Görselleştirme Thalamocortical Axon dallanma ve sinaps oluşumunda Organotypic Cocultures
28 Mart 2018
Bu iletişim kuralı thalamocortical akson dallanma ve synapse oluşumu organotypic cocultures, talamus ve serebral korteks eşzamanlı görüntüleme için bir yöntemi açıklar. Bireysel thalamocortical akson ve presynaptic onların terminalleri bir tek hücre çoğalmasıyla tekniği ile DsRed ve synaptophysin GFP öğesini tarafından görüntülenmiştir.
Bu yöntemin genel amacı, talamokortikal projeksiyonda akson dallanmasının ve sinaps oluşumunun dinamik morfolojik değişikliklerini incelemektir. Bu yöntem, yeni nöral devre oluşumu gibi nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bireysel canlı hücrelerde akson büyümesinin ve sinaps oluşumunun aynı anda gözlemlenmesidir.
Bu yöntem, talamokortikal projeksiyonlarda akson dallanması ve sinaps oluşumu arasındaki ilişki hakkında fikir verebilir. Serebral korteksteki içsel bağlantı gibi diğer nöral devrelere de uygulanabilir. Bu işleme başlamak için tüm cerrahi aletleri %70 etanol ile 10 dakika veya daha uzun süre sterilize edin.
Daha sonra, buz gibi soğuk anestezi altında doğum sonrası ikinci gün faresinden tüm beyni hızlı bir şekilde inceleyin. Ardından, beyni 40 mililitre soğuk Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi içeren 100 milimetrelik bir petri kabına yerleştirin. Binoküler mikroskop altında, pia maddesini ince forsepslerle dikkatlice çıkarın ve birincil görsel ve somatosensoriyel korteksi mikrocerrahi makas kullanarak 300 ila 400 mikron kalınlığında dilimler halinde kesin.
Bundan sonra, kortikal dilimleri tek kullanımlık bir plastik pipet kullanarak kültür ekinin membran filtresine aktarın. Tek kullanımlık plastik pipetle kültür ekinin merkezine yakın dilimlerin konumlarını ayarlayın ve ek parçadaki fazla ortamı çıkarın. Dilimleri serum içeren kültür ortamında 37 santigrat derecede tutun ve yanına bir E15 embriyosundan talamik bir blok yerleştirmeden önce bir gün boyunca tek başına kültürleyin.
Ortamın seviyesini dilim yüzeyinin biraz altına ayarlayın, böylece dilimler hem gazı hem de ortamı yeterli miktarda alabilir. Bu, dilimlerin canlılığı için çok önemlidir. Bu adımda, cam kılcal damarları bir elektrot çektirme ile yapın.
Daha sonra plazmit enjeksiyonu için cam kılcal damarların uçlarını kırın. Elektrot pipetleri için, cam kılcal damarların uçlarını zımpara kağıdı ile zımparalayın ve parlatın. Ardından, 50 ila 200 mikronluk bir iç çap elde etmek için onları ateşle parlatın.
Ardından, elektrot pipetini ve ejeksiyon pipetini manipülatörlere takın. Beş mikrolitre plazmit çözeltisini bir petri kabına aktarın. Ardından çözeltiyi kılcal hareket ile elektrot pipetine çekin.
0,2 milimetre çapındaki elektrodu elektrot pipetine yerleştirin. Ejeksiyon pipetini plastik bir tüplü bir mililitrelik şırıngaya bağladıktan sonra, beş mikrolitre plazmit çözeltisini tekrar bir petri kabına aktarın. Ardından şırıngayı kullanarak çözeltiyi yavaşça ejeksiyon pipetine çekin.
Bunu takiben, kokültürü elektroporasyon aşamasına aktarın ve bir milimetre çapındaki elektrodu kültür ortamına yerleştirin. Daha sonra, ejeksiyon pipetini kültürlenmiş talamik blok üzerine yerleştirin. Uç talamik bloğun yüzeyine temas ettikten sonra şırıngayı manuel olarak itin.
Ejeksiyon pipetinin geri çekilmesinden hemen sonra elektrot pipetini talamik bloğa yerleştirin. Şimdi, elektrik darbelerini iletin. Osiloskop üzerindeki tren genliğini ve sayısını izleyin.
Daha sonra, elektrot pipetini geri çekin ve tabağı inkübatöre geri koyun. Numuneyi gözlemlemek için, kültür kabını EGFP ve DsRed için iki filtre seti ile donatılmış dik bir konfokal mikroskop sahnesine yerleştirin. Ardından, 20x uzun çalışma mesafeli objektif lens ile bir ila yedi mikronluk adım boyutlarında 10 ila 25 optik bölümün görüntülerini çekin.
Hem DsRed hem de Syp-EGFP'yi ifade eden, ayrı ayrı ayırt edilebilir etiketli aksonları seçin. Burada gösterilen, 12 DIV'den sonra talamik ve kortikal dilimlerin organotipik bir kokültürüdür. İşte kutulu bölgenin büyütülmüş bir görüntüsü.
Ve burada DsRed etiketli bir talamik hücre bir akson kortikal dilime uzatıyor ve üst katmanlarda dallar oluşturuyor. Bu görüntüler DsRed etiketli talamokortikal akson ve Syp-EGFP punktayı göstermektedir. Tek bir talamokortikal akson boyunca ayrı Syp-EGFP birikimi gözlendi.
DsRed artı Syp-EGFP plazmitleri, elektroporasyon kullanılarak bir DIV'de kültürlenmiş talamik hücrelere sokuldu. Bu akson dört gün boyunca günlük olarak görüntülendi. Akson dallanması ve sinaps oluşumu, ekleme ve eleme ile dinamikti.
Bu işlemleri takiben, genin akson dallanması ve sinaps oluşumlarındaki rolünü araştırmak için Syp-EGFP ve DsRed ile birlikte ilginç genlerle elektroporasyon yapılabilir. Bu teknik, nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların nöral devrelerin dinamik değişim mekanizmalarını keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, talamus ve serebral korteksin organotipik kokültürlerinde talamokortikal akson dallanmasının ve sinaps oluşumunun eş zamanlı görüntülenmesine yönelik bir protokol sunmaktadır. Çalışma, talamokortikal projeksiyondaki dinamik morfolojik değişikliklere odaklanarak, yeni nöral devre oluşumu ile akson büyümesi ve sinaps gelişimi arasındaki ilişkiye dair içgörüler sağlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Nörobiyoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Talamokortikal projeksiyonlar, duyusal işlemede kritik bir rol oynar.
- Akson dallanmasını ve sinaps oluşumunu anlamak, nöral devre oluşumuna dair içgörüler elde etmek için temel teşkil eder.
- Mevcut yöntemler, bu değişimleri hücresel düzeyde eş zamanlı olarak gözlemleme konusunda sınırlamalara sahiptir.
- Bu çalışma, canlı hücre ortamlarında görüntüleme tekniklerini geliştirmektedir.
Çalışmanın Amacı
- Akson dallanması ve sinaps oluşumu sırasındaki dinamik morfolojik değişimleri araştırmak.
- Ko-kültürdeki bireysel canlı hücrelerin gözlemlenmesine olanak tanıyan bir yöntem sunmak.
- Talamokortikal nöronlarda akson büyümesi ile sinaptik gelişim arasındaki ilişkiyi değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Talamik ve kortikal dilimlerin organotipik kokültürleri kullanılmıştır.
- Biyolojik modeli oluşturmak için postnatal ikinci gün sıçan dokusu kullanılmıştır.
- Görüntüleme için floresan işaretleyicileri aktarmak amacıyla elektroporasyon uygulanmıştır.
- Kültürler 37 °C'de tutulmuş ve belirli gelişimsel zaman noktalarında gözlemlenmiştir.
- Aksonal dinamikleri yakalamak için konfokal mikroskop kullanılarak görüntüleme yapılmıştır.
Ana Sonuçlar
- Akson dallanması ve sinaps oluşumundaki dinamik değişiklikler gözlemlenmiş, bu durum talamokortikal projeksiyonlardaki plastisiteyi vurgulamıştır.
- Aksonlar boyunca sinaptik belirteçlerin belirgin birikimi kaydedilmiş, bu da devam eden sinaptik gelişime işaret etmiştir.
- Bu teknik, tekil hücrelerdeki morfolojik değişikliklerin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine olanak sağlamıştır.
- Bulgular, akson ve sinaps dinamiklerinde genlerin rollerini araştırma potansiyelini vurgulamaktadır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, nöral devre dinamikleri ve plastisitesini incelemek için yeni bir yöntemi ortaya koymaktadır.
- Akson büyümesi ve sinaps oluşumunun eşleşmesine dair bilgiler sunmaktadır.
- Bulgular, sağlıklı durumlarda ve hastalıklarda nöral bağlantısallık ve plastisite mekanizmalarının anlaşılması açısından önem taşımaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama ve Önem
Bu yöntem, yaşayan nöral devrelerde akson dallanmasının ve sinaps oluşumunun eş zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayarak, nörogelişimsel hedef doğrulamadaki temel bir mekanistik boşluğu doldurmaktadır. Yapısal plastisiteye ilişkin dinamik ve tek hücre çözünürlüğünde veriler sunarak, sinaptik hedeflerin mekanistik risklerinin azaltılmasının kritik olduğu erken keşif aşamalarında öngörülebilir güvenilirliği destekler. Bu yaklaşım, mekanistik içgörülerden nöropsikiyatrik hastalık modellerindeki devre düzeyindeki fenotiplerin preklinik değerlendirmesine kadar translasyonel bir süreklilik sunar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Talamokortikal yolaklarda akson morfolojisi ile sinaptik bağlantı arasındaki ilişkiye dair terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Dinamik yapısal değişikliklerin boylamsal gözlemi için lamine mimariyi ve nöronal canlılığı korur.
- Bilimsel Değer: Yapısal büyüme ile fonksiyonel sinaptogenez arasındaki nedensel ilişkileri açıklığa kavuşturarak biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Analiz standardizasyonu için aksonal dallanmanın ve presinaptik marker birikiminin kantitatif, multiple okumalarını oluşturur.
- Operasyonel Değer: Nörogelişimsel yolaklarda sonraki bileşik taramaları için doğrulanmış biyolojik sistemlerin hazırlanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Multiple floresan okumalarla uyumlu, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir görüntüleme iş akışlarını kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Talamokortikal bağlantı bozukluğunun duyusal ve bilişsel fenotiplere katkıda bulunduğu hastalıkla ilgili sistemlerle uyumluluk gösterir.
- Operasyonel Değer: Keşif aşamasındaki mekanistik taramadan, devre düzeyindeki onarımın preklinik doğrulamasına kadar süreklilik sağlar.
- Bilimsel Değer: Yapısal dinamikleri fonksiyonel sinaptik sonuçlarla ilişkilendirerek riskten arındırılmış ilerleme kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, nöral devre modellerinde fonksiyonel analiz sonuçlarından önce meydana gelen yapısal plastisitenin doğrudan gözlemlenmesine olanak tanıyarak erken keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Canlı devrelerde akson dal dalanma dinamiklerini ve sinaptik bölge oluşumunu düzenleyen genlerin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşik etki profilleme için analize hazır, kantitatif morfolojik ve floresan puncta verileri sunar.
- Analitik: Deney koşulları boyunca zaman içindeki dallanma frekansının ve sinaps yoğunluğunun istatistiksel karşılaştırmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Mekanistik bulguları, talamokortikal yolak değişiklikleri içeren nörogelişimsel bozuklukların preklinik modelleriyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli nöral modellerde nöritogenez ve sinaptogenezin çok parametreli değerlendirmesi için yeniden kullanılabilir bir görüntüleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nöral devre kurulumu sırasında yapı-işlev ilişkilerindeki belirsizliği azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Aksonal ve sinaptik dinamiklerin tutarlı, boylamsal takibi için çift kanallı görüntüleme iş akışlarını standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Hedefin yapısal plastisite yollarıyla etkileşimine dair mekanistik kanıtlar sağlayarak devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: İnsanla ilişkili devrelerde akson sinaps eşleşmesi üzerindeki doğrulanmış etkilere dayanarak, hedeflerin riskten arındırılmış şekilde önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Organotipik kokültür bakımı, elektroporasyon ve konfokal mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- Verimli transfeksiyon için steril cerrahi aletlere, mikropipet hazırlığına ve plazmid DNA kalitesine bağımlıdır.
- Dilim canlılığını birden fazla gün boyunca korumak için 37°C'de çevresel kontrol ve serum içeren besiyeri gereklidir.
- Alternatif nöral devrelere adaptasyon, doku uyumluluğunun ve elektroporasyon verimliliğinin doğrulanmasını gerektirir.
- Pratik sınırlamalar arasında transfeksiyon verimliliğindeki değişkenlik ile dallanma ve puncta dinamiklerini nicelendirmek için post-hoc görüntü analizine duyulan ihtiyaç yer alır.
