Bağışıklık hücreleri tek siyatik sinirleri ve Dorsal kök gangliyon üzerinden tek bir fare kullanarak Akış Sitometresi Analizi

Bu prosedürün genel amacı, hücrelerin akış sitometrisi analizini yapabilmek için tek bir fareden dorsal kök ganglionlarından ve siyatik sinirlerden yeterli hücre elde etmektir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü periferik nöronal materyal sindirildiğinde büyük miktarda döküntü üretir. Bu yöntemin ana avantajı, birden fazla hücre tipini tanımlamak için birkaç işaretleyicinin aynı anda kullanılabilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, nöropati sırasında inflamasyon ve immünopatoloji tanısına kadar uzanır. Bu yöntem fare modellerine içgörü sağlayabilirken, küçük değişikliklerle insan ve domuz sinirleri gibi diğer organizmalara da uygulanabilir. Genel olarak, yönteme yeni başlayan kişiler, sindirimin ürettiği büyük miktarda döküntü nedeniyle mücadele edeceklerdir.

Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü diseksiyon ve hücre ayrışma adımlarının gerçekleştirilmesi zordur, çünkü fare başına nöronal materyal sınırlayıcıdır. Bu yöntem için ilk olarak, Steve Lacroix'in laboratuvarından kuğu hücresini siyatik sinirden izole eden bir protokol gördüğümüzde aklımıza geldi. Başlamak için, fareyi ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın ve alt ekstremiteleri uzatırken ventral tarafı aşağı bakacak şekilde konumlandırın.

Daha sonra, tüm siyatik sinirleri iki taraflı olarak incelemek için bir çift forseps kullanın. Kas dokusunu üst sırt uyluğundan ayırarak başlayın ve siniri omurga boyunca takip edin. Siniri omurgadan çıktığı yerde ve diğer ucunda dizin hemen üstünde kesin.

Daha sonra eksize edilen sinirleri 1 mililitre buz gibi soğuk PBS içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Sinirleri buzun üzerinde saklayın. Daha sonra, dorsal kök ganglionunu izole edin.

Kaburgaları her iki tarafta omurgaya paralel ve yakın keserek başlayın. Daha sonra, omurgayı arka taraftaki femur seviyesinde ve ön taraftaki kafatasına yakın enine kesin. Omurgayı çıkarın ve omurgadaki tüm kas, yağ ve diğer yumuşak dokuları kesmek için iris makası kullanın.

Daha sonra, omurgayı ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve makasın bir ucunu saat 12 pozisyonunda vertebral kanala kaydırarak ve kemiği keserek kaudal uçtan başlayarak açın. Tüm omurga kesilene kadar devam ederek, omurga yarıya inene kadar bu işlemi saat altı konumunda tekrarlayın. Omurganın iki yarısını ayırın, ardından numuneyi bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.

Omurilik sinirlerini açığa çıkarmak için omuriliği çıkarın, ardından omur kanallarına çekmek için sırt kökünü hafifçe çekerek lomber dorsal kök gangliyonlarını bulun ve çıkarın. Ardından, dorsal kök ganglionunun etrafındaki sinirleri ve bağ dokusunu klipslemek için iris makası kullanın. Forseps kullanarak, dorsal kök ganglionlarını 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve buz üzerinde saklayın.

Dorsal kök gangliyonlarını bulmak, onlara zarar vermeden çıkarmak ve omurilik sinirinden kurtarmak için egzersiz ve beceri gerektirir. Bir sindirim ortamı hazırlayın, mililitre deoksiribonükleaz başına yüz mikrogram ile destekleyin ve buz üzerinde saklayın. Daha sonra, siyatik sinirler ve dorsal kök ganglionları ile tüplerin her birine 500 mikrolitre sindirim ortamı ekleyin.

Siyatik sinirler için, materyali bir çift yaylı makas kullanarak 15 ila 20 kez doğrayın ve ardından doku süspansiyonlarını 37 santigrat derecede çalkalanan bir inkübatörde 20 dakika boyunca hafif bir çalkalama ile inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tam olarak sindirilmemiş herhangi bir dokuyu mekanik olarak ayırmak için hücre süspansiyonunu 1.000 mikrolitrelik bir pipet ucundan tekrar tekrar ezin. Öğütme işlemini 1.000 mikrolitrelik bir pipet ucu ile tekrarlayın.

Daha sonra numuneyi hafif çalkalama ile 37 santigrat derecede 10 dakika daha inkübe edin. Buz gibi soğuk FACS tamponunu hazırlayın ve 140 mikron ağ boyutuna sahip paslanmaz çelik bir ekranı buz üzerinde 60 milimetrelik bir petri kabında durulamak ve ıslatmak için kullanın. Ardından, 140 mikronluk elek filtresini petri kabının üzerinde tutmak için künt forseps kullanın ve doku süspansiyonlarını tekrar tekrar filtreden geçirin.

Hücre süspansiyonunu petri kabından toplayın ve buz üzerinde depolanan aynı 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Filtrede kalan tam olarak sindirilmemiş dokuyu 1.000 mikrolitrelik bir pipet ucu ile tekrarlanan öğütme yoluyla itin. Ardından, elek filtresini 500 mikrolitre FACS tamponu ile iki kez durulayın ve 1,5 mililitrelik tüpteki hücre süspansiyonu ile birleştirin.

Numunenin çok fazlası tam olarak sindirilmezse ve metal ağdan geçirilirse, hücre kaybı meydana gelebilir ve akış sitometrisi analizi imkansız olabilir. Hücre süspansiyonlarını santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Daha sonra hücre peletini bir mililitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

Bu yıkama adımını bir kez tekrarlayın, son hücre peletini 150 ila 350 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreler artık lekelenmeye hazırdır. Bilgisayarda, ilgilenilen floroforların tespiti için uygun kanalları, numunelerin uygun akış hızını ve numune başına toplanacak toplam olay sayısını seçin.

Minimum olay sayısı bir milyon olmalıdır. Daha sonra, yan saçılma A'ya karşı İleri Dağılım A'ya karşı ve İlgilenilen her florofor için İleri Dağılım A'ya karşı genel bir çalışma sayfası altında dağılım grafikleri oluşturun.Ayrıca, seçilen floroforlar için olay sayısını ve ortalama floresan yoğunluğunu gösterecek istatistiksel bir görünüm oluşturun. Yalnızca DAPI boyama kontrollerinden gelen dağılım grafiğine dayalı olarak üst geçit olan P1'i belirleyin.

Numuneyi akış sitometrisine ekleyin ve elde et'e tıklayın. DAPI'ye karşı FSC grafiğini gözlemleyin ve DAPI+ popülasyonu görünür hale gelene kadar DNA pasifik mavi kanalının voltajını azaltın. Dikdörtgen geçit aracını kullanarak DAPI+popülasyonunun etrafına bir kutu çizin.

Bu, P1 kapısını temsil eder. Floroforların her biri için dağılım grafiklerini seçin ve yalnızca DAPI+olaylarını görüntüleyin. Bu, floroforların her biri için arka plan floresansını temsil eder.

Dikdörtgen kapıyı da kullanarak, floroforların her biri için dağılım grafiklerinde y ekseninde 103'ten başlayarak bir kutu çizin. Bu kapı, belirtilen belirteçlerin her biri için olumlu olayların bulunması gereken bölgeyi temsil eder. Yalnızca DAPI boyama kontrollerini kullanarak floroforların her biri için voltajları ayarlayın.

Numuneyi akış sitometrisine ekleyin ve elde et'e tıklayın. Floroforların her biri için DAPI+popülasyonunun konumunu gözlemleyin ve ilgili voltajları, popülasyonlar dikdörtgen kapının dışına çıkacak şekilde ayarlayın. Akış sitometresi kurulduktan sonra, numuneleri çalıştırın ve daha fazla analiz için İleri Dağılım dosyalarını dışa aktarın.

Akış sitometrisi ile analizden önce DAPI lekesinin yıkanması, çekirdeklenmemiş döküntülerin floresan yoğunluğunu azalttı. Bu, tam olarak sindirilmemiş doku içeren İleri Saçılma ekseninin üst ucundaki materyalin, singlet popülasyonunun seçiminde hariç tutulmasına izin verdi. Genel olarak, iki tam siyatik sinirden düzenli olarak 30.000'den fazla tekil elde edilebilir ve dorsal kök ganglionlarından 200.000'den fazla tekil elde edilebilir.

Siyatik sinirlerden, tekillerin yaklaşık% 5'i yüzeylerinde CD45 eksprese ederken, yaklaşık% 5 ila% 10'unun dorsal kök ganglionlarında eksprese ettiği bulundu ve bu hücreler hematopoietik kökenli lökositler olarak tanımlandı. CD45 pozitif singletlerinin çoğunluğu da kademeli bir şekilde MHC sınıf II'yi ifade etti. Dorsal kök ganglionlarında, CD11b mikroglial benzeri hücreleri tespit etmek için kullanılabilir, ancak; Bu mikroglia popülasyonu siyatik sinirlerde yoktur.

Siyatik sinir ve dorsal kök ganglionunda, singleletlerin %2 ila %5'i CD68 eksprese etti. Siyatik sinirlerde CD68 pozitif makrofajların yaklaşık %60'ı80%80'i CD206 eksprese etmiştir. CD68 pozitifinin daha küçük bir kısmı dorsal kök ganglionunda CD206'yı birlikte eksprese etti.

Bu prosedürü gerçekleştirirken, tutarlı bir sonuç elde etmek için tutarlı bir sıcaklığı korumak önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik diyabet alanındaki araştırmacıların farelerde diyabeti indüklemek için kullanılan streptozotosinin toksik etkilerini keşfetmelerine izin verdi. Bu videoyu izledikten sonra, periferik nöronal dokuda akış sitometrisinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.

Paraformaldehit ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve eldiven ve koruyucu gözlük takmak gibi her zaman önlem alınması gerektiğini unutmayın.