Aorta-erbezi-mesonephros Explant kültür gelişimsel Hematopoiesis sistemde uygulanması
3 Kasım 2017
Bu iletişim kuralı kültürlü aort-erbezi-Mesonephros ifade analizleri, koloni oluşturan birimlerinde kültür ve dalak ve uzun vadeli sulandırma için düzenleyici faktörler ve sinyal yolları hematopoetik kök üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılmasını açıklar hücre gelişimi. Bu hematopoetik kök hücre biyolojisi ve işlev çalışmak için etkili bir sistem olarak göstermiştir.
Bu deneyin genel amacı, hematopoietik kök hücre gelişiminin kritik düzenleyicilerini araştırmak için bir aorta-gonad-mezonephros eksplant kültürü kullanmaktır. Bu yöntem, memelilerde HSC gelişiminin düzenlenmesinde yer alan faktörlerin nasıl tanımlanacağı ile ilgili HSC biyolojisi ve fonksiyon alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bu düzenleyicilerin DNA ekspresyon analizi ve HSC'nin koloni oluşturma yeteneği ve sulandırma kapasitesi yoluyla doğrulanabilmesidir.
Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü AGM'nin gövde bölgesindeki çevre dokulardan hassas bir şekilde ayrılması, ustalaşmak için pratik gerektirir. Prosedüre başlamadan önce, paslanmaz çelik ağları, oyuk başına iki mililitre taze hazırlanmış fluoksetin takviyeli ortam içeren altı oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına yerleştirin. Deney kuyucuğu başına bir UV ile sterilize edilmiş 0.65 mikrolitrelik filtreyi, iki üç dakikalık yıkama için taze kaynar su içeren bir cam hücre kültürü kabına yerleştirin ve filtreleri her yıkamadan sonra iki dakika boyunca oda sıcaklığında bir PBS kabına daldırın.
Ardından, her bir kuyucuğun hava-sıvı arayüzündeki her bir çelik ağa bir filtre yerleştirin. Daha sonra, embriyonik gün-11 hamile bir fareden uterusu çıkarmak için diseksiyon makasını kullanın ve embriyoları uterustan toplayın. Diseksiyon makası kullanarak yumurta sarısı kesesini, göbek kordonunu ve iç organları embriyo gövdesinden çıkarın.
Ve dorsal sinir dokularını ve çevresindeki kas dokularını dikkatlice çıkarın. Forseps kullanarak dokuları ön ve arka bacaklardan çıkarın. Ve AGM bölgesini embriyo gövdesinden ayırın.
Ardından her bir AGM'yi her bir kuyucuğun hava-sıvı arayüzündeki tek bir filtreye yerleştirin. Kültürleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin. İki ila üç gün sonra, AGM numunelerini, her beş dakikada bir çalkalayarak yaklaşık 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede ayrışmaları için 200 mikrolitre kollajenaz içeren 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
Sindirimin sonunda, eksplant başına 200 mikrolitre serum ile reaksiyonları durdurun. Her bir tüpün tüm içeriğini, kuyu başına 500 ila 600 mikrolitre M3434 ortamı içeren 24 oyuklu ultra düşük bir bağlantı plakasının ayrı kuyucuklarına aktarın. Her bir oyuktaki hücreleri iğnesiz bir mililitrelik şırınga ile karıştırın.
Plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Her bir kuyucuk içindeki koloni oluşturan birimlerin sayısı daha sonra yedi ila 10 günlük kültürden sonra puanlanabilir. İn vivo için, az önce gösterildiği gibi, iki ila üç günlük AGM kültüründen sonra AGM eksplant transplantasyonu, sekiz ila 10 haftalık erkek C57 siyah altı fareyi dokuz gri radyasyonla ölümcül şekilde yok edin.
Dört ila beş saat sonra, hasat edilen eksplantları gösterildiği gibi numune başına 200 mikrolitre kollajenaz içinde ayırın. Elde edilen tek hücreli süspansiyonların 0.5 ila bir embriyo eşdeğerini, alıcı hayvan başına bir mililitrelik şırıngaya yükleyin. İlk ışınlanmış fareyi bir tutucuya yerleştirin ve kuyruk damarı vazodilatasyonunu desteklemek için kuyruğu %75 etanolle ıslatılmış bir pamuklu çubukla silin.
Bir şırınganın tüm içeriğini intravenöz olarak genişlemiş bir kuyruk damarına enjekte edin. İğneyi çıkardıktan sonra kanamayı durdurmak için antiseptik bir bez kullanın. Sonra hayvanı kafesine geri koyun ve bir sonraki hayvana enjekte edin.
Evlat edinme transferinden 11 gün sonra, dalaklar, görünür dalak kolonilerinin makroskopik sayımı için Bouin solüsyonunda sabitlenebilir. Fluoksetin takviyeli AGM kültürleri, mRNA ve protein ekspresyon seviyelerinde HSC gelişimi için çok önemli bir gen olan Runx1'in artan bir ekspresyonunu gösterir. Fluoksetin ayrıca patlama oluşturan birim eritroidler, koloni oluşturan birim granüler monositler ve koloni oluşturan birim granülositler, eritrositler, makrofajlar ve megakaryositler dahil olmak üzere AGM'de HSC'nin koloni oluşturma yeteneğini önemli ölçüde artırabilir.
Ayrıca, AGM eksplantlarından izole edilen fluoksetin ile muamele edilmiş HSC'nin in vivo transplantasyonu, ışınlanmış yetişkin alıcı hayvanların dalaklarında koloni sayısının artmasına neden olur. Bu videoyu izledikten sonra, AGM'yi nasıl izole edeceğinizi ve AGM içindeki HSC gelişiminin kritik düzenleyicilerinin tanımlanması için bir AGM ekstrüzyon kültürünün nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hematopoetik kök hücre (HSC) gelişimini incelemek için kültürlenmiş Aorta-Gonad-Mezonefros (AGM) bölgesinin ekspresyon analizleri ve koloni oluşturucu birimler için kullanımını tanımlamaktadır. Bu yöntem, HSC biyolojisinde yer alan düzenleyici faktörlerin ve sinyal yolaklarının araştırılması için etkili bir sistemdir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hematopoetik kök hücre biyolojisi
- Hücre kültürü teknikleri
- Gelişimdeki düzenleyici faktörler
Arka Plan
- AGM bölgesi, memelilerde HSC gelişimi için kritik öneme sahiptir.
- HSC düzenlemesinin anlaşılması, rejeneratif tıpta ilerlemeler sağlayabilir.
- Koloni oluşturma deneyleri, HSC fonksiyonelliğinin değerlendirilmesi için gereklidir.
- AGM'nin çevre dokulardan ayrılması, beceri ve pratik gerektirir.
Çalışmanın Amacı
- HSC gelişiminin kritik regülatörlerini araştırmak.
- HSC regülasyonunda rol oynayan faktörleri belirlemek.
- HSC biyolojisi ve fonksiyonuna dair anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- AGM eksplant kültür teknikleri.
- Düzenleyici faktör doğrulaması için DNA ekspresyon analizi.
- HSC kapasitesini değerlendirmek için koloni oluşum analizleri.
- Uzun süreli rekonstitüsyon çalışmaları.
Temel Sonuçlar
- HSC gelişimini etkileyen temel düzenleyici faktörlerin belirlenmesi.
- DNA ekspresyon analizi yoluyla faktörlerin doğrulanması.
- Kültürlenmiş HSC'lerde koloni oluşturma yeteneğinin başarılı bir şekilde gösterilmesi.
- HSC biyolojisinde rol oynayan sinyal yollarına ilişkin içgörüler.
Sonuçlar
- AGM kültür sistemi, HSC gelişimini incelemek için etkilidir.
- Düzenleyici faktörlerin anlaşılması, terapötik stratejilere ışık tutabilir.
- Bu yöntem, hematopoez alanındaki gelecek araştırmalar için bir platform sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
AGM eksplant kültür sistemi, germ hattı nakavt modellerine ihtiyaç duymadan mekanistik çalışmalara olanak tanıyarak hematopoetik kök hücre (HSC) araştırmalarındaki temel bir darboğazı gidermektedir. Bu yaklaşım, fizyolojik olarak ilgili bir embriyonik niş içerisinde farmakolojik veya genetik kurtarma deneylerine izin vererek erken keşif aşamasındaki hedef doğrulama ve risk azaltma süreçlerini destekler. HSC gelişiminin kritik düzenleyicilerinin belirlenmesinde öngörücü güveni artırarak, hematopoez odaklı terapötik alanlardaki portföy kararlarına temel oluşturur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: KO arka planlarında kurtarma deneyleri aracılığıyla faktörlerin HSC regülasyonundaki rolünü test ederek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: DNA ekspresyon değişikliklerini ve koloni oluşumu gibi fonksiyonel çıktıları doğrulamak için tekrarlanabilir bir sistem sağlayarak, maliyetli in vivo modellere olan bağımlılığı azaltır.
- Öngörücü Değer: Moleküler perturbasyonları, yeniden yapılandırma kapasitesi gibi fonksiyonel HSC çıktılarıyla ilişkilendirerek mekanistik risklerin azaltılmasını destekler.
Tarama & Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Bileşiklerin HSC farklılaşması üzerindeki etkilerini değerlendirmek için CFU-E, CFU-GM ve megakaryosit kolonilerini içeren kantitatif, çok hücreli okumalar üretir.
- Operasyonel Değer: 7–10 gün sonra koloni oluşturan birim skorlaması aracılığıyla HSC fonksiyonel değerlendirmesini standartlaştırarak, analizlerin bileşik kütüphaneleri genelinde ölçeklendirilebilirliğini sağlar.
- Translasyonel Değer: Valide edilmiş HSC popülasyonlarını sonraki transplantasyon çalışmaları için hazırlayarak, keşif aşaması ile preklinik validasyon arasında köprü kurar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Embriyonik hematopoetik nişi koruyarak hastalıkla olan ilişkisini sürdürür ve memeli HSC gelişim mekanizmalarının incelenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Işınlanmış alıcılarda rekonstitüsyon potansiyeli kanıtlanmış, nakledilebilir HSC'ler üreterek keşif aşamasından preklinik çalışmalara geçişte sürekliliği destekler.
- Risk Azaltma: Maliyetli in vivo çalışmalar öncesinde hedeflerin fonksiyonel validasyonunu sağlayarak, devam/durdur karar güvenini artırır.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
AGM eksplant kültürü, özellikle hematopoiez ve rejeneratif tıp programları için, hedef belirlemeden aday optimizasyonuna ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: HSC ortaya çıkışını ve genişlemesini etkileyen sinyal yollarının ve transkripsiyonel düzenleyicilerin hipotez testlerini kolaylaştırır.
- Tarama: Doz-yanıt analizini ve hit onayını destekleyen kantitatif, floresans veya mikroskopi tabanlı koloni çıktıları sağlar.
- Analitik: mRNA/protein ekspresyonu (örneğin, Runx1), koloni morfolojisi ve in vivo repopülasyon birimleri aracılığıyla çok parametreli değerlendirmeye olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Rekabetçi transplantasyon modellerinde kanıtlanmış uzun süreli rekonstitüsyon aracılığıyla mekanistik bulguları preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kök hücre ve kan bozuklukları terapötik alanlarındaki birden fazla projede iteratif hedef doğrulaması için yeniden kullanılabilir bir platform görevi görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Moleküler müdahaleleri, gelişimsel olarak doğru bir sistemdeki fonksiyonel HSC fenotipleriyle ilişkilendirerek hedef güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış eksplant izolasyonu, kültürü ve disosiyasyon protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği artırır ve fonksiyonel analizlerdeki değişkenliği azaltır.
- Stratejik Değer: HSC hedeflerinin erken aşamada risk analizini mümkün kılarak sermaye verimliliğini artırır ve mekanistik içgörü eksikliğinden kaynaklanan geç aşama başarısızlıklarını minimize eder.
- Portföy Etkisi: Hedef sıralaması için HSC kendini yenileme ve farklılaşma kapasitesine ilişkin fonksiyonel veriler sağlayarak riskle uyumlu önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Çevre dokulardan kontaminasyon olmadan AGM bölgesini izole etmek için embriyonik diseksiyon ve mikrocerrahi tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- CO2 inkübatörleri, düşük yapışmalı plakalar ve besiyeri ile reaktifler için steril filtrasyon dahil olmak üzere steril hücre kültürü altyapısına bağımlıdır.
- Verilerin karşılaştırılabilirliğini sağlamak için eksplant yerleşimi, kollagenaz sindirim süresi ve koloni puanlama kriterleri konusunda ekipler arasında standardizasyon gereklidir.
- Murin olmayan modellere adaptasyon, türe özgü embriyonik zamanlama ve doku erişilebilirliği ile sınırlı olabilir ve her sistemde doğrulama gerektirir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, AGM izolasyonu için dar embriyonik pencere (farelerde E10.5–E11.5) yer alır ve bu durum keşif kampanyalarındaki işlem hacmini ve zamanlamayı etkiler.
