Name: Eş zamanlı haritalama ve Nefelometri Ribonucleotides insan mitokondriyal DNAın (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Keşfedin, insan mitokondriyal DNA'sındaki ribonükleotidlerin tek nükleotid çözünürlüğünde eş zamanlı haritalama ve kantitatif analiz yöntemini. Bu teknik DNA bütünlüğü ve hastalık mekanizmaları araştırmalarında değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmada İsveç Araştırma Kurumu tarafından desteklenmiştir (www.vr.se) ARC için verir (2014-6466 ve ark (ICA14-0060) için stratejik araştırma (www.stratresearch.se) İsveçli temeli. Chalmers Teknik Üniversitesi bu çalışmaları sırasında MKME için mali destek sağladı. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Bu iletişim kuralı şekil 1 ' de özetlenen ve gDNA, sindirim enzimleri hidrolize alkali ile tedavi ribonucleotides, sayısı quantitate edebilmek için ile yalıtım içerir gDNA, 5´-OH ücretsiz biter fosforilasyon, ssDNA ligasyonu bağdaştırıcıları, ikinci strand sentezi ve PCR güçlendirme sıralama önce içine dahil ribonucleotides fosfodiester bağları.
 1. bağdaştırıcıları ve dizin astar <ol><li>elde ARC49, ARC140 oligonucleotides, ARC76/77, bağdaştırıcı ve ARC78-ARC107 dizin Astar boyaları (bkz. Tablo 1). 
	Not: Oligonucleotides HPLC saf olmalıdır. ARC76/77 dubleks sipariş.</li>
	<li>Hazırlamak 100 µM hisse senedi çözümler her Oligonükleotid Tris-EDTA (TE) arabelleği (Tablo reçetesi görmek) ve depolamak -20 ° C.</li>
	<li>ARC67/77 10 µM çözümleri ve 2 µM çözümleri ARC49 ve dizin astar, elüsyon arabellekte (EB; bkz: Malzemeler tablo) sulandrarak hazırlayın. Mağaza-20 ° C'de</li>
</ol> 2. Büyüme ve hücre hasat <ol><li>büyümek HeLa hücreleri 70 ML Dulbecco &#39; s modifiye kartal orta (DMEM) ile % 10 fetal sığır serum 250 mL Spinner şişesi 37 olarak takıma ° C.</li>
	<li>Hücreleri saymak ve 5 x 10 6 hücreler bir 50 mL tüp, santrifüj, 200 x g, 5 min için toplamak ve süpernatant atın.</li>
	<li>20 mL 1 x PBS, santrifüj, 200 x g, 5 min için hücrelerle yıkayın ve süpernatant atın.</li>
	<li>Granül-20 ° C'de dondurmak veya DNA arıtma ile devam.</li>
</ol> 3. DNA arıtma ve Nefelometri <ol><li>gDNA fenol kloroform ayıklama aşağıda açıklandığı gibi kullanarak arındırmak.
	<ol><li>Resuspend 2 mL lizis arabellek hücrelerde (Tablo reçetesi görmek) ve Isıtma blokta 42 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. 
		Dikkat: Lizis arabellek tehlikeli bileşenleri içerir. SDS çözüm rahatsız edici, İndinavir K duyarlılığı, rahatsız edici ve zehirli. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek.</li>
		<li>İki 2 mL tüpler örnekte bölünmüş ve 1 birim (V) fenol kloroform izoamil alkol (25:24:1) eklemek. 
		Uyarı: Toksik, mutajenik, aşındırıcı ve su ortamları için tehlikeli fenol kloroform izoamil alkol. Kullanmak bir duman başlık, eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve özel fenol kloroform israf içinde atmak.</li>
		<li>Mix inversiyon için 30-60 s ve santrifüj 15.000 x 5 min için g oda sıcaklığında. 
		Not: hangi sonuçları deforme rastgele kırılmalara, tanıtımı önlemek için DNA girdap mı.</li>
		<li>1 V fenol kloroform izoamil alkol (25:24:1) ekleyin ve yeni bir 2 mL tüp üst, sulu faz transfer.</li>
		<li>Mix inversiyon ve 15.000 x g 4 de 5 dk santrifüj ° C.</li>
		<li>Yeni bir 2 mL tüp ve 20 µL eklemek için üst, sulu faz transfer NaCl (5 M) ve 1 V / soğuk isopropanol. 
		Dikkat: Yanıcı, rahatsız edici ve zehirli Isopropanol. Havalandırılmış bir dolapta saklamak, eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve ateş kaynaklarını hiçbir devam.</li>
		<li>Mix INVERSION tarafından ve en az 1 h -20 için kuluçkaya ° C.</li>
		<li>İçin 15.000 x g, 4 ° C ve atma süpernatant, 20 dk santrifüj.</li>
		<li>Yıkama DNA Pelet 200 µL soğuk % 70 etanol ile 15.000 x g 4 ° c de 20 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. 
		Dikkat: % 70 etanol yanıcı ve rahatsız edici. Çalışma çözüm-20 ° C, başka türlü mağaza havalandırılmış kabine, aşınma koruyucu giysiler ve eldiven tutmak ve ateş kaynaklarını hiçbir devam.</li>
		<li>20-25 dakika süreyle oda sıcaklığında DNA Pelet Makinası</li>
		<li>Erimesi DNA parçaları 100 µL te tampon ve bir tüp örneklerinde havuz.</li>
	</ol></li> <li>Quantitate DNA toplama dsDNA Nefelometri reaktif üretici göre kullanarak &#39; s özellikleri (bkz. Tablo reçetesi). 
	Not: çünkü spektrofotometrik DNA Nefelometri artık fenol tarafından etkilenebilir dsDNA Nefelometri reaktif kullanın.</li>
	<li>Mağaza DNA-20 ° c veya HincII tedavi ile devam.</li>
</ol> 4. HincII tedavi ve alkali hidroliz <ol><li>bir tepki olarak DNA'ın Özet 1 µg karışımı 5 µL 10 x arabellek 3.1, 1 µL (10 U) içeren HincII ve nükleaz ücretsiz H 2 O son hacmiyle 50 µL. 
	Not: tüp ligasyonu için en uygun koşulları elde etmek için ikinci strand sentez ve PCR güçlendirme, bu DNA'yı ribonucleotides çok düşük bir dizi içerir beklenen giriş DNA miktarını artırmak gerekli olabilir. Benzer şekilde, ribonucleotides sayısı çok yüksek ise giriş DNA azaltmak gerekli olabilir.</li>
	<li>37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>HincII arındırmak tedavi DNA ile paramagnetic boncuk. 
	Not: kapakları granül tüpler açarak değil rahatsız etmek için aşağıdaki adımları açmak tüp tutun.
	<ol><li>Ekleyin 1.8 V paramagnetic boncuk her örnek, dikkatle pipetting tarafından mix ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuluçkaya</li>
		<li>Boncuk 5 min için cips daha sonra kaldırmak ve süpernatant atmak için manyetik bir raf kullanın.</li>
		<li>Yaklaşık 30 s sonra Kaldır ve atma süpernatant için 150 µL % 70 etanol (oda sıcaklığında) ile Pelet yıkayın.</li>
		<li>Yıkama Pelet ile 200 µL % 70 etanol (oda sıcaklığında) yaklaşık 30 s sonra kaldırmak ve süpernatant atın. 
		Not: Artık etanol 10 µL pipet ile kaldırılabilir. Damlacıkları spun aşağı kısaca önceden.</li>
		<li>Kuru, oda sıcaklığında yaklaşık 15-20 dakika süreyle örnekleri 
		Not: Tam olarak ne zaman boncuk hacmi ve Pelet şeklinde bağlıdır, bu nedenle granül görsel olarak kontrol edilmelidir.</li>
		<li>Manyetik raf tüpler kaldırın ve Pelet 45 µL EB, tarafından dikkatle pipetting mix elute.</li>
		<li>5 dk sonra manyetik raf üstündeki cips ve saf DNA'ın 45 µL 4.4 adımda kullanmak için kuluçkaya.</li>
	</ol></li> <li>Ekleyin 5 µL KOH (3 M) veya KCl (3 M) toplam hacmi 50 µL oluşturma DNA için. 
	Dikkat: 3 M KOH aşındırıcı bir çözümdür. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek.</li>
	<li>Incubate bir hibridizasyon 55 ° C'de 2 h için fırın buz üzerinde 5 min tarafından takip 
	Not: Tüp Tekdüzen bir Isıtma korumak ve kapağı, yoğunlaşma önlemek bir Isıtma blok yerine bir fırın KOH tedavi gerçekleştirmek için önerilir.</li>
	10 µL sodyum asetat ekleyerek <li>çökelti DNA (3 M, pH = 5,2) ve 125 µL soğuk % 100 etanol. 5 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya 
	Dikkat: % 100 etanol yanıcı ve rahatsız edici. Saklamak havalandırılmış bir dolapta, eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve ateş kaynaklarını hiçbir devam.</li>
	<li>Cips gDNA 21.000 x g, 5 min için 4 ° C de centrifuging tarafından ve süpernatant atın.</li>
	<li>Yıkama DNA Pelet 250 µL soğuk % 70 alkol, santrifüj kapasitesi 21.000 x g, 5 min için 4 ° C de ve süpernatant atın. 
	Not: damlacıkları çıkarmak, tüp aşağı kısaca tekrar döndü ve süpernatant kaldırılabilir 10 µl pipet ile.</li>
	<li>Yaklaşık 5-10 dakika için açık bir tüp içinde görünür herhangi bir sıvı buharlaşıp vardır kadar kuru Pelet izin.</li>
	<li>İzin DNA Pelet erime 20 µL EB, oda sıcaklığında 30 dakika içinde.</li>
</ol> 5. 5´ son fosforilasyon <ol><li>her örnek önceden eksilerini için tepki karışımı hazırlayın2.5 µL 10 x T4 polinükleotit kinaz tepki arabellek, 1 µL (10 U) 3´ fosfataz eksi T4 polinükleotit kinaz ve 2.5 µL ATP (10 mM) isting.</li>
	<li>Transfer 19 µL her DNA'ın örnek bir yeni 200 µL tüp içine ve termo cycler 85 ° C'de 3 min için denatüre.</li>
	<li>Serin DNA örnekleri buzda ve her örnek için 6 µL tepki Mix ekleyin.</li>
	<li>30 dk ve stop örnekleri 20 dk. 65 ° C'de kuluçka tarafından tepki için 37 ° C'de Incubate reaksiyon karışımları</li>
	<li>Arındırmak DNA olarak açıklanan 4,3, 1.8 V paramagnetic boncuk kullanarak ama 14 µL EB elute.</li>
</ol> 6. ssDNA tüp ligasyonu <ol><li>önceden 0.5 µL ATP (2 mM), 5 µL 10 x T4 RNA ligaz tepki arabellek, 5 µL CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), oluşan her örnek için tepki karışımı hazırlayın 0.5 µL ARC140 (100 µM) ve %25 50 µL 8000 PEG. De pipetting tarafından Mix. 
	Dikkat: CoCl 3 (NH 3) 6 kanserojen, duyarlılığı ve su ortamında için tehlikeli olduğunu. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek.</li>
	<li>Transfer 13 µL saf DNA'ın yeni bir 200 µL tüp 5.5 adım ve termo cycler 85 ° C'de 3 min için denatüre.</li>
	<li>Buz üzerinde DNA serin ve 36 µL pipetting tarafından mix, her örnek için tepki karışımı ekleyin ve spin aşağı kısaca.</li>
	<li>Her tepki için eklemek 1 µL (10 U) T4 RNA ligaz, mix pipetting tarafından ve spin aşağı kısaca.</li>
	<li>Örnekleri, oda sıcaklığında karanlık geceleme kuluçkaya.</li>
</ol> 7. İkinci-strand sentez <ol><li>arındırmak bakmaksızın DNA 4,3, açıklandığı gibi ama 0.8 V paramagnetic boncuk kullanın, boncuk 10 min için cips ve 20 µL EB elute. 
	Not: ilk Pelet adım nedeniyle daha yüksek viskozite ligasyonu tepki karışımı uzun.</li>
	DNA örneği yeni 200 µL PCR Tube <li>transfer 20 µL. 0.8 V paramagnetic boncuk üretici takip kullanarak arıtma adımı yineleyin &#39; s özellikleri ve 14 µL EB elute.</li>
	<li>Reaksiyon karışımı önceden 10 x T7 DNA polimeraz tepki arabellek, 2 µL 2 µL oluşan her örnek için hazırlamak ARC76/77 (2 µM), 2 µL dNTPs (2 mM) ve 0.8 µL BSA (1 mg/mL).</li>
	<li>Transfer 12,8 µL saf DNA bir yeni 200 µL tüp, termo cycler 85 ° C'de 3 min için denatüre.</li>
	<li>Buz üzerinde DNA serin ve her örnek, pipetting tarafından mix, spin aşağı kısaca ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya tepki karışımı 6.8 µL eklemek.</li>
	<li>0.4 µL (4 U) T7 DNA polimeraz her tepki ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Arındırmak DNA olarak 4,3, açıklanan 0.8 V paramagnetic boncuk kullanarak ve 11 µL EB elute.</li>
</ol> 8. PCR güçlendirme ve Kütüphane Nefelometri <ol><li>hazırla yeni 200 her örnek için tepki karışımı µL tüp peşin 7.5 µL oluşan ARC49 (2 µM), 7.5 µL dizin astar (2 µM, her örnek için benzersiz) ve sıcak başlangıç x 25 µL 2 hazır karışım.</li>
	<li>Ekleyin 10 µL her tepki için DNA örneği. Aşağıdaki koşullar kullanarak kütüphane yükseltmek: 45 için 95 ° C'de denatüre 18 98 ° C devredir 15 ardından s, s, 30 65 ° C s, 30 72 ° C s, 72 ° C 2 dk. tutun örnekleri 4 ° için son bir uzama ile biten C amplifikasyon sonra.</li>
	<li>0.8 V paramagnetic boncuk, kullanma 4.3 içinde açıklandığı gibi kitaplıkları arındırmak ve 20 µL TE arabellekte elute.</li>
	<li>DsDNA Nefelometri reaktif kullanarak kütüphaneleri üretici göre quantitate &#39; s özellikleri (bkz. Tablo reçetesi).</li>
	<li>Saklamak-20 ° C'de örnekleri ya da kitaplık analizi ile devam.</li>
</ol> 9. Kütüphane analizi ve birbirinin <ol><li>Her kitaplık kalitesini belirlemek ve bir dijital Elektroforez sistemi kullanarak ortalama parça boyutu tahmin ediyoruz. 
	Not: Ortalama parça boyutu nereye electropherogram eğri altındaki alan yarıya, tahmin etme tarafından değerlendirilir doruklarına gelen işaretleri göz ardı ederek. Uygun Kütüphane profilleri KOH veya KCl tedaviden sonra temsilcisi sonuçları şekil 2A verilmiştir.</li>
	<li>Hesaplamak belgili tanımlık kütüphaneci konsantrasyonu (nM): 
	(c/10 3) /(p*650)] * 10 9 nerede c ng/µL kütüphanede konsantrasyon ve p kan basıncı, ortalama parça boyutu içinde tahmini 9.1.</li>
	<li>Havuzu eşit molar miktarda 24 Kitaplıklar farklı dizin astar için sıralama ile güçlendirilmiş. 25 µL son hacmi ve konsantrasyonu 10 TE arabellek eklemek nM. 
	Not: havuza alınmış için kitaplıklarına sayısına bağlı olarak, her kitaplık DNA'dan miktarı ayarlanır. Astar dimer algılanırsa 9.1 yaklaşık 130 farklı bir zirve adım'bp, Kütüphane havuzu son hacmi 25 µL, çünkü arıtma adım 0.8 V paramagnetic boncuk, kullanma 4.3 içinde açıklandığı gibi tekrarlanır ve DNA 25 µL TE buf eluted aşan fer.
	<ol><li>Belirleme dsDNA Nefelometri reaktif üretici göre kullanarak yeni kütüphane havuzu konsantrasyon &#39; s özellikleri ve ortalama zirve boyutu yukarıda açıklandığı gibi. Sıralama ve veri analizi (Bölüm 10 ve 11) devam.</li>
	</ol></li></ol> 10. Sıralama <ol><li>75-base eşleştirilmiş uç sıralama havuza alınan kütüphaneler 12 tarihinde gerçekleştirmek.</li></ol>
 11. veri analizi <ol><li>Trim bağdaştırıcısı dizileri, kaldırmak için tüm okuma filtre için kalite ve uzunluğu okuyun. 
	Not: Bu yapılabilir cutadapt 1.2.1 20 ile komutunu kullanarak ' cutadapt -f fastq--maç-okuma-joker - m 15 - q 10 - bir NNNNNNN sessiz &#60; dosya &#62;', nerede NNNNNNN gerçek bağdaştırıcı dizisi ile değiştirilir ve &#60; dosya &#62; olduğunu fastq dosya adıyla değiştirilir.</li>
	<li>Özel komut dosyaları kullanarak önceki adımda arkadaşları, atılan bir okuma kaldırmak.</li>
	<li>Kalan dostum 1 hizalamak çiftleri Kütüphane hazırlanmasında kullanılan tüm oligonucleotides dizisini içeren bir dizine (papyon 0.12.8 21 ve komut satırı kullanarak Örneğin, seçenekleri - m1-v2). Tüm çiftleri ile başarılı hizalamaları atın.</li>
	<li>Kalan çift papyon ile komut satırını kullanarak canlı referans genomunun büyüklüğü için hizalama seçenekleri - v2 -X 10000--en iyi.</li>
	<li>Harita okur arasında mitokondrial molekülü başında ve sonunda o span dostum 1 tüm hizalanmamış çiftlerinin hizalayarak (papyon ile komut satırını kullanarak seçenekleri - v2).</li>
	<li>5´-amaçları için tüm tek ve eşleştirilmiş son hizalamaları sayısını belirler. Bunlar bir baz akıntıya karşı tarafından konumunu nerede olduğunu hydrolyzed ribonucleotides konumuna kaydırmak.</li>
	Papyon dosya <li>verme verileri özel komut dosyaları kullanarak görselleştirme için ortak bir bedgraph dosya biçimine genom tarayıcılar biçimlendirin. Okuma her strand için okuma normalize milyon.</li>
	<li>Sayar ve pozisyon bedgraph dosyasını kullanarak başvuru Ltd.Şti kimliğini belirlemek için organizma genom dizisiorated ribonucleotides. 
	Not: bölgeleri 16,200-300 ve 5,747-5,847 için insan mitokondriyal genom okur için bu bölgelerdeki birçok ücretsiz 5´ biter ribonucleotide birleşme için DNA polimeraz γ tarafından ilgisiz içerdiğinden her strand çıkarılmalıdır.</li>
	<li>Okuma okuma ribonucleotides tek iplikçik sonu, (Yani mitokondrial molekülü başına ribonucleotides sayısı) başına sayısını elde etmek için HincII site başına ortalama sayısı ile onbir HincII sitelerde hariç toplam okuma bölmek.</li>
</ol>

<ol><li>Traut, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Concentrations+of+Purines+and+Pyrimidines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Physiological Concentrations of Purines and Pyrimidines.</a> Mol. Cell. Biochem. 140, 1-22 (1994).</li>
<li>McElhinny, S. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 4949-4954 (2010).</li>
<li>Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+ribonucleotides+incorporated+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 350-363 (2016).</li>
<li>Clausen, A. R., Zhang, S., Burgers, P. M., Lee, M. Y., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotide+incorporation%2C+proofreading+and+bypass+by+human+DNA+polymerase+delta%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotide incorporation, proofreading and bypass by human DNA polymerase delta.</a> DNA Repair. 12, 121-127 (2013).</li>
<li>Potenski, C. J., Klein, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+misincorporation+of+ribonucleotides+into+genomic+DNA+can+be+both+harmful+and+helpful+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">How the misincorporation of ribonucleotides into genomic DNA can be both harmful and helpful to cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 10226(2014).</li>
<li>Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase-sensitive+DNA+modification%28s%29+initiates+S.+pombe+mating-type+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Dev%22%5BJournal%5D)">RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching.</a> Gene. Dev. 18, 794-804 (2004).</li>
<li>Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotides+Are+Signals+for+Mismatch+Repair+of+Leading-Strand+Replication+Errors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotides Are Signals for Mismatch Repair of Leading-Strand Replication Errors.</a> Mol. Cell. 50, 437-443 (2013).</li>
<li>Ghodgaonkar, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotides+Misincorporated+into+DNA+Act+as+Strand-Discrimination+Signals+in+Eukaryotic+Mismatch+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotides Misincorporated into DNA Act as Strand-Discrimination Signals in Eukaryotic Mismatch Repair.</a> Mol. Cell. 50, 323-332 (2013).</li>
<li>DeRose, E. F., Perera, L., Murray, M. S., Kunkel, T. A., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+Structure+of+the+Dickerson+DNA+Dodecamer+Containing+a+Single+Ribonucleotide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Solution Structure of the Dickerson DNA Dodecamer Containing a Single Ribonucleotide.</a> Biochemistry. 51, 2407-2416 (2012).</li>
<li>Li, Y. F., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja990592p">Kinetics of RNA degradation by specific base catalysis of transesterification involving the 2 '-hydroxyl group.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 5364-5372 (1999).</li>
<li>McElhinny, S. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+instability+due+to+ribonucleotide+incorporation+into+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA.</a> Nat. Chem. Biol. 6, 774-781 (2010).</li>
<li>Berglund, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+pools+dictate+the+identity+and+frequency+of+ribonucleotide+incorporation+in+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleotide pools dictate the identity and frequency of ribonucleotide incorporation in mitochondrial DNA.</a> Plos Genet. 13, (2017).</li>
<li>Brown, J. A., Suo, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+Sugar+%22Steric+Gate%22+of+DNA+Polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Unlocking the Sugar "Steric Gate" of DNA Polymerases.</a> Biochemistry. 50, 1135-1142 (2011).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase+H2-Initiated+Ribonucleotide+Excision+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">RNase H2-Initiated Ribonucleotide Excision Repair.</a> Mol. Cell. 47, 980-986 (2012).</li>
<li>Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Major+Roles+of+DNA+Polymerases+Epsilon+and+Delta+at+the+Eukaryotic+Replication+Fork+Are+Evolutionarily+Conserved%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genet%22%5BJournal%5D)">The Major Roles of DNA Polymerases Epsilon and Delta at the Eukaryotic Replication Fork Are Evolutionarily Conserved.</a> Plos Genet. 7, (2011).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 185-191 (2015).</li>
<li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribose-seq%3A+global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribose-seq: global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat. Methods. 12, 251(2015).</li>
<li>Keszthelyi, A., Daigaku, Y., Ptasinska, K., Miyabe, I., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+ribonucleotides+in+genomic+DNA+and+exploring+replication+dynamics+by+polymerase+usage+sequencing+%28Pu-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mapping ribonucleotides in genomic DNA and exploring replication dynamics by polymerase usage sequencing (Pu-seq).</a> Nat. Protoc. 10, 1786-1801 (2015).</li>
<li>Ding, J., Taylor, M. S., Jackson, A. P., Reijns, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+embedded+ribonucleotides+and+other+noncanonical+nucleotides+using+emRiboSeq+and+EndoSeq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of embedded ribonucleotides and other noncanonical nucleotides using emRiboSeq and EndoSeq.</a> Nat. Protoc. 10, 1433-1444 (2015).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17, 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, (2009).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Burada aynı anda harita ve ribonucleotides gDNA ve mtDNA özellikle, DNA dekolte, genom ek olarak oluşturulmuş HydEn seq protokol sırasını belirli sitelerdeki basit geçilmesi ölçmek için bir yöntem mevcut. Aslında bu çalışmada insan mtDNA üzerinde duruluyor olsa da, yöntemin çeviri diğer organizmaların12,16gösteren Saccharomyces cerevisiae, HydEn seq yöntemi geliştirildi.
Bu yaklaşımdan alınan güvenilir sonuçlar elde etmek için bazı önemli adımlar belirtmek gerekir: (A) tüm kullanılabilir 5´ uçları için sıralaması bağdaştırıcısı ligate bu yana, bu son derece sağlam DNA ile çalışmak çok önemli. DNA yalıtılması gerekir ve kitaplıkları tercihen hemen DNA izolasyon sonra yapılması gereken veya DNA-20 ° C'de depolanan Bu DNA buzdolabında uzun süre saklamak için veya tekrar tekrar donma ve bu yaz için tavsiye edilmez. (B) bu yöntem ile uygun kitaplıkları oluşturmak için tüm örnek ve nicel hidroliz homojen ısıtma temin bir Isıtma blok yerine bir kuluçka fırın içinde DNA'ın KOH tedavi gerçekleştirmek önemlidir. (C) Ayrıca, havuz ve sıralama önce kitaplıkları kalite kontrol için önemlidir. DNA sayısal ve Kütüphane DNA, yeterli miktarda emin olmak için bir otomatik Elektroforez sistemi kullanılarak analiz uygun parça boyutları onaylamak ve astar dimer için kontrol edin.
Anlamlı veri analizi için bu yöntemin bilgilendirici değeri arka plan sayar ve sıra veya strand önyargıları değerlendirmek için uygun denetimlere bağlı olduğunu unutmamak önemlidir. Biz düzenli olarak sadece sıra belirli endonükleaz (şekil 2B, sol kapı aynası) ile sindirerek zaman KCl örnekleri % 70'e yakın bir eşleme verimliliği elde. Buna ek olarak, endonükleaz tedavi genel etkilemiyor onaylamak önemlidir HincII karşılaştırarak anonim ribonucleotides tespiti tedavi ve tedavi edilmezse örnekleri (3B rakam). Diğer yüksek-sadakat enzimleri de kullanılabilir olsa bu deneylerde, biz HincII sahaya özel kesim, tanıtmak için kullandık.
Protokol adapte olabilir diğer tip-in 5´-fosfat ya da 5´-OH işlenebilir DNA lezyonlar çalışmaya biter. Sonuçlarının doğruluğunu işleme özgüllük bağlıdır ve uygun denetimler gerektirir (Örneğin, vahşi türü veya tedavi edilmemiş) doğrulaması için. Ayrıca, bu yöntem diğer uygulamalara veya diğer organizmalar ile kullanmak için adapte, biri onun geçerli kurulum yönteminde bir kitaplığı işlenen DNA'ın yaklaşık 1 µg gerektirir düşünmelisiniz. Biter sayısı katıştırılmış ribonucleotides sayısına bağımlı olduğundan, hangi örnek ribonucleotides daha düşük bir dizi dahil canlı veya mutant, bağlı olarak değişir daha DNA biter yeterli sayıda oluşturmak için giriş gerektirir Sonraki Kütüphane inşaat. DNA örnekleri ribonucleotides çok daha yüksek sayıda varsa, benzer şekilde, bu da tüp ligasyonu, ikinci strand sentezi ve PCR güçlendirme için en uygun koşulları elde etmek için daha az giriş DNA'yı kullanarak gerektirir. Bu protokol için açıklandığı gibi Kütüphane inşaat da nükleer genom ( 2D rakamgörüntülendiği gibi) kapsayan veri oluşturmak ve yalnızca veri analiz mtDNA üzerinde duruldu çekicidir. Bu orta alt ribonucleotide frekansları ile daha büyük genleri de bu yöntem tarafından yakalanır göstermektedir.
Bu yöntem dikkate alınarak, belirli sınırlamaları dikkate alınması: Bu yöntem teorik olarak, hemen her organizma için uygulanabilir olmalıdır ancak uygun başvuru genom okuma hizalama için gereklidir. Ayrıca, bizim iletişim kuralından elde edilen sonuçlar çok sayıda hücre okuma temsil eder. Belirli ribonucleotide birleşme kalıpları hücre alt grubunu bu yaklaşım tarafından tanımlanamaz. Ribonucleotides ribonucleotides çok düşük bir dizi ile daha büyük genleri eşleştirilirse, ribonucleotides gelen rasgele rumuz arasında ayırt etmek zor ve uygun denetimleri bu nedenle ihtiyaç vardır.
Biz burada, tarif yöntemi HydEn Seq16, riboz-Seq17, Pu-Seq18ya da emRiboSeq19gibi kullanılabilir vivo içinde teknikleri genişletir. Bu yaklaşımlar katıştırılmış ribonucleotides duyarlılık alkalin yararlanmak veya RNase H2 tedavi, sırasıyla, onların haritalama ve karşılaştırmasını sağlayan ribonucleotides genom genelindeki tanımlamak için yeni nesil sıralama istihdam göreli birleşme. DNA dizisi özellikle fizyon tarafından ek olarak, katıştırılmış ribonucleotides, alkali hidroliz yukarıda açıklandığı gibi ribonucleotides için okuma sadece kimlik izin ve eşleme bu bölünme siteleri için normalleştirilmiş ribonucleotides, aynı zamanda onların Nefelometri her DNA molekülü için. Bizim teknik hastalıklar bağlamında uygulama DNA ikileşmesi için ilgili DNA tamiri ve TLS moleküler mekanizmaları ve genom bütünlüğü genel olarak temel içinde ribonucleotides rolünün daha derin bir anlayış verebilir.

Bir ökaryotik hücre, ribonucleotides (rNTPs) konsantrasyonu deoxyribonucleotides (dNTPs)1konsantrasyon yüksektir. DNA polimeraz ribonucleotides karşı ayırımcılık ama bu ayrımcılık mükemmel değildir ve sonuç olarak, ribonucleotides deoxyribonucleotides yerine genleri DNA ikileşmesi sırasında dahil. Ribonucleotides en yaygın kanonik olmayan nükleotit genom2' ye dahil olabilir. Bu ribonucleotides çoğunu RNase H2 başlatılan ribonucleotide eksizyon tamir (RER) veya topoizomeraz (başvuru3gözden geçirme) 1 Okazaki parçası olgunlaşma sırasında kaldırılır. Kaldırılamaz ribonucleotides stabil DNA2,4 ' te anonim kalmak ve (gözden geçirilmiş5' te) zararlı ve yararlı şekillerde etkileyebilir. Olumlu sinyaller olarak hareket edebilecek olmanın yanı sıra, örneğin türü çiftleşme Schizosaccharomyces pombe6 ' geçiş ve doğmakta olan DNA dizisi sırasında uyuşmazlığı işaretleme onarım (MMR)7,8, ribonucleotides etkiler ikileştirici stres ve genom istikrarsızlık11' kaynaklanan çevre DNA onların riboz10, 2´-hidroksil grubuna nedeniyle kararlılığını ve yapı9 . Genomik DNA (gDNA) ribonucleotides ve kendi alaka çoğaltma ve tamir mekanizmaları yanı sıra genom istikrar, etkileri bereket onların hassas oluşumu ve frekans bir genom geniş şekilde araştırmak için neden verir.
İnsan mitokondri içinde RNase H2 etkinlik bulunamamıştır ve ribonucleotides bu nedenle değil verimli bir şekilde mitokondrial DNA (mtDNA) kaldırılır. Çeşitli yolları insan mitokondri nükleotit arzında söz konusu ve harita ve quantitate için bir protokol geliştirdiğimiz bozuklukları mitokondrial nükleotit havuzda insan mtDNA ribonucleotides yükseltilmiş bir dizi neden olup olmadığını araştırmak için Bu ribonucleotides insan mtDNA fibroblastlar, HeLa hücreleri ve hasta hücre hatları12izole içinde.
Çoğu vitro yaklaşımlar (gözden geçirilmiş13' te DNA polimerazlar seçicilik rNTPs karşı belirlemek için) tek ribonucleotide ekleme veya astar uzantısı deneyler nerede rakip rNTPs tepki olarak dahil edilen temel alır mix, kimlik veya ribonucleotide şirketleşme göreli Nefelometri kısa DNA şablonlarında izin verme. Kısa dizileri kantitatif yaklaşımlar değil dNTP ve rNTP havuzları hücresel konsantrasyonlarda yansıtmak ve bu nedenle polimeraz seçicilik içgörü ama bütün genleri ile ilgili sınırlı önemi sağlamak. Bu bir plazmid gibi daha uzun bir DNA şablonu çoğaltma sırasında dahil ribonucleotides göreli miktarını radiolabeled dNTPs kullanarak ve bir alkali ortamın14DNA'da hidrolize bir sıralama jel üzerinde görüntülenmeyecektir gösterilmiştir. Ayrıca, gDNA alkalin hidroliz takip, strand özgü sondalama ve mutlak ribonucleotide birleşme vivo içinde15oranda belirlenmesi izin Güney açıkları analiz edilmiştir. Bu yaklaşımlar birleşme sıklığı göreli bir karşılaştırma izin ama konumunu veya anonim ribonucleotides kimliğini yok içgörü sunmak. GDNA in vivo, HydEn Seq katıştırılmış ribonucleotides16, riboz-Seq17, Pu-Seq18ya da19emRiboSeq yararlanmak gibi ribonucleotide içeriğinde analiz etmek için daha yeni yaklaşımlar duyarlılık alkali veya RNase H2 tedavi, sırasıyla ve yeni nesil sıralama ribonucleotides genom çapında tanımlamak için kullanır. Bu yöntemler algılanan ribonucleotides mutlak birleşme sıklığı içgörü sağlamak değil. Adım sıra belirli enzimatik dekolte HydEn seq iletişim kuralına ekleyerek, biz burada uygun tarif yöntemi aynı anda eşleme sağlayan bir sıralama yaklaşımdan elde edilen bilgilerden genişletir ve Nefelometri ile gömülü ribonucleotides12. Bu yöntem son derece sağlam DNA özleri oluşturulabilir ve uygun başvuru genom kullanılabilir hemen her organizma için geçerlidir. Yöntem quantitate ve bir nükleaz tarafından sindirilmiş ve 5´ fosfat veya 5´-OH sonunda bırakır herhangi bir lezyon konumunu belirlemek için adapte olabilir.
Yöntem harita ve ribonucleotides genomik DNA'quantitate için bir dizi belirli endonükleaz tarafından bölünme birleştirir ve alkali hidroliz 5´-fosfat üreten sitelerinde endonükleaz için belirli tanıma sırası yerleştirildiği ve 5´ - biter OH ribonucleotides neredeydin pozisyonlarında sona erer. Bu yana oluşturulan ücretsiz biter daha sonra bağdaştırıcılarla bakmaksızın ve yeni nesil sıralama kullanarak sıralı, son derece sağlam DNA kullanın ve DNA ekstraksiyon ve Kütüphane hazırlık sırasında rasgele parçalanma önlemek için önem taşıyor. Bu okuma endonükleaz bölünme sitelerinde okuma için normalleştirilmiş değerlendirirken bir eşzamanlı Nefelometri ve algılanan ribonucleotides eşleme sağlar. Ücretsiz 5´-biter kontrol nerede DNA alkalin hidroliz KCl ile tedavi ile değiştirilir deneylerde tespit edilir. Alınan veri ribonucleotide konum ve miktar içgörü sağlamak ve analizler ribonucleotide içerik ve birleşme sıklığı ile ilgili sağlar.

<table><tbody><tr><td>10x T4 Polinükleotid Kinaz Reaksiyon Tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>B0201S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 RNA Ligaz Reaksiyon Tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>B0216L</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td>1 tableti H2O'da 1 L</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-GL-R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 nihai hacmine çözün Biyoanalizör</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Santrifüj Tüpü</td><td>VWR</td><td>525-0610</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5'-Trifosfat (ATP, 10 mM)</td><td>New England Biolabs</td><td>P0756S,</td><td>EB ile 2 mM'ye seyreltin</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>BSA, Moleküler Biyoloji Sınıfı (20 mg/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td>nükleaz içermeyen H2O ila 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Tampon EB</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td> ile <td>diltue</td></tr> EB <tr><td>CleanPCR paramanyetik boncuklar</td> olarak adlandırılır <td>CleanNA</td><td>CPCR-0050</td><td></td></tr><tr><td>Deoksinükleotid (dNTP) Çözelti Karışımı (her biri 10 mM)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td>, <td>EB ile seyrelterek 2 mM DMEM</td></tr><tr><td>, yüksek glikoz, GlutaMAX Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag 96 Yan</td><td>Thermo Fisher</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>Etanol %99,5 analitik sınıf</td><td>Solveco</td><td>1395</td>, <td>miliQ su ile %70</td></tr> <tr><td>Etilendiamintetraasetik asit çözeltisine (EDTA, 0,5 M)</td> seyreltin<td>, Sigma-Aldrich</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tamponu pH 8.0 (1 M) steril BC</td><td>AppliChem</td><td>A6906,0125</td><td></td></tr><tr><td>Heksamin kobalt(III) klorür (CoCl<alt>3</alt>(NH<alt>3</alt>)<alt>6</alt>)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7891-5G</td><td>, 10&nbsp için nükleaz içermeyen H2O'da çözülür; M çözeltisi, steril filtre. DİKKAT: kanserojen, hassaslaştırıcı ve su ortamı için tehlikelidir.</td></tr>NEBuffer 3.1 <tr><td>Hibridizatör HB-1D</td><td>Techne</td><td>FHB4DD</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td><td></td> ile birlikte verilen HincII New England Biolabs <td>R0103S</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Lizis tamponu</td><td></td><td></td><td>50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinaz K (200 ve mikro; g / mL),% 1 SDS</td></tr><tr><td>Mikro tüp 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj 5424R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj MiniStar silverline</td><td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>Çarpın&nbsp; &mikro; StripPro 0.2 mL tüp</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.992</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Fenol &ndash; kloroform &ndash; izoamil alkol (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>VWR</td><td>26764.232</td><td>nükleaz içermeyen H2O içinde 3&nbsp; M çözeltisi, steril filtre</td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit (KOH)</td> <td>VWR</td><td>26668.296</td>, <td>3 < nbsp için nükleaz içermeyen H alt > 2 < / alt >O içinde çözülür; M çözeltisi, steril filtre</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Florometre</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Test Tüpleri</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td>DİKKAT: Yanıcı ve toksik bileşenler içerir</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>DİKKAT: Yanıcı ve toksik bileşenler içerir</td></tr><tr><td>Soğutmalı Santrifüj 4K15</td><td>Sigma Laboratuvar Santrifüjleri</td><td>No. 10740</td><td></td></tr><tr><td>SDS Çözeltisi, %10</td> <td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat tampon çözeltisi, pH 5.2, 3 M (NaAc)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td> <td>VWR</td><td>27810.295</td><td>nükleaz içermeyen H 2 O içinde 5&nbsp için çözülür; M solüsyonu, steril filtre</td></tr><tr><td>T100 Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinükleotid Kinaz (3' fosfataz eksi)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0236L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligaz 1 (ssRNA Ligaz)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td>, <td>PEG 8000 (% 50)</td></tr> <tr><td>T7 DNA Polimeraz (değiştirilmemiş)</td> ile birlikte <td>verilirNew England Biolabs</td><td>M0274S</td><td>10x T7 DNA Polimeraz Reaksiyon Tamponu</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F2.0</td><td>Eppendorf</td><td>ile</td> birlikte verilir 5387000013 <td></td></tr></tbody></table>

eş zamanlı haritalama ve nefelometri ribonucleotides insan mitokondriyal dna'ın

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Ribonucleotides bir genom mevcut sayısını tahmin etmek için kurulan yaklaşımlar kısa sentetik DNA parçalarının veya plazmid şablon olarak kullanarak ve sonra bütün sonuçları extrapolating anonim ribonucleotides Nefelometri ile sınırlıdır genom. Alternatif olarak, ribonucleotides bir genom mevcut sayısı alkalin jelleri veya Güney açıkları kullanarak tahmin. Daha yeni vivo içinde yaklaşımlar pozisyon ve katıştırılmış ribonucleotides kimliğini veren ribonucleotides, genom geniş eşleme sağlayan yeni nesil sıralama istihdam. Ancak, bunlar Nefelometri genom dahil ribonucleotides sayıda izin vermez. Burada aynı anda harita ve hangi insan mitokondriyal DNA ' vivo yeni nesil sıralama tarafından Birleşmiş ribonucleotides sayısı quantitate nasıl açıklar. Biz son derece sağlam DNA kullanın ve bir endonükleaz, daha sonra hidrolize anonim ribonucleotides alkali ile ile sindirerek tarafından sıra belirli Kişilik kırılmalara tanıtmak. Oluşturulan biter bağdaştırıcılarla bakmaksızın ve bu biter bir nesil sıralama makinede sıralanamadı. Ribonucleotides kesin sayısı için sıra belirli endonükleaz tanıma sitesi okuma ortalama sayısı tanıma alanında başı dışında okuma sayısı olarak hesaplanır. Bu iletişim kuralı Ayrıca harita ve ücretsiz nickler DNA'quantitate için kullanılması gereken ve işlenebilir diğer DNA lezyonlar 5´-OH için eşlemek uyum sağlar biter veya 5´-fosfat biter. Ayrıca, verilen bu uygun başvuru genom kullanılabilir herhangi bir organizma için bu yöntem uygulanabilir. Bu iletişim kuralı bu nedenle DNA ikileşmesi, 5´ uç işleme, DNA hasarı ve DNA tamir eğitim için önemli bir araç sağlar.

Yukarıda açıklanan, temsili veri HeLa insan mitokondriyal DNA analiz oluşturulan metodoloji gösteren12hücreleri. Şekil 2B özetlenen okuma hiç HincII siteleri ağır (HS) ve hafif iplikçik (LS) insan mtDNA KCl tedaviden sonra (sol kapı aynası) gösterir. Yaklaşık p-in tüm algılanan 5´-uçları HincII sindirim yüksek verimliliğini gösteren kesim siteler için yerelleştirilmesine. KOH katıştırılmış ribonucleotides DNA hidrolize kitaplıklarıyla tedavi okuma sayısı yaklaşık % 40'a (şekil 2B, doğru kapı aynası) HincII sitelerdeki azalır. Bu 5´-uçları çok sayıda ribonucleotide birleşme sitelerinde oluşturulan bu yana beklenen ve yeterli bir kütüphane kalite göstergesidir. Sonra KCl tedavi ve okuma oluşturulan şekil 2C Yerelleştirme ve 5´-biter (yeşil) sıklığı HydEn-seq tarafından (macenta) KOH tedaviden sonra Ücretsiz 5´-biter ve ribonucleotides alkali hidroliz tarafından oluşturulan bitiş algılama göstermektedir. Ücretsiz 5´-biter ve insan mtDNA HS için yerelleştirme ribonucleotides sol panelinde gösterilir ve bu LS için yerelleştirme sağdaki bölmede gösterilir. Benzer bir önyargı için gözlenen değil ribonucleotides (2D rakam, üst panel) veya HincII sitelerinde (alt paneli) HS ve LS mtDNA, ham okuma göreli numaralarını, sırasıyla, LS HS, göreli bir 14-fold veya 31-fold daha güçlü kapsama gösterirken nükleer DNA. Bu strand önyargı iki iplikçiklerinin temel kompozisyon farklı farkı tarafından açıklanabilir ve okuma için normalleştirme HincII sitelerdeki önemini göstermektedir.
Okuma normalize HincII verir ribonucleotides mitokondrial genom (şekil 3A) başına sayısı niceliksel ölçüsüdür sayar. Şekil 3B' gösterildiği, KOH tedavi için her ribonucleotide her strand dizi kompozisyon için normalleştirilmiş sonra okuma bir oran 1, ayrı bir ribonucleotide düşündüren okur rasgele bir dağıtım gösteren kullanılandan farklı göstermek desen ve yüksek Kütüphane kalitesi. Bu oran HincII, enzim bölünme özgüllük doğrulama ile önceki sindirim tarafından etkilenmez. Katıştırılmış ribonucleotides bu HincII bölünme sitelerdeki yanı sıra genom nükleotit içerik sitelerinde okuma normalize kaç her ribonucleotide kişi 1000 tamamlayıcı üsleri ( dahil edilmiştir nicel bir ölçü oluşturur Şekil 3 c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig1.jpg"> 
Şekil 1: DNA işleme ve Kütüphane hazırlık şematik. (1) bütün genomik DNA HincII tarafından ribonucleotides, sonraki Nefelometri normalleştirme için HincII siteleri (siyah ok ucu) künt ucunda üreten i ciddi. (2 DNA 2´, 3´-biter ve 5´-OH ücretsiz biter 3´ döngüsel fosfat (kırmızı pentagon) önde gelen, KOH ribonucleotide siteler, hidrolize ile tedavi edilir. (3) 5´-OH biter T4 polinükleotit kinaz 3´-fosfataz-eksi tarafından fosforile. (4) tüm 5´ uçları bir fosfat grubu taşıyan ARC140 Oligonükleotid T4 RNA ligaz tarafından tane. (5) ikinci strand kullanarak T7 DNA polimeraz ve rasgele N6 dizileri içeren ARC76-77 oligonucleotides sentezlenir. (6) Kütüphane ARC49 ve ARC78 ARC107 dizin astar çoğullama için benzersiz bir barkod içeren için birini kullanarak bir yüksek-sadakat DNA polimeraz tarafından güçlendirilmiş. (7) 5´-uçları eşleştirilmiş uç sıralama tarafından bulunur. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig2.jpg"> 
Şekil 2: yöntemi doğrulama. (A)temsilcisi electropherograms kalitesini belirlemek için bir otomatik Elektroforez sistemi kullanılarak oluşturulan oluşturulan kitaplıkları KOH veya KCl. (B) Summarized sinyal, HincII sitelerdeki ağır (HS) ve hafif strand (LS) ile tedavi insan mtDNA KCl (sol kapı aynası) veya KOH (doğru panelleri) tedavi sonra. (C) Circos Ücretsiz 5´-biter (yeşil) ve HydEn-Seq (Ücretsiz 5´-biter ve ribonucleotides, kırmızı) HS (sol paneli) ve LS (doğru kapı aynası) insan mtDNA gelen rakam. Tepeler milyon okuma için normalleştirilmiş ve en yüksek tepe HydEn seq kütüphanesinin okuma sayısı üst sınırı için ayarlanır. Ribonucleotides (üst paneli) ve ağır (H) ve (L) ışık strand insan mtDNA (Mito.) veya ters (RV) veya ileri (FW) iplikçik nükleer (Nuc.) HincII siteleri (alt paneli), (D) Summarized ham okur DNA'SI. Rakamlar B, C ve D başvuru12den adapte olmuşlardır. Hata çubukları ortalama standart hatasını temsil eder. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig3.jpg"> 
Şekil 3: temsilcisi sonuçları. (A) göreli sayısı ribonucleotides HincII sitelerde ağır (H) veya ışık (L) strand üzerinde tedavi KOH kitaplıkları için okuma için normalleştirilmiş. Ribonucleotide kimlik mtDNA genom kompozisyon KOH için (B) oranı (KOH) tedavi ve HincII tedavi KOH ile (HincII + KOH) ağır (H) veya hafif (L) iplikçik mtDNA arşivini i ciddi. (C) Ribonucleotide frekans HincII ve KOH kitaplıkları ağır (H) veya ışık (L) iplikçik mtDNA tedavi için 1.000 tamamlayıcı bazlar için normalleştirilmiş. Rakamlar referans12den adapte olmuşlardır. Hata çubukları ortalama standart hatasını temsil eder. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adı</td>
			<td colspan="4">Sıra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC49</td>
			<td colspan="4">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC76</td>
			<td colspan="4">GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC77</td>
			<td colspan="4">AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC78</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC84</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC85</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC86</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC87</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA</td></tr></tbody></table>HM PLAKETLİ DELİKLİ
		
		<tr>
			<td>ARC88</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC89</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC90</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC91</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC93</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC94</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC95</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC96</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC97</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC98</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC99</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC100</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC101</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC102</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC103</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC104</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC105</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC106</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC107</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC140</td>
			<td colspan="4">/ 5AmMC6/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
	

Tablo 1: Oligonucleotides. HydEn-devamı için kullanılan oligonucleotides vardır Cesur yüzünü dizin oluşturma gösterir. * bir phosphorothioate bağ gösterir. ARC140 C6 bağlayıcı ile birlikte bir 5´-OH grubu yerine bir 5´ amino grubu içerir. Bu değişiklik ARC140 concatemers oluşumu sırasında ligasyonu azaltır.

Burada tarif biz aynı anda quantitate için müsait bir yöntem ve genomik DNA'ın enzimatik bölünme onun alkalin hidroliz ve sonraki 5´ uç ile birleştirerek tek nükleotid çözünürlükte son derece sağlam DNA genom geniş harita ribonucleotides sıralama.

Eş zamanlı haritalama ve Nefelometri Ribonucleotides insan mitokondriyal DNA'ın

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Bu deneyin genel amacı, tek nükleotid çözünürlük seviyesinde birleştirilmiş ribonükleotidlerin konumunu haritalamak ve insan mitokondriyal DNA'sında bulunan ribonükleotidlerin sayısını ölçmektir. Bu yöntem, DNA bütünlüğü, DNA replikasyon mekanizmaları, DNA onarım mekanizmaları ve bu mekanizmaların herhangi birindeki kusurların hastalığa nasıl neden olduğu ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, mitokondriyal DNA'daki dahil ribonükleotidlerin hem yerinin hem de sayısının tek bir deneyde belirlenebilmesidir.Bu yöntem, insan mitokondriyal DNA'sındaki ribonükleotid içeriği hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer model organizmaların dizi genomlarındaki nükleer DNA ve ribonükleotid içeriğini incelemek için de uygulanabilir. Bu deneyde daha önce HeLa hücrelerinden izole edilen ve metin protokolünün ikinci ve üçüncü bölümlerinde açıklanan genomik DNA kullanılmıştır. DNA'yı sindirmek için, aşağıdakileri bir mikrofuj tüpünde dikkatlice karıştırın.Bir mikrogram DNA, beş mikrolitre 10X tampon 3.1, bir mikrolitre HincII ve 50 mikrolitrelik nihai hacme kadar nükleaz içermeyen su. 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Sindirim tamamlandığında, her numuneye 1,8 hacim paramanyetik boncuk ekleyin, pipetleme ile dikkatlice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.Boncukları peletlemek için tüpleri beş dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın. Peleti 150 mikrolitre% 70 etanol ile yaklaşık 30 saniye yıkayın, ardından süpernatanı çıkarın ve atın. 200 mikrolitre% 70 etanol ile yıkamayı 30 saniye daha tekrarlayın.Numuneleri oda sıcaklığında yaklaşık 15 ila 20 dakika kurutun. Ardından, tüpleri manyetik raftan çıkarın. Her peleti 45 mikrolitre elüsyon tamponunda elute edin, dikkatlice pipetleyerek karıştırın ve beş dakika inkübe edin.Boncukları manyetik rafa yerleştirin ve her DNA örneğinin 45 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın. Her 45 mikrolitre izole edilmiş veya saflaştırılmış DNA'ya, beş mikrolitre üç molar potasyum hidroksit veya beş mikrolitre üç molar potasyum klorür ekleyerek toplam 50 mikrolitre hacim oluşturun. Sekiz reaksiyon bu tabloda özetlenmiştir.55 santigrat derecede bir hibridizasyon fırınında iki saat inkübe edin, ardından numuneleri buz üzerinde beş dakika inkübe edin. pH 5.2'de 10 mikrolitre üç molar sodyum asetat ve 125 mikrolitre soğuk,% 100 etanol ekleyerek DNA'yı çökeltin ve beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Beş dakika boyunca dört santigrat derecede 21.000 kez G'de santrifüjleyerek DNA'yı peletleyin.Süpernatanı atın ve her DNA peletini 250 mikrolitre soğuk,% 70 etanol ile yıkayın, tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peletin açık tüpte yaklaşık beş ila 10 dakika kurumasını bekleyin, görünür herhangi bir sıvı buharlaşana kadar. Son olarak, 20 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve DNA peletinin oda sıcaklığında 30 dakika çözünmesine izin verin.Bu prosedüre, her numune için reaksiyon karışımını bir ana karışım olarak hazırlayarak başlayın. Her numune için 2.5 mikrolitre 10x T4 polinükleotid kinaz reaksiyon tamponu, 2.5 mikrolitre ATP ve bir mikrolitre üç asal fosfataz-eksi T4 polinükleotid kinaz ekleyin. Her DNA örneğinin 19 mikrolitresini 200 mikrolitrelik yeni bir tüpe aktarın ve üç dakika boyunca bir termosiklerörde 85 santigrat derecede denatüre edin.Daha sonra, DNA örneklerini buz üzerinde soğutun ve her bir örneğe hazırlanan reaksiyon karışımından altı mikrolitre ekleyin. Reaksiyon karışımlarını 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin, ardından reaksiyonu durdurmak için 20 dakika boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Daha önce gösterildiği gibi paramanyetik boncuklar kullanarak DNA'yı saflaştırın, ancak 14 mikrolitre elüsyon tamponu ile elüte edin.Reaksiyon karışımını, her numune için aşağıdakileri içerecek şekilde önceden bir ana karışım olarak hazırlayın. Beş mikrolitre 10x T4 RNA ligaz reaksiyon tamponu, beş mikrolitre heksamminkobalt(III)klorür, 0.5 mikrolitre ARC140 oligonükleotid, 0.5 mikrolitre ATP ve 25 mikrolitre %50 PEG 8000. Pipetleyerek iyice karıştırın.Her saflaştırılmış DNA'nın 13 mikrolitresini 200 mikrolitrelik yeni bir tüpe aktarın ve üç dakika boyunca bir termodöngüleyicide 85 santigrat derecede denatüre edin. DNA'yı buz üzerinde soğutun ve ardından her numuneye 36 mikrolitre reaksiyon karışımı ekleyin, pipetleyerek karıştırın ve kısa bir süre döndürün. Her reaksiyona bir mikrolitre T4 RNA ligaz ekleyin, pipetleyerek karıştırın ve kısa bir süre döndürün.Numuneleri gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin. Tek iplikli DNA ligasyonu tamamlandığında, DNA'yı daha önce gösterildiği gibi saflaştırın, ancak 0.8 hacim paramanyetik boncuk kullanın ve boncukları 10 dakika boyunca peletleyin. 20 mikrolitre elüsyon tamponunda boşaltın ve her DNA örneğinin 20 mikrolitresini yeni bir 200 mikrolitrelik tüpe aktarın.Saflaştırmayı 0.8 hacim paramanyetik boncuk ile tekrarlayın ve 14 mikrolitre elüsyon tamponunda elüte edin. Her numune için, reaksiyon karışımını iki mikrolitre 10x T7 DNA polimeraz reaksiyon tamponu, iki mikrolitre ARC76/77, iki mikrolitre dNTP ve 0.8 mikrolitre BSA'dan oluşan bir ana karışım olarak hazırlayın. 12.8 mikrolitre saflaştırılmış DNA'yı 200 mikrolitrelik yeni bir tüpe aktarın ve üç dakika boyunca bir termosiklerörde 85 santigrat derecede denatüre edin.DNA'yı buz üzerinde soğutun ve ardından her numuneye 6.8 mikrolitre reaksiyon karışımı ekleyin, pipetleyerek karıştırın, kısa bir süre döndürün ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Her reaksiyona 0.4 mikrolitre T7 DNA polimeraz ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. DNA'yı paramanyetik boncuklar kullanarak saflaştırdıktan sonra, 11 mikrolitre elüsyon tamponunda elute edin.PCR amplifikasyonuna başlamak için, reaksiyon karışımını 7,5 mikrolitre ARC49, 7,5 mikrolitre benzersiz indeks astarı ve 25 mikrolitre 2X sıcak başlatmaya hazır karışımdan oluşan 200 mikrolitrelik yeni bir tüpte her numune için ayrı ayrı hazırlayın. Her reaksiyona 10 mikrolitre DNA örneği ekleyin. Aşağıdaki koşulları kullanarak kitaplığı yükseltin.45 saniye boyunca 95 santigrat derecede denatüratür, ardından 15 saniye boyunca 98 santigrat derece, 30 saniye boyunca 65 santigrat derece, 30 saniye boyunca 72 santigrat derece ve iki dakika boyunca 72 santigrat derecede son bir uzama ile sona erer. Amplifikasyondan sonra numuneleri dört santigrat derecede tutun. Kitaplıkları metin protokolünde açıklandığı gibi saflaştırın ve 20 mikrolitre TE tamponunda elute edin.Dijital bir elektroforez sistemi kullanarak her kitaplığın kalitesini ve ortalama parça boyutunu belirleyin. Potasyum hidroksit veya potasyum klorür muamelesinden sonra uygun kütüphane profillerinin temsili sonuçları gösterilmektedir. Her bir kitaplığın konsantrasyonunu hesapladıktan sonra, metin protokolünde dokuzuncu ve 10. bölümlerde açıklandığı gibi sıralama için farklı indeks primerleri ile güçlendirilmiş 24 kitaplıka kadar eşit molar miktarları çekin.25 mikrolitrelik bir son hacme ve 10 nanomolar konsantrasyona TE tamponu ekleyin. Sıralamadan sonra, metin protokolünün 11. bölümünde belirtildiği gibi biyoinformatik veri analizi yapın. Bu grafikler, potasyum klorür muamelesinden sonra hafif iplikli ve ağır iplikli insan mitokondriyal DNA'sındaki tüm HincII bölgelerinde özetlenmiş okumaları göstermektedir.Tespit edilen beş asal ucun yaklaşık% 70'i kesilen bölgelere lokalize olmuştur ve bu da HincII sindiriminin yüksek verimliliğini göstermektedir. Gömülü ribonükleotidlerde DNA'yı hidrolize etmek için kitaplıkları potasyum hidroksit ile işlemek, HincII'deki okuma sayısını yaklaşık %40'a düşürür Mitokondriyal ve nükleer DNA'daki nispi okuma sayısı, kapsamdaki farklılıkları ortaya çıkarır ve iplik yanlılığını gidermek için uygun normalleştirmenin önemini gösterir. Okuma sayılarının HincII'ye normalleştirilmesi, ağır veya hafif iplik üzerindeki mitokondriyal genom başına ribonükleotid sayısının nicel bir ölçüsünü verir.Her bir ribonükleotid için potasyum hidroksit işleminden sonra, her bir ipliğin dizi bileşimine normalize edilmiş okumalar, birden farklı bir oran gösterir, bu da okumaların rastgele olmayan bir dağılımını gösterir ve farklı bir ribonükleotid modeli ve yüksek bir kütüphane kalitesi önerir. Gömülü ribonükleotidlerin bölgelerindeki okumaların HincII bölgelerindekilere ve ayrıca genom nükleotid içeriğine normalleştirilmesi, her bir ribonükleotidin kaç tanesinin 1.000 tamamlayıcı baz başına dahil edildiğine dair nicel bir ölçüm üretir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse iki gün içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, DNA'yı yüksek derecede hassas tutmayı ve kütüphane hazırlığı sırasında herhangi bir çift iplik kopması yapmaktan kaçınmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ribonükleotid miktar tayin verilerini doğrulamak için aşağıdaki gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, yeni nesil dizileme kullanarak ribonükleotidlerin ve DNA'nın haritalanması ve miktarının belirlenmesi için kütüphanelerin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.Potasyum hidroksit gibi kimyasallarla çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman göz koruması ve eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

simultaneous-mapping-quantitation-ribonucleotides-human-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Burada, mitokondriyal DNA (mtDNA) metilasyon doğru miktar bir iletişim kuralını mevcut. Bu protokol için bir enzimatik sindirim DNA BamHI tahmindi mtDNA metilasyon düzeyi mtDNA ikincil yapı tarafından neden önlemek için kullanılan bioinformatic analiz boru hattı ile birleştiğinde ile açıklanmaktadır.

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Protokol, mitokondriyal nükleoidlerin ticari olarak kullanılabilen DNA jeli lekesi ile özel etiketlemesini, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SR-SIM) ile zaman atlamalı canlı etiketli hücrelerin zaman atlamalı serilerinin edinimini ve nükleoid hareketinin otomatik olarak izlenmesini açıklar.

Hızlandırılmış Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskomu için Mitokondriyal Nükleoidlerin Özel Etiketlemesi

Dairesel RT-PCR, nicel RT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase-Treatment ve Kuzey Blot 'u birleştirerek döngüsel bir RT-PCR tabanlı strateji sunuyoruz. Bu protokol dengesiz 5 ' trifosfat etkisini en aza indirmek için bir normalleştirme adım içerir, ve ayrımcılık ve, Mısır mitochondrion dengeli birikmiş birincil ve işlenmiş transkriptler haritalama için uygundur.

Dairesel bir RT-PCR tabanlı strateji kullanarak Maize mitochondrion 'da primer ve Işlenmiş transkriptlerin ayrımcılık ve haritalama

Pirosekans testleri, heteroplazmik hücrelerde veya dokularda mitokondriyal DNA tek nükleotid polimorfizmlerinin sağlam ve hızlı genotiplendirilmesini sağlar.

Mitokondriyal Genomdaki Tek Nükleotid Polimorfizmlerinin Pirosequencing ile Genotiplenmesi

mtDNA sentezini ve dağılımını tespit etmek ve ölçmek için çok kuyucuklu bir plaka formatı ve otomatik immünofloresan görüntüleme kullanarak hücrelerdeki mitokondriyal DNA (mtDNA) metabolizmasının dinamiklerini incelemek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu, çeşitli inhibitörlerin, hücresel streslerin ve gen susturmanın mtDNA metabolizması üzerindeki etkilerini araştırmak için de kullanılabilir.

Mitokondriyal DNA Sentezi ve Dağılımının Yüksek Verimli Görüntü Tabanlı Nicelleştirilmesi

Belirli hücrelerin içine hESC Yönetmen farklılaşma, rejeneratif tıp alanında büyük ilgi yarattı. Biz belirlemek için bir özlü, adım-adım...

Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama

ΓH2AX odaklarının dayanarak DNA çift iplikli sonlarının kantitasyonu doku radiosensitivity ve radyasyon değiştirerek bileşikler etkileri değerlendirilmesi için, özellikle radyasyon biyoloji, paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada doku örnekleri γH2AX odaklarının kantitatif bir immünofloresan testinin kullanımını göstermek.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

Açıklanan kolay ve yoğunluk bağımsız zenginleştirme için bir biyotin bağlayıcının aktarmak tıkırtı kimya ve ardından, 5-HMC için bir azit-glikoz aktarmak için β-glukoziltransferaz (β-GT) ile iki aşamalı bir etiketleme bir işlemdir. Bu etkili ve spesifik bir etiketleme yöntemi nesil dizileme ile son derece düşük arka plan ve yüksek verimlilik epigenomic haritalama ile 5-HMC zenginleşmesine olanak sağlar.

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

Rasyometrik bimoleküler işaretleri (RBMBs) canlı hücreler görüntü tek bir mühendislik RNA transkriptleri için kullanılabilir. Burada, RBMBs, mikroporasyonu ve gerçek zamanlı olarak tek RNA transkriptlerinin floresan görüntüleme hücrelere RBMBs teslimat hazırlanmasını ve saflaştırılmasını tanımlarlar.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Keşfedin, insan mitokondriyal DNA'sındaki ribonükleotidlerin tek nükleotid çözünürlüğünde eş zamanlı haritalama ve kantitatif analiz yöntemini. Bu teknik DNA bütünlüğü ve hastalık mekanizmaları araştırmalarında değerli bir araçtır.

Eş zamanlı haritalama ve Nefelometri Ribonucleotides insan mitokondriyal DNA'ın

Daha fazla video keşfet