Name: Vitro Enzim ölçüm Test farmakolojik refakatçi yanıt Fabry ve Pompe hastalığı için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Öğrenin Fabry ve Pompe hastalığında allelik varyasyonların hücre kültürü tabanlı hızlı fenotipik değerlendirmesi için farmakolojik refakatçi test yöntemini. Bu tekrarlanabilir analiz, lizozomal depo hastalıklarında yeni ilaç geliştirmeyi destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Mandy Loebert ve Tina Czajka için mükemmel teknik destek kabul etmek istiyorum. Flora Luo (Harvard Tıp Okulu, Boston, MA, ABD) dil düzenleme yardım için teşekkür ederiz.

1. hazırlık Mutant pcDNA3.1/GLA ve pcDNA3.1/GAA yapıları
Not: GLA ve dizileri (CD) kodlama GAA klonlama stratejileri bildirilen önceki15,18olmuştur.
<ol>
	<li>Site yönettiği Mutagenesis kullanarak site Yönetmen: Mutagenesis
	<ol>
		<li>Kullanım başvuru NM_000169.2 ve NM_000152.4 GLA ile GAA gen, mutagenesis için şablonlar olarak sırasıyla diziler. İlgili sıra değişiklikleri tek tek mutasyon tanıtmak uzunluğuna Merkezi taşıma duygusu ve Antisens astar ile ticari bir sağlayıcı tarafından sentezlenen yüksek saflıkta tuz ücretsiz astar (25-37-mers) belirledik. Astar tasarım19destek için ücretsiz astar tasarım aracını kullanın.</li>
		<li>Reaksiyon karışımı için tepki çözüm için standart koşullar ve üretici tarafından sağlanan PCR koşullar kullanın.<ol>
			<li>Mix 5 µL tepki arabellek, 10 x 10 ng çift iplikçikli şablon plazmid DNA (pcDNA3.1/GLA veya pcDNA3.1/GAA), 125 ng her astar, sağlanan dNTP karışımdan 1 µL, DMSO reaktif uygun bir birimdeki deiyonize su (son tepki Cilt 3 µL : 50 ΜL). Son olarak, 2.5 U DNA polimeraz ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Bir negatif kontrol no-astar örnek taşımak.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aşağıdaki programı kullanarak PCR başlatmak: adım 1: 95 ° C 1 dk. için adım 2: 95 ° C 50 s, adım 3: 60 ° C 50 s, adım 4: 68 ° C 8 min için adım 2-4 18 kez tekrarlayın ve adım 5: 68 ° C 10 dk için.<ol>
			<li>Dpn1 µL PCR, ekleyin ben restriksiyon enzimi (10 U/µL) ve daha fazla tepki flakon 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dönüşüm ve istenen klon için tarama
	<ol>
		<li>Bir aliquot uygun olarak üreticinin önerilerini ultracompetent hücrelerinin dönüşümü. Kullanım SOC orta (tryptone %2 (w/v), Maya %0,5 (w/v), NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM özü, 121 ° C'de sterilize ve steril filtre çözümleri MgCl2 ve glikoz ikiye kadar 10 ila 20 mM, son konsantrasyonları sırasıyla ekleyin) Üretici yerine Orta. Yordamı sonra örnek mutagenesis bir LB üzerinde plaka 250 µL içeren 100 µg/mL Ampisilin plaka ve 18 h için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Transformants sayısı temin &#62; 10 ve tepki verir en az üç kat daha fazla kolonileri no-astar kontrol tepki, koloni sayımı kolaylaştırmak için aydınlık bir tabak kullanarak örneğin,. Daha sonra 3 kolonileri alın ve 3 mL LB suyu orta gece kültürlerde hazırlamak.</li>
		<li>Ertesi gün, plazmid hazırlık Standart kit ile gerçekleştirmek ve tüm sıra T7 kullanarak analiz (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA etiketi GG-3ʹ) ve BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) astar standart Sanger üzerinden sıralama.</li>
		<li>Sıra analiz için uygun moleküler biyoloji aracını kullanın. Ne zaman istenen mutasyon tespit ve daha fazla NM_000169.2 (α-galaktozidaz A) göre anormallik sıra no veya NM_000152.4 (asit α-glucosidase) görülür, transfection-grade plazmid arıtma için klon seçin.</li>
		<li>DNA'ın saflık bir Spektrofotometre Absorbans ölçerek belirlemek. Not: plazmid saflık 260/280 Absorbans oranında verim hazırlıklar izin &#62; 1.8 hücre kültür deneyler.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. HEK293H hücreleri tarımı
<ol>
	<li>HEK293H hücreleri yüksek glikoz (4,5 g/M) % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco´s modifiye kartal orta (DMEM) korumak. Hücreleri aklında bulunsun bir kuluçka %5 CO2 atmosfer altında 37 ° C'de water-jacket.</li>
	<li>Yoğunluk % 80-90 hücrelere yetiştirmek.</li>
	<li>Orta Aspire edin ve fosfat kullanarak tamponlu tuz (PBS) Ca2 + ve Mg2 +olmadan bir kez yıkayın.</li>
	<li>Geçit ekleyerek % 0.05 tripsin-EDTA ve 37 ° C ve % 5 CO25 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Hücreleri 1:15 taze orta ve tohum kalıcı kültür korumak için yeni bir T75 şişesi bölünmüş. Hücreleri ile 25'ten fazla pasajlar kullanmayın.</li>
</ol>
3. pcDNA3.1/GLA ve pcDNA3.1/GAA plazmid Transfection ve HEK293H tedavi
<ol>
	<li>24 saat önce transfection, bir T75 hücre kültür şişesi kez PBS ile Ca+ 2, Mg2 +ile HEK293H hücrelerde yıkayın. Yukarıda belirtildiği gibi %0,05 tripsin-EDTA içeren hücreleri ve tohum 1.5 x 10%5 10 ile desteklenmiş 500 µL DMEM orta kullanarak 24 iyi kültür plaka boşluklar hücrelerde hasat FBS Antibiyotikler olmadan.</li>
	<li>Transfection Protokolü Üretici kılavuzuna göre yerine getirir. Genellikle, plazmid DNA'ın 1 µg ve transfection reaktif 2.5 µL serum-Alerjik DMEM 100 µL içinde kullanılır. Oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya ve hücrelere bundan sonra drop-wise bir şekilde ekleyin.</li>
	<li>4 h 37 °C/5% CO2 bir süre sonra transfection reaktif içeren orta kaldırın ve taze DMEM % 10 ile 500 µL ekleyin FBS / % 1 penisilin/streptomisin. Not: Bu adım sırasında Deoxygalactonojirimycin 1 hidroklorür (DGJ) veya Deoxynojirimycin 1 hidroklorür (DNJ) kültür ortamına eklenmiş olabilir amaçlanan nerede (20 µM son bir konsantrasyon elde etmek için 10 mm sulu bir hisse senedi çözüm kullanmak DGJ ve DNJ ). Taze DGJ veya DNJ 42 h plazmid transfection sonra eklendi.</li>
</ol>
4. hücre hasat ve α-galaktozidaz A veya asit α-glucosidase etkinlik ölçümü
<ol>
	<li>Hücre hasat
	<ol>
		<li>Hasat günü, hücreleri kuluçka makinesi kaldır ve orta Aspire edin. Dikkatle bulunduğu hücreleri PBS ile Ca2 + ve Mg2 +2 kere yıkayın. Not: DGJ ve DNJ α-galaktozidaz ve α-glucosidase, güçlü inhibitörleri sırasıyla herhangi bir artık test geçersiz kılacak olduğundan, bu adım önemlidir.</li>
		<li>Deiyonize su hücreleri doğrudan üzerine 200 µL ekleyin. Plaka hücrelerden durulayın ve 1,5 mL tepki tüp aktarabilirsiniz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homojenizasyon tarafından dondurma ve çözme
	<ol>
		<li>Bir uygun köpük raf ve 5 için girdap örnekleri koymak lizis daha verimli hale getirmek için s. 10 için sıvı azot alternatif örnekleri koymak s ve çözdürme tam (5 dk) olana bir oda sıcaklığında su banyosunda.</li>
		<li>Bu yordamı 5 kez tekrarlayın ve sonra örnekleri 10.000 x g de 5 min için spin.</li></ol></li></ol>Süpernatant ve pipet yeni bir tepki tüp korur.
	
	
	<li>Protein konsantrasyonu belirlenmesi bicinchoninic asit (BCA) tahlil kullanma
	<ol>
		<li>Taze bir tüp deiyonize H2O 40 µL içeren her örnek için hazırlamak ve örnek 10 µL ekleyin. Çözüm vortexing tarafından kısa bir süre karıştırın ve 10 µL 96 iyi plaka (nüsha her örnekte) bir kavite içine aktarın. 2 mg/mL sığır serum albumin (BSA) hisse senedi çözeltilerine aşağıdaki gibi standart bir eğri elde etmek için deiyonize H2O seyreltik: 50 µL H2O/50 µL BSA; 60 µL H2O/40 µL BSA; 70 µL H2O/30 µL BSA; 80 µL H2O/20 µL BSA; 90 µL H2O/10 µL BSA; 100 µL H2O.</li>
		<li>Reaksiyon BCA reaktif 200 µL ekleyerek başlayın (Reaktif A ve Reaktif B karışık bir 50: 1 oranında) ve karanlıkta bir orbital Çalkalayıcı (300 rpm) üzerinde hafif ajitasyon altında 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya. 560 Absorbans ölçmek nm bir plaka okuyucu. Not: Örnekler genellikle 1 ile 1,5 µg protein µL başı arasında içerir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Enzim aktivitesi ölçümü ile yapay 4-Methylumbelliferyl yüzeylerde (4-kupa)
	<ol>
		<li>Her örnek ve damlalıklı hesaplanan miktarı 0,05 (için α-galaktozidaz A) veya (için asit α-glucosidase) 0,5 µg protein/µL çözümler elde etmek için taze 1,5 mL tepki tüpler içine sulandırmak. Girdap örnekleri 5 s tekrar ve damlalıklı 10 µL, 96 içine bu seyreltme için de plaka (yinelenen her örnekte).</li>
		<li>Reaksiyon ilgili substrat çözeltisi 20 µL ekleyerek başlayın α-galaktozidaz A: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside için (4-MU-gal) 0,06 M fosfat sitrat tampon pH 4.7. Asit α-glucosidase için: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) 0,025 M sodyum asetat, pH 4.0 içinde.</li>
		<li>Karanlıkta bir orbital Çalkalayıcı (300 rpm) üzerinde hafif ajitasyon altında 37 ° C'de 1 h için enzim reaksiyonları kuluçkaya. Reaksiyon 1.0 m, pH 10,5 ayarlanan glisin-NaOH arabellek 200 µL eklenmesi tarafından sonlandırın.</li>
		<li>4-methylumbelliferone (4-MU) 0.01 mg/mL stoktan standart bir eğri şekilde hazırlayın: 100 µL H2O / Hayır 4-MU; 80 µL H2O / 20 µL 4-MU; 60 µL H2O / 40 µL 4-MU; 40 µL H2O / 60 µL 4-MU; 20 µL H2O / 80 µL 4-MU; hiçbir H2O / 100 µL 4-MU, damlalıklı 10 µL her seyreltme 96 kuyuya, plaka (Yineleme) ve 200 µL 1,0 M glisin-NaOH arabelleği her şey için ses ayarı ve pH için ekleyin.</li>
		<li>Ölçü enzim etkinliği bir floresan okuyucu uygun filtre seti ile donatılmış ve floresan okuyucu aygıt için uygun yazılımı kullanarak veri analiz. Not: Her iki 4-kulplu sürahi yüzeylerde 4-MU için α-galaktozidaz A veya asit α-glucosidase maruz kalma sırasında azaltılır. Yayımlanan 4-MU 360 ve 465 nm'de uyarma ve emisyon dalga boylarında, sırasıyla, bir Mikroplaka Floresans okuyucu kullanarak ölçülebilir bir fluorochrome var.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Cardiff University. , 
 <a target="_blank" href="http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.">http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.</a> (2017).</li>
<li>Meiji Pharmaceutical University. , <a target="_blank" href="http://fabry-database.org">http://fabry-database.org</a> (2017).</li>
<li>Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , <a target="_blank" href="http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en">http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en</a> (2017).</li>
<li>Ishii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+alpha-galactosidase+A+enzymes+identified+in+Fabry+disease+patients+with+residual+enzyme+activity%3A+biochemical+characterization+and+restoration+of+normal+intracellular+processing+by+1-deoxygalactonojirimycin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin.</a> Biochem J. 406, 285-295 (2007).</li>
<li>Tajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+studies+on+Pompe+disease+and+a+%26%2334%3Bpseudodeficiency+of+acid+alpha-glucosidase%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical studies on Pompe disease and a &#34;pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase&#34.</a> J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).</li>
<li>Lukas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+Clinical+Consequences+of+Novel+%CE%B1-Galactosidase+A+Mutations+in+Fabry+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease.</a> Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).</li>
<li>Parenti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+lysosomal+storage+diseases+with+pharmacological+chaperones%3A+from+concept+to+clinics%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics.</a> EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).</li>
<li>Yasuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabry+disease%3A+characterization+of+alpha-galactosidase+A+double+mutations+and+the+D313Y+plasma+enzyme+pseudodeficiency+allele%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele.</a> Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).</li>
<li>Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mutations+of+the+GLA+gene+in+Japanese+patients+with+Fabry+disease+and+their+functional+characterization+by+active+site+specific+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone.</a> Hum Mutat. 29, 331(2008).</li>
<li>Andreotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+of+Fabry+disease+with+pharmacological+chaperones%3A+from+in+silico+predictions+to+in+vitro+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests.</a> Orphanet J Rare Dis. 6, 66(2011).</li>
<li>Khanna, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharmacological+chaperone+AT2220+increases+the+specific+activity+and+lysosomal+delivery+of+mutant+acid+alpha-glucosidase%2C+and+promotes+glycogen+reduction+in+a+transgenic+mouse+model+of+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease.</a> PLoS One. 9, e102092(2014).</li>
<li>Siekierska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Galactosidase+aggregation+is+a+determinant+of+pharmacological+chaperone+efficacy+on+Fabry+disease+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants.</a> J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).</li>
<li>Parenti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+enhancement+of+mutated+alpha-glucosidase+activity+in+fibroblasts+from+patients+with+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease.</a> Mol Ther. 15, 508-514 (2007).</li>
<li>Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pharmacogenetic+approach+to+identify+mutant+forms+of+%CE%B1-galactosidase+A+that+respond+to+a+pharmacological+chaperone+for+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease.</a> Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).</li>
<li>Lukas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterisation+of+alpha-galactosidase+a+mutations+as+a+basis+for+a+new+classification+system+in+fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease.</a> PLoS Genet. 9, e1003632(2013).</li>
<li>Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermodynamic+assay+to+test+pharmacological+chaperones+for+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).</li>
<li>, <a target="_blank" href="https://www.google.ch/patents/US9095584">https://www.google.ch/patents/US9095584</a> (2017).</li>
<li>Lukas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+enhancers+for+the+treatment+of+Fabry+and+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease.</a> Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).</li>
<li>, <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp ">http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp </a> (2017).</li>
<li>Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+chaperone+corrects+lysosomal+storage+in+Fabry+disease+caused+by+trafficking-incompetent+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).</li>
<li>Shin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+pharmacological+chaperones+in+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease.</a> Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).</li>
<li>Shin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+response+of+mutated+alpha-galactosidase+A+to+a+pharmacological+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone.</a> Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).</li>
<li>Filoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+new+GLA+gene+mutations+leading+to+conformational+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).</li>
<li>Citro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Large+Phenotypic+Spectrum+of+Fabry+Disease+Requires+Graduated+Diagnosis+and+Personalized+Therapy%3A+A+Meta-Analysis+Can+Help+to+Differentiate+Missense+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations.</a> Int J Mol Sci. 17, (2016).</li>
<li>Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabry_CEP%3A+a+tool+to+identify+Fabry+mutations+responsive+to+pharmacological+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones.</a> Orphanet J Rare Dis. 8, 111(2013).</li>
<li>Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+correlation+between+the+residual+activity+of+beta-hexosaminidase+A+and+arylsulfatase+A+and+the+severity+of+the+resulting+lysosomal+storage+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease.</a> Hum Genet. 88, 513-523 (1992).</li>
<li>Germain, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+pharmacodynamic+effects+of+a+pharmacological+chaperone+on+%CE%B1-galactosidase+A+activity+and+globotriaosylceramide+clearance+in+Fabry+disease%3A+report+from+two+phase+2+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies.</a> Orphanet J Rare Dis. 7, 91(2012).</li>
<li>Hughes, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+pharmacological+chaperone+migalastat+compared+with+enzyme+replacement+therapy+in+Fabry+disease%3A+18-month+results+from+the+randomised+phase+III+ATTRACT+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study.</a> J Med Genet. 54, 288-296 (2017).</li>
<li>Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Chaperone+Therapy%3A+Preclinical+Development%2C+Clinical+Translation%2C+and+Prospects+for+the+Treatment+of+Lysosomal+Storage+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders.</a> Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).</li>
<li>Parenti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Chaperone+Enhances+Blood+%CE%B1-Glucosidase+Activity+in+Pompe+Disease+Patients+Treated+With+Enzyme+Replacement+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy.</a> Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Burada açıklanan protokol metabolizma kalıtsal lizozomal hastalıklar enzim hasar değerlendirmesi için sağlam sonuçlar sunar. Bu el yazması bir değişiklik Protokolü önceki15Yayınlanan olduğunu. (Yani, mutant vektör yapı hazırlık sürecinde), sıkılık en önemli değişiklikler içeren hücre kültür Protokolü (örneğin, HEK293H hücre bakım ve transfection koşulları) ve yüksek standardizasyonu (en az 5), son derece sonuçları tekrarlanabilirlik için katkıda deneysel Tekrarlamaların sayısını....

Orada glycosidase disfonksiyon birincil gen mutasyonlar sonucu ile ilgili bir düzine Lizozomal depo bozuklukları (LSDs) üzerinde. Fabry (OMIM #301500) ve Pompe (OMIM #232300) hastalığı, fazla 500 ve 200 missense1,2,3 bildirilmiştir, mutasyonlar sırasıyla hangi toplam mutasyon sayısı yaklaşık % 60 karşılık gelir. Çok sayıda yeni gen değişik hala tespit edilmektedir, birçoğu bilinmeyen var önemi. Geniş biyokimyasal araştırmalar ortaya bazı genotip bir tam kaybı-in-işleve GLA gen yol değil (OMIM * 300644) Fabry hastalığı, ama neden thermodynamically tercih katlama devlet4 ulaşmak başarısız olmasına karşılık gelen enzim . Bu ER saklama ve aksi takdirde fonksiyonel enzim erken bozulma ile sonuçlanır. Benzer sonuçlar Pompe hastalığı5de dahil olmak üzere diğer LSDs çizilmiştir. Ayrıca, enzim değişik moleküler karakterizasyonu mutasyonlar klinik yorumlanması tanı6LSD ilerleme mutasyon niteliğine göre bireysel bir süreç olduğunu düşündüren, zamanında kolaylaştırabilir. Bu nedenle, genellikle 2-3 farklı klinik tipi içine Geleneksel sınıflandırma klinik danışmanlık ve tedavi edici kararlar verimlilik düzeyini artırmak amacıyla yeniden değerlendirmeye.
Enzim replasman tedavisi (ERT) her iki hastalık için kullanılabilir. ERT, ancak, etkilenen doku/organ beyin ve kas iskelet gibi etkinlik sınırlıdır. Ayrıca, ERT terapötik yararları tehlikeye atıyor immünojenik bir yanıt temin. Farmakolojik Chaperones (adet) sözde duyarlı mutasyonlar olan hastalar için bir çekici tedavi alternatiftir. Adet doğru protein katlanması ve endoplazmik retikulum (ER) tutma ve ER ilişkili bozulması enzim sırayla önleyen stabilization için moleküler bir iskele olarak hizmet vermektedir. Ayrıca, adet sözlü olarak yönetilebilen ve potansiyel olarak kan beyin bariyerini çapraz edebiliyoruz. Bu nedenle, PCT belirli genotip olan hastalar tedavi için daha uygun bir seçenek olabilir. LSDs uygulamada PC üzerinde kapsamlı bir inceleme için mükemmel inceleme Parenti7tarafından bakın.
Mutant gen neden olan hastalık yüzlerce keşfi önceden klinik uyuşturucu testi zorlukları ve mükellef hastalar kişiselleştirilmiş tıp yaklaşım için bir basit, hızlı ve yüksek standart değerlendirme gerektirir. LSD gen mutasyonlarının zararlı etkilerini değerlendirmek amacıyla ve mükellef hastalar için PCT tahmin etmek için aday mutasyon test etmek için hızlı ve güvenilir enzim aktivitesi ölçümü için sağlayan bir yüksek standart aşırı ifade sistem HEK293H hücrelerdeki oldu geliştirdi. Benzer aşırı ifade sistemleri daha önce tarif edilmiş COS-78,9,10,11, HeLa hücreleri12veya HEK293 kullanarak Fabry ve Pompe hastalığı için13 ,14,15,16 hücreleri glycosidase gen için.
Çok benzer bir yöntem bile hastalıkların farmakolojik refakatçi tedaviye yanıt tahmin etmek için bir "yöntemi" olarak patentli bir hücre uygunluğunu gösteren17 kültür sistemi klinik uygulamaya entegre yeteneğine sahip.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL Siteye Yönelik Mutajenez Kiti&nbsp;</td><td>Stratagene, La Jolla, CA, ABD</td> <td># 200522</td><td></td></tr><tr><td>Astar GLA [R301Q] -frw: 5 akut; - CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3 & akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Almanya</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[R301Q]-rev: 5&akut;- GGG, CTG, ATG, TGT, TGG, AGG, TGA, TCA, TTA, G-3&akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Almanya</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw: 5&akut;-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3&akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Almanya</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-rev: 5&akut;-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3&akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Almanya</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw: 5&akut;-GGA, AAT, AAA, ACC, TGC, ACA GGC, TTC, CCT, GGG, A-3&akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Almanya</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A143T]-rev: 5&akut;-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3&akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Almanya</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-frw: 5&akut;-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3&akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Almanya</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-rev: 5&akut;-TCG ETİKETİ GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3&akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Almanya</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-frw: 5&akut;-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3&akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Almanya</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev: 5&akut;-CCA, ACC, ACC, CCA, AGA, AGG, TAG, GGT, G-3&akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Almanya</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA [L552P] -frw: 5 akut; -TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3 & akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Almanya</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev: 5&akut;-GTG, GCC, GCC, TGG, GGG, GTC, CCC, CCA, A-3&akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Almanya</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>T7: 5&akut;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3&akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Almanya</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>BGHrev: 5&akut;-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3&akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Almanya</td><td>n.a.Tryptone</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>8952.1</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>103,753</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1,049,360,500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x 6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1,058,330,250</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-Glikoz monohidrat</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1,083,422,500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1,064,980,500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>3908.2</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik asit</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>X863.3</td><td></td></tr><tr><td>disodyum hidrojen fosfat</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1,065,860,500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1,062,640,050</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>Sigma Aldrich, Münih, Almanya</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB Orta</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plazmid Miniprep Kiti</td><td>ZymoResearch, Freiburg, Almanya</td><td>D4020</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter Plazmid Midi Kiti</td><td>Qiagen, Hilden, Almanya</td><td>12245</td><td></td></tr><tr><td>HEK293H hücre hattı</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Almanya</td><td>11631-017&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&akut; s Modifiye Eagle Medium&nbsp;</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Almanya</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>HyClone fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>GE Healthcare, South Logan, Utah, ABD</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Almanya</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Standart Hücre Kültürü Şişeleri, Greiner Bio One</td><td>VWR International GmbH, Hannover, Almanya</td><td>82050-854</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü plakaları (24 kuyulu)</td> <td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Almanya</td><td>831,836</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 96 kuyulu plaka</td><td>Greiner bio one, Frickenhausen, Almanya</td><td>655185</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal reaksiyon tüpleri, 1,5 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Almanya</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Almanya</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>1-Deoksigalaktojirimisin Hidroklorür &nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, Münih, Almanya</td><td>D9641</td><td></td></tr><tr><td>1-Deoksigalaktojirimisin Hidroklorür&nbsp;</td><td>Toronto Araştırma Kimyasalları, Toronto, Kanada</td><td>D236500</td><td></td></tr><tr><td>1-Deoksinojirimisin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, Münih, Almanya</td><td>D9305</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco, Kalsiyumsuz, Magnezyum</td><td>Biochrom olmadan, Berlin, Almanya</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Almanya</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test</td><td>Kiti Thermo Scientific, Braunschweig, Almanya</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilumbelliferon</td><td>Sigma Aldrich, Münih, Almanya</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilumbelliferil ve alfa;-D-galaktopiranosid</td><td>Sigma Aldrich, Münih, Almanya</td><td>M7633</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilumbelliferil ve alfa;-D-glukopiranosid</td><td>Sigma Aldrich, Münih, Almanya</td><td>M9766</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inkübatör tipi T6</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Almanya</td><td>n.a.Işıklı</td><td></td></tr> <tr><td>Plaka Gr. 2 E</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>P265.1</td><td></td></tr><tr><td>3130 xl Genetik Analiz Cihazı&nbsp;</td><td>Applied Biosystems, Darmstadt, Almanya</td><td>n.a.GFL-3032</td><td></td></tr> <tr><td>bakteri çalkalayıcı</td><td>GFL, Burgwedel, Almanya&nbsp;</td><td>n.a.Avanti</td><td></td></tr> <tr><td>J-25 santrifüj</td><td>Beckman/Coulter, Krefeld, Almanya</td><td>n.a.Ultraspec</td><td></td></tr> <tr><td>3100 pro Spektrofotometre</td><td>Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Birleşik Krallık</td><td>n.a.Water-Jacket</td><td></td></tr> <tr><td>inkübatörü&nbsp;</td><td>Binder, Tuttlingen, Almanya</td><td>n.a.Vortex</td><td></td></tr> <tr><td>Genie 1 dokunmatik karıştırıcı</td><td>Scientific Industries, Bohemia, NY, ABD</td><td>n.a.Z</td><td></td></tr> <tr><td>233 MK-2 soğutmalı mikrotüp santrifüj</td><td>Hermle, Tuttlingen, Almanya&nbsp;</td><td>n.a.LaboStar</td><td></td></tr> <tr><td>ultra saf su cihazı</td><td>Siemens, Berlin, Almanya</td><td>n.a.Thermo</td><td></td></tr> <tr><td>Shaker PST-60HL-4 orbital çalkalayıcı</td><td>Biosan, Riga, Letonya</td><td>n.a.Tecan</td><td></td></tr> <tr><td>GENios Reader</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf, İsviçre</td><td>n.a.HI</td><td></td></tr> <tr><td>223 Mikroişlemcili pH Metre</td><td>HANNA Instruments, Arvore, Portekiz</td><td>n.a.CASY</td><td></td></tr><tr><td> Hücre Sayacı + Analizör Sistemi Model TT</td><td>Innovatis AG, Cham/Zug, İsviçre</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magellan veri analiz yazılımı v6.6</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf, İsviçre</td><td>n.a.GraphPad</td><td></td></tr> <tr><td>Prism 5.04</td><td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; ABD</td><td>n.a.Microsoft</td><td></td></tr> <tr><td>Office 2010</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, ABD</td><td>n.a.BioEdit</td><td></td></tr> <tr><td>Alignment Editor, V7.0.1</td><td>http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Kısaltmalar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>frw = ileri; rev = ters</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>n.a. = uygulanamaz</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vitro enzim ölçüm test farmakolojik refakatçi yanıt fabry ve pompe hastalığı için

In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease

Lizozomal depo bozuklukları (LSDs) gibi nadir monogenic hastalıkları tedavi etmek için kişiselleştirilmiş ilaç kullanımı karmaşık klinik deneme tasarımları, yüksek maliyetleri ve düşük hasta sayıları tarafından reddedilmiştir. Mutant gen yüzlerce LSDs çoğunda karıştığı. Hastalıklar genellikle 2-3 farklı klinik tipi önem göre sınıflandırılır. Ayrıca, genotip moleküler karakterizasyonu klinik sonuçlar tahmin ve hasta bakımı hakkında bilgi yardımcı olabilir. Bu nedenle, biz heterologously Fabry ve Pompe hastalığı tespit mutasyonlar aşırı ifade HEK293H hücreleri temel alan bir basit hücre kültür tahlil geliştirilmiştir. Benzer bir tahlil son zamanlarda mükellef mutasyonların farmakolojik refakatçi terapi (PCT) Fabry hastalığı tanımlamak için preklinik bir test olarak girmiştir. Bu el yazması hızlı fenotipik değerlendirme Fabry ve Pompe hastalığında uygun hastalar için PCT tanımlamak için allelic versiyonlarının ve roman pharmacochaperones gelişmesinde yardımcı olabilir bu bir değişik hücre kültür tahlil açıklar.

Mutagenesis yordamı Mutasyonlar GLA gen mutagenesis etkinliğini değerlendirmek için aşağıdaki kategorilerden birine sınıflandırıldı. Mutasyonlar oluşturmak için bu yaklaşım ortaya koydu bu ilk denemede GLA mutasyonların yaklaşık % 66.5 elde edilmiştir. Daha fazla % sonra biraz değiştirilmiş bir ikinci PCR elde.
Kategori 1: Mutagenesis PCR ilk denemesinde etkili oldu.
<p class="jove_conte...

Önceden klinik test için "yetim" ilaçların farmakolojik chaperones tekrarlanabilir, hızlı ve verimli olarak adlandırılan yeni bir sınıf yapmak için bir talep var. Biz uygun hastalar için hem de roman farmakolojik refakatçi uyuşturucu ekran basit, yüksek standart ve çok yönlü hücre kültür tabanlı tahlil geliştirilmiştir.

Vitro Enzim ölçüm Test farmakolojik refakatçi yanıt Fabry ve Pompe hastalığı için

The use of personalized medicine to treat rare monogenic diseases like lysosomal storage disorders (LSDs) is challenged by complex clinical trial designs, ...

Bu değiştirilmiş hücre kültürü protokolünün genel amacı, Fabry ve Pompe hastalığında alelik varyansın hızlı bir fenotipik değerlendirmesini sağlamaktır. Bu yöntem, prognostik sonuçlar ve terapötik kararlar gibi lizozomal depo hastalıkları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yüksek oranda tekrarlanabilir olması ve farmako-şaperonlar gibi yeni ilaçların geliştirilmesine yardımcı olabilmesidir.Bölgeye yönelik mutajenezi gerçekleştirmek için, sırasıyla GLA ve GAA genlerinin mutajenezi için şablon olarak NM 00169.2 ve NM 00152.4 referans dizilerini kullanarak başlayın. Astar tasarımını desteklemek için ücretsiz Astar Tasarımı aracını kullanın. Daha sonra, ticari bir sağlayıcı tarafından sentezlenen bir dizi yüksek saflıkta, tuzsuz primere sahip olun, duyu ve antisens primerler, mutasyonu ayrı ayrı tanıtmak için uzunluklarının merkezinde yer alan ilgili dizi modifikasyonlarından birini taşır.Reaksiyon karışımını 50 mikrolitrelik bir hacimde hazırlayın ve üretici tarafından sağlanan ve metin protokolünde listelendiği gibi standart koşulları kullanarak PCR programını çalıştırın. PCR'yi takiben, bir mikrolitre Dpn1 kısıtlama enzimi ekleyin ve reaksiyon şişelerini bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmeye devam edin. Plazma DNA'sını yetkin E.coli hücrelerine dönüştürdükten ve metin protokolüne göre istenen transformansın plazmitlerini hazırladıktan sonra, diziyi analiz etmek için uygun bir moleküler biyoloji aracı kullanın.İstenen mutasyon tespit edildiğinde ve alfa-galaktosidaz A için NM 000169.2 veya asit alfa-galaktosidaz için NM 000152.4 ile karşılaştırıldığında başka bir dizi anormalliği görülmediğinde, transfeksiyon dereceli plazmit saflaştırması için klonu seçin. Bir spektrofotometrede absorbansı ölçerek DNA'nın saflığını belirleyin. Metin protokolüne göre bir T75 kültür şişesinde HEK293H hücrelerinin yetiştirilmesinin ardından, transfeksiyondan 24 saat önce, hücreleri bir kez yıkamak için kalsiyum veya magnezyum içermeyen PBS kullanın.% 0.05 Tripsin-EDTA ile hücreleri hasat edin ve 24 oyuklu bir kültür plakasının boşluklarında, beş hücreye 1.5 kez 10 tohumlamak için% 10 FBS ile desteklenmiş 500 mikrolitre DMEM kullanın. Hücre transfeksiyonunu üreticinin kılavuzuna göre gerçekleştirin. 100 mikrolitre serumsuz DMEM ve 2.5 mikrolitre transfeksiyon reaktifi içinde çözülmüş bir mikrogram plazmit DNA karışımı kullanılarak.Çözeltiyi oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin, ardından hücrelere damla damla ekleyin. 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de dört saatlik bir süre sonra, transfeksiyon reaktifini içeren ortamı çıkarın ve% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile 500 mikrolitre taze DMEM ekleyin. Bu adım sırasında bir seçenek olarak, amaçlanan yerde kültür ortamına DGJ veya DNJ ekleyin.Hasat gününde, hücreleri inkübatörden çıkarın. Daha sonra ortamı aspire edin ve hücreleri iki kez dikkatlice yıkamak için PBS'yi kalsiyum ve magnezyum ile kullanın. Bu adım kritiktir, çünkü DGJ ve DNJ her iki enzimin de inhibitörleridir ve bu nedenle herhangi bir kalıntı testi geçersiz kılacaktır.Yıkamanın ardından, doğrudan hücrelerin üzerine 200 mikrolitre deiyonize su ekleyin. Daha sonra hücreleri plakadan durulayın ve 1.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın. Numuneleri uygun bir köpük rafa yerleştirin ve lizisi daha verimli hale getirmek için beş saniye boyunca girdaplayın.Ardından, çözülme tamamlanana kadar numuneleri 10 saniye boyunca sıvı nitrojen ile oda sıcaklığında bir su banyosu arasında değiştirin. Homojenizasyon prosedürünü beş kez tekrarladıktan sonra, numuneleri 10.000 g'da beş dakika döndürün. Daha sonra süpernatanı yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın.BCA testini gerçekleştirmek için, 40 mikrolitre deiyonize H20 içeren her numune için yeni bir tüp hazırlayın ve 10 mikrolitre numune ekleyin. Her bir çözeltiyi kısaca girdaplayarak karıştırın ve her numuneden 10 mikrolitreyi üç nüsha halinde 96 oyuklu bir plakanın boşluklarına aktarın. Standart bir eğri hazırlamak için, mililitre başına 2 miligram BSA stok çözeltisini ve metin protokolüne göre deiyonize H2O'yu seyreltin.Reaktif A ve reaktif B'yi birleştirdikten sonra, 200 mikrolitre BCA reaktif çözeltisi ekleyerek reaksiyonu başlatın ve numuneleri karanlıkta 37 santigrat derece ve 300 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra bir plaka okuyucuda 560 nanometrede absorbansı ölçün. Numuneler tipik olarak mikrolitre başına bir ila 1.5 mikrogram protein içerir.Her bir numunenin hesaplanan miktarını seyreltin ve mikrolitre çözelti başına 0.05 mikrogram alfa-galaktosidaz A veya 0.5 mikrogram asit alfa-glukozidaz elde etmek için taze 1.5 mililitrelik reaksiyon tüplerine pipetleyin. Numuneleri tekrar beş saniye vorteksleyin ve bu seyreltmenin 10 mikrolitresini iki kez 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin. İlgili substrat çözeltisinden 20 mikrolitre ekleyerek reaksiyonları başlatın.Alfa-galaktosidaz A için, 0.06 molar fosfat-sitrat tamponunda, pH 4.7'de iki milimolar 4-metilumbelliferil alfa-D galaktopiranosid veya 4-MU-gal ekleyin. Asit alfa-glukozidaz için, 0.025 molar sodyum asetat, pH 4.0 içinde 2 milimolar 4-metilumbelliferil alfa-D glukopiranozit veya 4-MU-glu ekleyin. Enzim reaksiyonlarını karanlıkta 37 santigrat derece ve 300 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde bir saat inkübe edin.Daha sonra 200 mikrolitre 1.0 molar pH 10.5 ayarlı glisin sodyum-hidroksit tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın. Metin protokolüne göre mililitre başına 0.01 miligramlık bir stoktan 4-MU'luk standart bir eğri hazırlayın ve 10 mikrolitre çözeltiyi iki kez 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin. Hacmi ve pH'ı ayarlamak için her bir oyuğa 200 mikrolitre 1.0 molar glisin sodyum-hidroksit tamponu ekleyin.Son olarak, uygun filtre seti ile donatılmış bir floresan okuyucuda enzim aktivitesini ölçün. Ve floresan okuyucu cihazı için uygun yazılımı kullanarak verileri analiz edin. GLA gen mutajenezinin etkinliğini değerlendirmek için, mutasyonlar üç kategoriye ayrıldı ve ilk denemede yaklaşık% 66.5'inin elde edildiği ortaya çıktı.Hafifçe modifiye edilmiş ikinci bir PCR'den sonra% 25 daha elde edilebilir. Üçüncü kategoride, istenen klonu elde etmek için astarın yeniden tasarımı gibi daha fazla çaba sarf edilmesi gerekiyordu. Bu tablo, tedavi edilmeden bırakılan veya DGJ ve DNJ ile tedavi edilen üç alfa-galaktosidaz A ve üç asit alfa-glukozidaz mutasyonu için enzim aktivitesi ölçüm sonuçlarını ifade eder.Veriler, substrat devri için mutlak değerler olarak görüntülenir ve vahşi tip enzime normalleştirilmiş nispi değerlere sahiptir. Mutlak enzim aktivitesi verileri, boş bir pcDNA 3.1 vektörü ile transfekte edilmiş hücreler kullanılarak HEK293H hücrelerinin endojen enzim aktivitesi için düzeltildi. Enzim aktivite değerleri, farklı mutantlar arasındaki nispi değerlerin sapmasını açıklayan karşılık gelen deneylerden vahşi tip enzime normalize edildi.Bir kez ustalaştıktan sonra, uygulamalı zamanın çoğunu temsil eden bu deneyin hücre sonrası kültür fraksiyonu dört saat içinde yapılabilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, lizozomal depo hastalıkları alanındaki araştırmacıların Fabry ve Pompe hastalığında genotip-fenotip korelasyonlarını keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu protokol, lizozomal depo hastalıklarında yeni ilaçların geliştirilmesine yardımcı olabilir.

in-vitro-enzyme-measurement-to-test-pharmacological-chaperone

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu protokol ısı şok sonra hücre içi protein refolding ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, faaliyetlerini etkilemek için moleküler şaperonlar ve bunların eş-faktörleri veya bileşikleri gibi foldases incelemek için kullanılabilir. Firefly lusiferaz aktivitesini muhabir olarak hastabakıcı refolding aktivitesini ölçmek için kullanılır.

Hücre içi Refolding Testi

Solunum ve oksidatif fosforilasyon ile ve hücre canlılığı üzerindeki ilişkili mitokondriyal fonksiyonları üzerinde, protein kinaz C (PKC), izozimlerinin aktivasyon etkisi tarif edilmektedir. Yaklaşım seçici olarak mitokondriyal işlev ve hücre enerji durumunu belirlemek için birincil hücre kültürü deneyleri ve çeşitli PKC izozimleri overexpress için adenoviral teknik uyum sağlar.

Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

Bu video, sentetik 4-Metilumbelliferil substratlar kullanılarak numunelerde α-galaktosidaz A ve asit α-glukozidaz için enzim aktivitesinin in vitro ölçümünü göstermektedir.

α-Galaktosidaz A ve Asit α-Glukozidaz Enzim Aktivitesinin İn Vitro Ölçümü

Biz, Pseudomonas aeruginosa'dan akış pompaları in vitro incelenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, lipozom zarı içinde sağlam, tersinir ve ayarlanabilir proton gradyanının oluşturulması için izin verir ve bu nedenle protomotive güç ile enerji herhangi bir zar proteini için uyarlanabilir olmalıdır.

Pseudomonas aeruginosa itibaren MexAB dışa atım pompa in vitro olarak incelenmesi

Mevcut rapor, Leishmania hücre ekstraktları kullanılarak fosfatidiletanolamin metiltransferaz aktivitesini ölçmek için in vitro enzimatik bir testi açıklamaktadır. Bu tahlil, bir radyoaktif metil grubunun S- [Metil-3H] adenosil-L-metiyoninden endojen fosfatidiletanolamin üzerine transferine dayanmaktadır.

Vitro Tahlil Fosfatidiletanolamin Metiltransferaz Aktivite Tedbir

in vitro ATPase aktivitesini ölçmek için temel bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, belirli bir saflaştırılmış ATPaz için aktivite düzeyine ve gereksinimlere göre optimize edilebilir.

ölçme<em&gt; İn Vitro</emEnzimatik Karakterizasyonu için&gt; ATPaz Aktivitesi

Bu çalışma, insan iskelet kasındaki mitokondriyal oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) kapasitesini ölçmek için in vivo fosfor-31 manyetik rezonans spektroskopisi (31PMRS) tekniğinin fizibilitesini göstermektedir.

Fosfor-31 Manyetik Rezonans Spektroskopisi: Ölçme için Aracı İn Vivo Mitokondriyal Oksidatif Fosforilasyon Kapasitesi

Burada bronkoalveolar lavaj veya serum gibi biyolojik sıvılarda kitinaz aktivitesini ölçmek için basit bir yöntemdir.

Biyolojik Örneklerde Konitinaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Bu protokol, GST ile kaynaşmış TPR motifli yardımcı refakatçiler ve Hsp90 türevli peptit ile birleştirilmiş alıcı boncuklar ile glutatyon bağlantılı donör boncuklar kullanarak protein-protein etkileşimlerini yoklama tekniği sunar. Bu tekniği, Hsp90-FKBP51 veya Hsp90-FKBP52 etkileşimlerini bozmak için küçük molekülleri taramak için kullandık ve güçlü ve seçici Hsp90-FKBP51 etkileşim inhibitörlerini belirledik.

Homojen Boncuk Bazlı Test Kullanılarak Chaperone-Cochaperone Etkileşimleri Çalışmaları

Bu protokol, histon şaperon oligomerizasyonu ve stabilitesini incelemek için analitik boyut dışlama kromatografisini, histon şaperon-histon etkileşimlerini çözmek için aşağı çekme testini, protein komplekslerinin stokiyometrisini analiz etmek için AUC'yi ve in vitro varsayılan bir histon şaperonu işlevsel olarak karakterize etmek için histon chaperoning testini içeren bir dizi yöntemi tanımlamaktadır.

İn Vitro Histon Chaperonlarının Analitik, Pull-Down ve Chaperoning Testleri Kullanılarak Karakterizasyonu

Bu protokol, rekombinant protein saflaştırmasını ubikitin zincir bölünme deneyleri ile birleştirerek nörogelişimsel bozukluklarla ilişkili genetik varyasyonun deubikitile edici enzim aktivitesi üzerindeki etkisinin nasıl ölçüleceğini açıklar.

Nörogelişimsel Bozuklukla İlişkili Deubikitile Edici Enzimlerin İn Vitro Ubikitin Zincir Bölünme Testi ile Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

Öğrenin Fabry ve Pompe hastalığında allelik varyasyonların hücre kültürü tabanlı hızlı fenotipik değerlendirmesi için farmakolojik refakatçi test yöntemini. Bu tekrarlanabilir analiz, lizozomal depo hastalıklarında yeni ilaç geliştirmeyi destekler.

Vitro Enzim ölçüm Test farmakolojik refakatçi yanıt Fabry ve Pompe hastalığı için

Daha fazla video keşfet