Eş zamanlı haritalama ve Nefelometri Ribonucleotides insan mitokondriyal DNA'ın

Bu deneyin genel amacı, tek nükleotid çözünürlük seviyesinde birleştirilmiş ribonükleotidlerin konumunu haritalamak ve insan mitokondriyal DNA'sında bulunan ribonükleotidlerin sayısını ölçmektir. Bu yöntem, DNA bütünlüğü, DNA replikasyon mekanizmaları, DNA onarım mekanizmaları ve bu mekanizmaların herhangi birindeki kusurların hastalığa nasıl neden olduğu ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, mitokondriyal DNA'daki dahil ribonükleotidlerin hem yerinin hem de sayısının tek bir deneyde belirlenebilmesidir.

Bu yöntem, insan mitokondriyal DNA'sındaki ribonükleotid içeriği hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer model organizmaların dizi genomlarındaki nükleer DNA ve ribonükleotid içeriğini incelemek için de uygulanabilir. Bu deneyde daha önce HeLa hücrelerinden izole edilen ve metin protokolünün ikinci ve üçüncü bölümlerinde açıklanan genomik DNA kullanılmıştır. DNA'yı sindirmek için, aşağıdakileri bir mikrofuj tüpünde dikkatlice karıştırın.

Bir mikrogram DNA, beş mikrolitre 10X tampon 3.1, bir mikrolitre HincII ve 50 mikrolitrelik nihai hacme kadar nükleaz içermeyen su. 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Sindirim tamamlandığında, her numuneye 1,8 hacim paramanyetik boncuk ekleyin, pipetleme ile dikkatlice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Boncukları peletlemek için tüpleri beş dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın. Peleti 150 mikrolitre% 70 etanol ile yaklaşık 30 saniye yıkayın, ardından süpernatanı çıkarın ve atın. 200 mikrolitre% 70 etanol ile yıkamayı 30 saniye daha tekrarlayın.

Numuneleri oda sıcaklığında yaklaşık 15 ila 20 dakika kurutun. Ardından, tüpleri manyetik raftan çıkarın. Her peleti 45 mikrolitre elüsyon tamponunda elute edin, dikkatlice pipetleyerek karıştırın ve beş dakika inkübe edin.

Boncukları manyetik rafa yerleştirin ve her DNA örneğinin 45 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın. Her 45 mikrolitre izole edilmiş veya saflaştırılmış DNA'ya, beş mikrolitre üç molar potasyum hidroksit veya beş mikrolitre üç molar potasyum klorür ekleyerek toplam 50 mikrolitre hacim oluşturun. Sekiz reaksiyon bu tabloda özetlenmiştir.

55 santigrat derecede bir hibridizasyon fırınında iki saat inkübe edin, ardından numuneleri buz üzerinde beş dakika inkübe edin. pH 5.2'de 10 mikrolitre üç molar sodyum asetat ve 125 mikrolitre soğuk,% 100 etanol ekleyerek DNA'yı çökeltin ve beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Beş dakika boyunca dört santigrat derecede 21.000 kez G'de santrifüjleyerek DNA'yı peletleyin.

Süpernatanı atın ve her DNA peletini 250 mikrolitre soğuk,% 70 etanol ile yıkayın, tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peletin açık tüpte yaklaşık beş ila 10 dakika kurumasını bekleyin, görünür herhangi bir sıvı buharlaşana kadar. Son olarak, 20 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve DNA peletinin oda sıcaklığında 30 dakika çözünmesine izin verin.

Bu prosedüre, her numune için reaksiyon karışımını bir ana karışım olarak hazırlayarak başlayın. Her numune için 2.5 mikrolitre 10x T4 polinükleotid kinaz reaksiyon tamponu, 2.5 mikrolitre ATP ve bir mikrolitre üç asal fosfataz-eksi T4 polinükleotid kinaz ekleyin. Her DNA örneğinin 19 mikrolitresini 200 mikrolitrelik yeni bir tüpe aktarın ve üç dakika boyunca bir termosiklerörde 85 santigrat derecede denatüre edin.

Daha sonra, DNA örneklerini buz üzerinde soğutun ve her bir örneğe hazırlanan reaksiyon karışımından altı mikrolitre ekleyin. Reaksiyon karışımlarını 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin, ardından reaksiyonu durdurmak için 20 dakika boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Daha önce gösterildiği gibi paramanyetik boncuklar kullanarak DNA'yı saflaştırın, ancak 14 mikrolitre elüsyon tamponu ile elüte edin.

Reaksiyon karışımını, her numune için aşağıdakileri içerecek şekilde önceden bir ana karışım olarak hazırlayın. Beş mikrolitre 10x T4 RNA ligaz reaksiyon tamponu, beş mikrolitre heksamminkobalt(III)klorür, 0.5 mikrolitre ARC140 oligonükleotid, 0.5 mikrolitre ATP ve 25 mikrolitre %50 PEG 8000. Pipetleyerek iyice karıştırın.

Her saflaştırılmış DNA'nın 13 mikrolitresini 200 mikrolitrelik yeni bir tüpe aktarın ve üç dakika boyunca bir termodöngüleyicide 85 santigrat derecede denatüre edin. DNA'yı buz üzerinde soğutun ve ardından her numuneye 36 mikrolitre reaksiyon karışımı ekleyin, pipetleyerek karıştırın ve kısa bir süre döndürün. Her reaksiyona bir mikrolitre T4 RNA ligaz ekleyin, pipetleyerek karıştırın ve kısa bir süre döndürün.

Numuneleri gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin. Tek iplikli DNA ligasyonu tamamlandığında, DNA'yı daha önce gösterildiği gibi saflaştırın, ancak 0.8 hacim paramanyetik boncuk kullanın ve boncukları 10 dakika boyunca peletleyin. 20 mikrolitre elüsyon tamponunda boşaltın ve her DNA örneğinin 20 mikrolitresini yeni bir 200 mikrolitrelik tüpe aktarın.

Saflaştırmayı 0.8 hacim paramanyetik boncuk ile tekrarlayın ve 14 mikrolitre elüsyon tamponunda elüte edin. Her numune için, reaksiyon karışımını iki mikrolitre 10x T7 DNA polimeraz reaksiyon tamponu, iki mikrolitre ARC76/77, iki mikrolitre dNTP ve 0.8 mikrolitre BSA'dan oluşan bir ana karışım olarak hazırlayın. 12.8 mikrolitre saflaştırılmış DNA'yı 200 mikrolitrelik yeni bir tüpe aktarın ve üç dakika boyunca bir termosiklerörde 85 santigrat derecede denatüre edin.

DNA'yı buz üzerinde soğutun ve ardından her numuneye 6.8 mikrolitre reaksiyon karışımı ekleyin, pipetleyerek karıştırın, kısa bir süre döndürün ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Her reaksiyona 0.4 mikrolitre T7 DNA polimeraz ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. DNA'yı paramanyetik boncuklar kullanarak saflaştırdıktan sonra, 11 mikrolitre elüsyon tamponunda elute edin.

PCR amplifikasyonuna başlamak için, reaksiyon karışımını 7,5 mikrolitre ARC49, 7,5 mikrolitre benzersiz indeks astarı ve 25 mikrolitre 2X sıcak başlatmaya hazır karışımdan oluşan 200 mikrolitrelik yeni bir tüpte her numune için ayrı ayrı hazırlayın. Her reaksiyona 10 mikrolitre DNA örneği ekleyin. Aşağıdaki koşulları kullanarak kitaplığı yükseltin.

45 saniye boyunca 95 santigrat derecede denatüratür, ardından 15 saniye boyunca 98 santigrat derece, 30 saniye boyunca 65 santigrat derece, 30 saniye boyunca 72 santigrat derece ve iki dakika boyunca 72 santigrat derecede son bir uzama ile sona erer. Amplifikasyondan sonra numuneleri dört santigrat derecede tutun. Kitaplıkları metin protokolünde açıklandığı gibi saflaştırın ve 20 mikrolitre TE tamponunda elute edin.

Dijital bir elektroforez sistemi kullanarak her kitaplığın kalitesini ve ortalama parça boyutunu belirleyin. Potasyum hidroksit veya potasyum klorür muamelesinden sonra uygun kütüphane profillerinin temsili sonuçları gösterilmektedir. Her bir kitaplığın konsantrasyonunu hesapladıktan sonra, metin protokolünde dokuzuncu ve 10. bölümlerde açıklandığı gibi sıralama için farklı indeks primerleri ile güçlendirilmiş 24 kitaplıka kadar eşit molar miktarları çekin.

25 mikrolitrelik bir son hacme ve 10 nanomolar konsantrasyona TE tamponu ekleyin. Sıralamadan sonra, metin protokolünün 11. bölümünde belirtildiği gibi biyoinformatik veri analizi yapın. Bu grafikler, potasyum klorür muamelesinden sonra hafif iplikli ve ağır iplikli insan mitokondriyal DNA'sındaki tüm HincII bölgelerinde özetlenmiş okumaları göstermektedir.

Tespit edilen beş asal ucun yaklaşık% 70'i kesilen bölgelere lokalize olmuştur ve bu da HincII sindiriminin yüksek verimliliğini göstermektedir. Gömülü ribonükleotidlerde DNA'yı hidrolize etmek için kitaplıkları potasyum hidroksit ile işlemek, HincII'deki okuma sayısını yaklaşık %40'a düşürür Mitokondriyal ve nükleer DNA'daki nispi okuma sayısı, kapsamdaki farklılıkları ortaya çıkarır ve iplik yanlılığını gidermek için uygun normalleştirmenin önemini gösterir. Okuma sayılarının HincII'ye normalleştirilmesi, ağır veya hafif iplik üzerindeki mitokondriyal genom başına ribonükleotid sayısının nicel bir ölçüsünü verir.

Her bir ribonükleotid için potasyum hidroksit işleminden sonra, her bir ipliğin dizi bileşimine normalize edilmiş okumalar, birden farklı bir oran gösterir, bu da okumaların rastgele olmayan bir dağılımını gösterir ve farklı bir ribonükleotid modeli ve yüksek bir kütüphane kalitesi önerir. Gömülü ribonükleotidlerin bölgelerindeki okumaların HincII bölgelerindekilere ve ayrıca genom nükleotid içeriğine normalleştirilmesi, her bir ribonükleotidin kaç tanesinin 1.000 tamamlayıcı baz başına dahil edildiğine dair nicel bir ölçüm üretir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse iki gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, DNA'yı yüksek derecede hassas tutmayı ve kütüphane hazırlığı sırasında herhangi bir çift iplik kopması yapmaktan kaçınmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ribonükleotid miktar tayin verilerini doğrulamak için aşağıdaki gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, yeni nesil dizileme kullanarak ribonükleotidlerin ve DNA'nın haritalanması ve miktarının belirlenmesi için kütüphanelerin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Potasyum hidroksit gibi kimyasallarla çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman göz koruması ve eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.