının yeniden katlanmasını ve floresansını indükleyerek makrofajlarda kaspaz aktivasyonunu doğrular.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda Kaspaz Aktivasyonunun Görselleştirilmesi

Bu video, influenza virüsü ile stimülasyon yoluyla kemik iliği kaynaklı makrofajlarda çoklu kaspaz aktivasyonlarının değerlendirmesini göstermektedir. Makrofaj lizizi, lizatın ısıyla inaktivasyonu ve santrifüjlemeyi takiben, sonraki immünolojik analizler için hücre içi kaspazlar toplanır.

Makrofajlarda Multipl Kaspazların Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Burada, bitişik ölü veya ölmekte olan hücrelerle fiziksel etkileşim yoluyla canlı hücrelerde indüklenen hücre içi sinyal olaylarının belirlenmesi için bir protokol sunuyoruz. Protokol, fagositik alımlarının veya çözünür aracıların salınmasının aksine, ölü hücrelerin reseptör aracılı tanınmasıyla indüklenen sinyal olaylarına odaklanır.

Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması

Bu iletişim kuralı ayırmak ve karakterize bir araştırmacı doku yerleşik sağlar makrofajlar içinde çeşitli metabolik bozuklukların diyet kaynaklı modellerinden çıkarılan iltihaplı dokulara hallmark.

Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma

NLRP3 inflammasome harekete geçirmek algılama floresans mikroskobu kullanarak ve etkin caspase-1 ve adaptörü, ASC için boyama hücresel olarak açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz yayın tahlil pyroptotic lizis nüfus olarak algılamak için sunulmuştur. Bu teknikler birçok açıdan inflammasome biyoloji çalışmaya adapte edilebilir.

Inflammasome harekete geçirmek ve Pyroptotic hücre ölümü fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde tespiti

Bu protokol, insan kan örneklerinden monosit türevi makrofajlar (MDM) elde etmek için iş akışını, enflamatuar kaspaz Bimoleküler Floresan Kompleman (BiFC) muhabirlerini hücre canlılığı ve davranışından ödün vermeden insan MDM'sine verimli bir şekilde tanıtmak için basit bir yöntemi ve canlı hücrelerde enflamatuar kaspaz aktivasyonunu ölçmek için görüntüleme tabanlı bir yaklaşımı açıklamaktadır.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Kaspazların İndüklenen Yakınlığının Görselleştirilmesi

Bu protokol, piroptoz, apoptoz, nekroptoz ve PANoptoz gibi hücre ölüm yollarının başlatılmasını belirlemek için hem in vitro hem de in vivo (in fareler) enfeksiyon, steril hakaretler ve kanser modellerine yanıt olarak kaspaz aktivasyonunu (kaspaz-1, kaspaz-3, kaspaz-7, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-11) değerlendirmek için kapsamlı bir yöntemi açıklamaktadır.

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Bu protokol, PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının LPS ve ATP'ye bağlı ölümüne dayanmaktadır. Hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V ve 7-AAD çift boyamayı analiz etmek için akış sitometrisi kullanıyoruz, tüm hücreyi kullanıyoruz ve hücre zarı morfolojisini gözlemlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanıyoruz.

PMA ile Farklılaşmış THP-1 Makrofajlarının LPS ve ATP ile İndüklenen Ölümü ve Validasyonu

Hücre-aracılı lenfositotoksisite (KML) deneyleri, in vitro otoreaktif yanıtları ve hücre ölümü çalışma mekanizmaları test etmek için kullanılabilir. Ancak, canlı hücre floresan boyalar, tipi ve hücre ölümü gibi kullanılan yollar kinetiği konfokal mikroskopik görüntüleme teknikleri kullanılarak daha ayrıntılı olarak incelenebilir.

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Öğrenin, kemik iliği kaynaklı makrofajları doymuş yağ asitleriyle tedavi ederek hücre ölümü ve ceramide birikimi arasındaki ilişkiyi nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem metabolik inflamasyon çalışmaları için değerlidir.

Doymuş yağ asitleri Ceramide ilişkili makrofaj hücre ölümüne neden

Daha fazla video keşfet