Vitro Enzim ölçüm Test farmakolojik refakatçi yanıt Fabry ve Pompe hastalığı için

Önceden klinik test için "yetim" ilaçların farmakolojik chaperones tekrarlanabilir, hızlı ve verimli olarak adlandırılan yeni bir sınıf yapmak için bir talep var. Biz uygun hastalar için hem de roman farmakolojik refakatçi uyuşturucu ekran basit, yüksek standart ve çok yönlü hücre kültür tabanlı tahlil geliştirilmiştir.

Bu değiştirilmiş hücre kültürü protokolünün genel amacı, Fabry ve Pompe hastalığında alelik varyansın hızlı bir fenotipik değerlendirmesini sağlamaktır. Bu yöntem, prognostik sonuçlar ve terapötik kararlar gibi lizozomal depo hastalıkları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yüksek oranda tekrarlanabilir olması ve farmako-şaperonlar gibi yeni ilaçların geliştirilmesine yardımcı olabilmesidir.

Bölgeye yönelik mutajenezi gerçekleştirmek için, sırasıyla GLA ve GAA genlerinin mutajenezi için şablon olarak NM 00169.2 ve NM 00152.4 referans dizilerini kullanarak başlayın. Astar tasarımını desteklemek için ücretsiz Astar Tasarımı aracını kullanın. Daha sonra, ticari bir sağlayıcı tarafından sentezlenen bir dizi yüksek saflıkta, tuzsuz primere sahip olun, duyu ve antisens primerler, mutasyonu ayrı ayrı tanıtmak için uzunluklarının merkezinde yer alan ilgili dizi modifikasyonlarından birini taşır.

Reaksiyon karışımını 50 mikrolitrelik bir hacimde hazırlayın ve üretici tarafından sağlanan ve metin protokolünde listelendiği gibi standart koşulları kullanarak PCR programını çalıştırın. PCR'yi takiben, bir mikrolitre Dpn1 kısıtlama enzimi ekleyin ve reaksiyon şişelerini bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmeye devam edin. Plazma DNA'sını yetkin E.coli hücrelerine dönüştürdükten ve metin protokolüne göre istenen transformansın plazmitlerini hazırladıktan sonra, diziyi analiz etmek için uygun bir moleküler biyoloji aracı kullanın.

İstenen mutasyon tespit edildiğinde ve alfa-galaktosidaz A için NM 000169.2 veya asit alfa-galaktosidaz için NM 000152.4 ile karşılaştırıldığında başka bir dizi anormalliği görülmediğinde, transfeksiyon dereceli plazmit saflaştırması için klonu seçin. Bir spektrofotometrede absorbansı ölçerek DNA'nın saflığını belirleyin. Metin protokolüne göre bir T75 kültür şişesinde HEK293H hücrelerinin yetiştirilmesinin ardından, transfeksiyondan 24 saat önce, hücreleri bir kez yıkamak için kalsiyum veya magnezyum içermeyen PBS kullanın.

% 0.05 Tripsin-EDTA ile hücreleri hasat edin ve 24 oyuklu bir kültür plakasının boşluklarında, beş hücreye 1.5 kez 10 tohumlamak için% 10 FBS ile desteklenmiş 500 mikrolitre DMEM kullanın. Hücre transfeksiyonunu üreticinin kılavuzuna göre gerçekleştirin. 100 mikrolitre serumsuz DMEM ve 2.5 mikrolitre transfeksiyon reaktifi içinde çözülmüş bir mikrogram plazmit DNA karışımı kullanılarak.

Çözeltiyi oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin, ardından hücrelere damla damla ekleyin. 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de dört saatlik bir süre sonra, transfeksiyon reaktifini içeren ortamı çıkarın ve% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile 500 mikrolitre taze DMEM ekleyin. Bu adım sırasında bir seçenek olarak, amaçlanan yerde kültür ortamına DGJ veya DNJ ekleyin.

Hasat gününde, hücreleri inkübatörden çıkarın. Daha sonra ortamı aspire edin ve hücreleri iki kez dikkatlice yıkamak için PBS'yi kalsiyum ve magnezyum ile kullanın. Bu adım kritiktir, çünkü DGJ ve DNJ her iki enzimin de inhibitörleridir ve bu nedenle herhangi bir kalıntı testi geçersiz kılacaktır.

Yıkamanın ardından, doğrudan hücrelerin üzerine 200 mikrolitre deiyonize su ekleyin. Daha sonra hücreleri plakadan durulayın ve 1.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın. Numuneleri uygun bir köpük rafa yerleştirin ve lizisi daha verimli hale getirmek için beş saniye boyunca girdaplayın.

Ardından, çözülme tamamlanana kadar numuneleri 10 saniye boyunca sıvı nitrojen ile oda sıcaklığında bir su banyosu arasında değiştirin. Homojenizasyon prosedürünü beş kez tekrarladıktan sonra, numuneleri 10.000 g'da beş dakika döndürün. Daha sonra süpernatanı yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın.

BCA testini gerçekleştirmek için, 40 mikrolitre deiyonize H20 içeren her numune için yeni bir tüp hazırlayın ve 10 mikrolitre numune ekleyin. Her bir çözeltiyi kısaca girdaplayarak karıştırın ve her numuneden 10 mikrolitreyi üç nüsha halinde 96 oyuklu bir plakanın boşluklarına aktarın. Standart bir eğri hazırlamak için, mililitre başına 2 miligram BSA stok çözeltisini ve metin protokolüne göre deiyonize H2O'yu seyreltin.

Reaktif A ve reaktif B'yi birleştirdikten sonra, 200 mikrolitre BCA reaktif çözeltisi ekleyerek reaksiyonu başlatın ve numuneleri karanlıkta 37 santigrat derece ve 300 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra bir plaka okuyucuda 560 nanometrede absorbansı ölçün. Numuneler tipik olarak mikrolitre başına bir ila 1.5 mikrogram protein içerir.

Her bir numunenin hesaplanan miktarını seyreltin ve mikrolitre çözelti başına 0.05 mikrogram alfa-galaktosidaz A veya 0.5 mikrogram asit alfa-glukozidaz elde etmek için taze 1.5 mililitrelik reaksiyon tüplerine pipetleyin. Numuneleri tekrar beş saniye vorteksleyin ve bu seyreltmenin 10 mikrolitresini iki kez 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin. İlgili substrat çözeltisinden 20 mikrolitre ekleyerek reaksiyonları başlatın.

Alfa-galaktosidaz A için, 0.06 molar fosfat-sitrat tamponunda, pH 4.7'de iki milimolar 4-metilumbelliferil alfa-D galaktopiranosid veya 4-MU-gal ekleyin. Asit alfa-glukozidaz için, 0.025 molar sodyum asetat, pH 4.0 içinde 2 milimolar 4-metilumbelliferil alfa-D glukopiranozit veya 4-MU-glu ekleyin. Enzim reaksiyonlarını karanlıkta 37 santigrat derece ve 300 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde bir saat inkübe edin.

Daha sonra 200 mikrolitre 1.0 molar pH 10.5 ayarlı glisin sodyum-hidroksit tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın. Metin protokolüne göre mililitre başına 0.01 miligramlık bir stoktan 4-MU'luk standart bir eğri hazırlayın ve 10 mikrolitre çözeltiyi iki kez 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin. Hacmi ve pH'ı ayarlamak için her bir oyuğa 200 mikrolitre 1.0 molar glisin sodyum-hidroksit tamponu ekleyin.

Son olarak, uygun filtre seti ile donatılmış bir floresan okuyucuda enzim aktivitesini ölçün. Ve floresan okuyucu cihazı için uygun yazılımı kullanarak verileri analiz edin. GLA gen mutajenezinin etkinliğini değerlendirmek için, mutasyonlar üç kategoriye ayrıldı ve ilk denemede yaklaşık% 66.5'inin elde edildiği ortaya çıktı.

Hafifçe modifiye edilmiş ikinci bir PCR'den sonra% 25 daha elde edilebilir. Üçüncü kategoride, istenen klonu elde etmek için astarın yeniden tasarımı gibi daha fazla çaba sarf edilmesi gerekiyordu. Bu tablo, tedavi edilmeden bırakılan veya DGJ ve DNJ ile tedavi edilen üç alfa-galaktosidaz A ve üç asit alfa-glukozidaz mutasyonu için enzim aktivitesi ölçüm sonuçlarını ifade eder.

Veriler, substrat devri için mutlak değerler olarak görüntülenir ve vahşi tip enzime normalleştirilmiş nispi değerlere sahiptir. Mutlak enzim aktivitesi verileri, boş bir pcDNA 3.1 vektörü ile transfekte edilmiş hücreler kullanılarak HEK293H hücrelerinin endojen enzim aktivitesi için düzeltildi. Enzim aktivite değerleri, farklı mutantlar arasındaki nispi değerlerin sapmasını açıklayan karşılık gelen deneylerden vahşi tip enzime normalize edildi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, uygulamalı zamanın çoğunu temsil eden bu deneyin hücre sonrası kültür fraksiyonu dört saat içinde yapılabilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, lizozomal depo hastalıkları alanındaki araştırmacıların Fabry ve Pompe hastalığında genotip-fenotip korelasyonlarını keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu protokol, lizozomal depo hastalıklarında yeni ilaçların geliştirilmesine yardımcı olabilir.