Name: Aorta-erbezi-mesonephros Explant kültür gelişimsel Hematopoiesis sistemde uygulanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Keşfedin hematopoietik kök hücre gelişiminin kritik düzenleyicilerini AGM eksplant kültürü kullanarak. Bu yöntem DNA ekspresyon analizi ve koloni oluşum yeteneği ile düzenleyicileri doğrulamaya olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Suwei Gao şekil hazırlık yardım için teşekkür ederim. Bu eser hibe Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81530004, 31425016) ve Bilim Bakanlığı ve Çin teknoloji (2016YFA0100500) tarafından desteklenmiştir. JL deneyler gerçekleştirilen ve el yazması hazırlanan; Tayback el yazması düzenlenmiş. Her iki yazar okuyun ve son el yazması onayladı.

hayvan konular da dahil olmak üzere tüm yordamları zooloji Enstitüsü, Çin Bilimler Akademisi, Pekin, Çin için etik Değerlendirme Komitesi tarafından onaylanmış olan.
 1. malzeme hazırlık <ol><li>Sterilize 0.65 µm filtreleriyle ultraviyole ışınları ultraviyole altında üretilen ışın 4 h için temiz bankta lamba ve 2 h işaretinden sonra filtreleri teslim. 
	Not: UV ışık ile çalışırken, uygun koruma giymek.</li>
	<li>Paslanmaz çelik kafesler 30 ortaçağ halk ozanı için 121 ° C'de otoklav ısıtıcı ile sterilize. 
	Not: Paslanmaz çelik kafes belli bir yükseklikten hava-sıvı arabirimindeki filtreler desteklemek için gereklidir ve bu telin üstünde çelik kafes ( şekil 1 A) ile gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Seyreltik fluoksetin 10 µM son bir konsantrasyonu uzun vadeli M5300 içine kültür orta ve karışımı eşit. 
	Not: altı-şey plaka için 2 mL M5300 uzun vadeli kültür her şey için uygun ortamdır. Hidrokortizon 10 -6 M, seçmeli olarak orta seyreltilmiş.</li>
	<li>Altı-şey plakaları veya yemekleri 10 µM fluoksetin ile desteklenmiş orta aktarmak ve sterilize edilmiş paslanmaz çelik kafesler orta koydu.</li>
	<li>Cam hücre kültür tabağına sterilizasyon için her zaman iki kez 3 dakika için 0,65 µm filtreleri kaynar su ile yıkayın. Sonra şekil 1 içinde A [şematik gösterildiği gibi ayakta vasıl hava-sıvı arayüzey filtreleri tamponlanmış fosfat tuz koymak her yıkama, (PBS) için 2 ortaçağ halk ozanı ve yer ıslak paslanmaz çelik filtre kafesleri Merkezi]. 
	Not: kaynar su asepsis elde etmek otoklav ısıtıcı ile oluşturulabilir ve ekipman alınmalıdır otoklav Sterilizatör zamanında dışarı sıcaklık düşüş önlemek için.</li>
</ol> 2. AGM kültür Explant <ol><li>dikkatle E10.5 veya E11 embriyo Forseps ile gelen AGM bölgeleri ayırmak.
	<ol><li>Hamile fareler gelen rahim diseksiyon makası ile şerit ve embriyoların rahim ayırmak.</li>
		<li>Sarısı sac, göbek kordonu ve iç organlar embriyo vücuttan yok etmek.</li>
		<li>Dorsal sinir doku ve kas çevre dokular dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
		<li>Kesim sitesinde ön ve arka bacaklarda Forseps ile belgili tanımlık doku kapalı ve AGM bölge embriyo vücudundan ayırmak. rakamlar 1 ABC göstermek şematik gösterim ve morfolojisi disseke AGM.</li>
	</ol></li> <li>Disseke AGMs filtreleri, hava-sıvı arayüzey ( şekil 1 A) ve kültür olarak 37 ° C'de % 5 CO 2 ayrı ayrı üzerine 2-3 gün boyunca explant. 
	Not: Disseke AGM çelik Kafes Tel üzerine yerleştirin ve filtreleri hava-sıvı arayüzey kültür sırasında olduğundan emin olun. AGM yanı sıra sarısı sac ve fetal karaciğer de bu sistem 7 ile kültürlü.</li>
</ol> 3. İfade analizleri <ol><li>mRNA düzeyi <ol><li>1 mL PBS içine kültürlü AGMs toplamak ve 4 ° c, 310 x g 6 dakika süreyle santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Süpernatant kaldırdıktan sonra toplam RNA fenol, monophasic çözeltisi ile toplanan AGMs üreticiye göre çıkarılan &#39; s yönergeleri.</li>
		<li>Toplam RNA (2 µg) sonra geriye doğru M-MLV transkriptaz cDNA şablon olarak elde etmek için kullanarak transkripsiyonu. Nicel gerçek zamanlı PCR deneyleri SYBR yeşil ile gerçekleştirilir ve Gapdh iç kontrol kullanılır.</li>
	</ol></li> <li>Protein seviyesi <ol><li>yukarıda 3.1.1. adımda açıklandığı gibi kültürlü AGM toplamak.</li>
		<li>Protein hücre lizis arabelleği ile kültürlü AGM üzerinden hazırlamak (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl ve % 0,5 NP-40) proteaz inhibitörü ve protein seviyesi daha önce tespit etmek için Batı kurutma için kullanım içeren açıklanan 13.</li>
	</ol></li></ol> 4. Koloni oluşturan birimler kültür (CFU-C) tahlil <ol><li>2-3 gün sonra kültür, 1 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ve 4 ° c, 310 x g 6 dakika santrifüj AGM bölgelere toplamak ve 200 µL collagenase (PBS %0,1) 37 ile ayırmak ° C. 
	Not: yaklaşık 20 dakika collagenase tek hücre-süspansiyonlar oluşturmak gerekli zamanı geldi. AGM içeren tüp sallayarak her 5 ortaçağ halk ozanı sindirim süreci hızlandırabilir. 200 µL % 0,1 collagenase her AGM için kullanılır ve 200 µL % 10 serum reaksiyonu durdurmak için kullanılır.</li>
	<li>Tek hücre-süspansiyonlar Ultra düşük ek 24-şey plakaları M3434 ortamda kültür. 
	Not: kirlenmesini önlemek için penisilin-streptomisin çözüm seçerek orta eklenebilir. M3434 orta yapışkan olduğundan, 1.0 cc enjektör iğne olmadan bu hücreleri ve orta karıştırmak için kullanılan.</li>
	<li>Sonra 7 - 10 gün kültür 37 ° C % 5 CO 2, koloniler eritrosit, makrofaj, megakaryocyte (CFU-et) birimi--erythroid (BFU-E), CFU-granulo-monosit (CFU-GM) ve CFU-granülosit, şekillendirme patlama da dahil olmak üzere her tür sayısı ayırt edici morfolojisi dayalı ve ters bir mikroskopla ( Şekil 2 C) attı mı.</li>
</ol> 5. Vivo Nakli tahlil explant kültürü, <ol><li>koloni oluşturan birimler-dalak (CFU-S) tahlil <ol><li>sonra 2 - 3 gün AGMs toplamak ve 200 µL collagenase (PBS %0,1) 20 ile kuluçka tarafından tek hücre süspansiyonlar hazırlamak min.</li>
		<li>Ölümcül ışınlama (röntgen 9 Gy) 8 - 10 - hafta yaşlı erkek C57BL/6 farelerin gerçekleştirmek 4-5 h hücre enjeksiyon önce.</li>
		<li>Radyoaktif fare faaliyetini kısıtlamak için bir restrainer koymak.</li>
		<li>Kapakların damarın tanıtmak için %75 alkol dolu bir pamuklu çubukla kullanarak kuyruk yok.</li>
		<li>Enjekte 0.5 embriyo eşdeğer (ee) veya 1 ee tek hücre-süspansiyonlar AGM, intravenöz radyasyonlu fare kuyruğu damar içine 1.0 cc şırıngayla. 
		Not: Hücreleri PBS ile askıya alınır ve alıcı başına 0.5 mL PBS uygun bir birimdir. Bir iğne 25 ölçer veya 26 ölçer boyutunun 1.0 cc şırıngayla enjeksiyon için kullanılır. Hava şırınga tanıttı olabilir. Kanamayı durdurmak için antiseptik bir bez ile enjeksiyon izi basın.</li>
		<li>On bir gün ekimi, ödemeli posta ve alıcı farelerin dalağı Bouin içinde düzeltmek &#39; 1-2 gün ve başka bir 1-2 gün için % 80 alkol ile yıkama için s çözüm (15 mL doymuş %1.22 Pikrik asit sulu çözüm, 2 mL % 40 metanol ve 1 mL Asetik asit). Dalak görünür kolonilerde macroscopically saymak ve koloniler ee başına sayısını belirleyen. 
		&#8203; Not: Bouin &#39; s sabitleştirici, giyim uygun koruma.</li>
	</ol></li> <li>Uzun vadeli nakli tahlil <ol><li>sonra 2-3 gün kültür explant, AGMs toplamak ve 20 dakika süreyle 200 µL collagenase (PBS %0,1) ile kuluçka tarafından tek hücre süspansiyonlar hazırlamak</li>
		<li>8 - 10 - hafta yaşlı erkek C57BL/6 fare öldürücü ışınlama (x-ray 9 Gy) 4-5 gönderilen hücre enjeksiyon önce gerçekleştirmek.</li>
		<li>Radyoaktif fare faaliyetini kısıtlamak için bir restrainer koymak.</li>
		<li>Kapakların damarın tanıtmak için %75 alkol dolu bir pamuklu çubukla kullanarak kuyruk yok.</li>
		< lBen > 0.5 embriyo eşdeğer (ee) enjekte veya 1 ee tek hücre-süspansiyonlar intravenöz ışınlanmış bir fare kuyruğu ven içine, AGM 1.0 cc şırıngayla. AGM bir doz 2 × 10 5 kemik iliği hücreleri (CD45.1 arka plan) ile alıcı başına 1 ee adlı enjekte. 
		Not: Hava şırınga tanıttı olabilir. Kanamayı durdurmak için antiseptik bir bez ile enjeksiyon izi basın.</li>
		<li>Dört ay sonrası nakli, kemik iliği alıcının toplamak ve FACS tarafından sulandırma tahlil için kullanabilirsiniz. Yalnızca alıcıları ile &#8805; % 10 chimerism donör elde edilen başarılı sulandırma sergilemek olarak kabul edilir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., Robin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+founder+of+adult+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta.</a> Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).</li>
<li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).</li>
<li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells+long-term+repopulating+units+%28HSC%2FRUs%29%3A+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+%28AGM%29+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129, 4891-4899 (2002).</li>
<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86, 897-906 (1996).</li>
<li>Peeters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+embryonic+tissues+and+Hedgehog+proteins+induce+early+AGM+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development.</a> Development. 136, 2613-2621 (2009).</li>
<li>Taoudi, S., Medvinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+in+the+ventral+domain+of+the+embryonic+dorsal+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta.</a> PNAS. 104, 9399-9403 (2007).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+Hedgehog+Regulate+Distinct+AGM+Hematopoietic+Stem+Cells+Ex+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo.</a> Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).</li>
<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stromal+clones+reveal+developmental+regulators+of+definitive+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells.</a> PNAS. 104, 20838-20843 (2007).</li>
<li>Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mpl+receptor+defect+leads+to+earlier+appearance+of+hematopoietic+cells%2Fhematopoietic+stem+cells+in+the+Aorta-Gonad-Mesonephros+region%2C+with+increased+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis.</a> Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).</li>
<li>Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxytryptamine+synthesized+in+the+aorta-gonad-mesonephros+regulates+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival.</a> J Exp Med. 214, 529-545 (2017).</li>
<li>Souilhol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+interactions+mediated+by+interplay+of+asymmetric+signalling+underlie+development+of+adult+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells.</a> Nature communications. 7, 10784(2016).</li>
<li>Fitch, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).</li>
<li>Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+swimming+test+and+fluoxetine+treatment%3A+in+vivo+evidence+that+peripheral+5-HT+in+rat+platelet-rich+plasma+mirrors+cerebral+extracellular+5-HT+levels%2C+whilst+5-HT+in+isolated+platelets+mirrors+neuronal+5-HT+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes.</a> Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).</li>
<li>Ortiz, J., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+monoamine+uptake+inhibitors+on+extracellular+and+platelet+5-hydroxytryptamine+in+rat+blood%3A+different+effects+of+clomipramine+and+fluoxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine.</a> Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).</li>
<li>Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+inhibitor+of+serotonin+uptake%3A+Lilly+110140%2C+3-%28p-trifluoromethylphenoxy%29-N-methyl-3-phenylpropylamine%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine.</a> Life sciences. 15, 471-479 (1974).</li>
<li>Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+is+required+for+the+endothelial+to+haematopoietic+cell+transition+but+not+thereafter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter.</a> Nature. 457, 887-891 (2009).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+together+the+organoid+field%3A+from+early+beginnings+to+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead.</a> Development. 144, 963-967 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çakışan mali ilgi alanlarına sahip.

İyi olgun HSCs kemik iliğinde kan sistemi radyasyonlu alıcılarının yeniden doldurabilir bilinmektedir. Bu işlev HSCs farklı olarak, fare embriyo AGM içinde ortaya çıkan HSCs olgunlaşmamış. Doğrudan nakli sonuçlar gösterdi bu tür ben (VE-cad+ CD45- CD41+) ve tip II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs sahip hiçbir sulandırma yeteneği20. AGM explant kültür sistemi, AGM bölgedeki doğmakta olan HSCs yararlanarak alıcıları ekimi tahlil4...

Hematopoetik kök hücre (HSCs) erythroid, myeloid, dahil olmak üzere multilineage potansiyel ve lenfoid hücrelerin yanı sıra kendi kendini yenileme yeteneği sahip doku özgü erişkin kök hücreleri vardır. Erken HSCs hemogenic endotel (HE), bilinen bir popülasyondan özel endotel, endotel dorsal aort1,2 ventral duvar, hematopoetik geçiş (EHT) aracılığıyla ortaya çıkan son çalışmalar göstermiştir ,3,4. Aort-erbezi-mesonephros (AGM) bölgede embriyonik (E) 10,5 dan E12.5 için fare embriyo oluşan bir kez HSCs fetal karaciğer için genişleme içine göç ve son olarak bir kişinin hayatı boyunca yetişkin hematopoiesis korumak için kemik iliği kolonize 5 , 6. her ne kadar bu uzun yıllar boyunca inceledi, HSC ortaya çıkması ve geliştirme temel mekanizmaları tam olarak anlaşılır kalır.
Vitro fertilizasyon ve Zebra balığı embriyo gelişimi, intrauterin fare embriyo gelişimi sırasında embriyogenez kesin hematopoiesis çalışma çok daha rahatsız edici yapar. Belirli KO fareler eksikliği de hudut onların kullanma-hematopoetik araştırma alanındaki her ne kadar genetik deneyler nakavt (KO) fare kullanarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, in vivo kurtarma denemeleri kolayca KO fareler gerçekleştirilemiyor. 1996 yılından bu yana, AGM explant kültür hematopoetik çalışmaları için alan7öncüleri tarafından geliştirilmiştir. Bu kültür sistemi sayesinde, AGM bölge ventral dokuların bir ters etkisi8,9dorsal doku uygulamayın iken HSC etkinlik, tanıtmak için tespit edilmiştir. AGM explant kültür sistemi aynı zamanda Serotonin, Mpl, SCF, BMP ve kirpi HSC geliştirme10,11,12,13, sinyal rolleri belirlemek için uygulanan 14. önemli, bu da mutant embriyo13,15dakika sonra hematopoetik kusurları kurtarmak için kullanılan popüler bir yöntemdir.

<table><tbody><tr><td>Durapore 0.65 ve mikro; m filtreler</td><td>Millipore R5BA63787</td><td></td><td>AGM eksplant kültürü</td></tr><tr><td>M5300 uzun süreli kültür ortamı</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5300</td><td>AGM eksplant kültürü</td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Tiangen</td><td>5829</td><td>RNA ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>M-MLV ters transkriptaz</td><td>Promega</td><td>90694</td><td>ters transkripsiyon</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>A6002</td><td>kantitatif gerçek zamanlı PCR</td></tr><tr><td>proteaz inhibitörü</td><td>Roche</td><td>55622</td><td>Protein ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>kollajenaz</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>AGM dokularının sindirimi</td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 orta</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>3434</td><td>CFU-C testi</td></tr><tr><td>ultra düşük bağlantı 24 kuyulu plakalar</td><td>Costar</td><td>3473</td><td>CFU-C testi</td></tr><tr><td>C57BL / 6 CD45.2 fareler</td><td>Pekin HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>CFU-S testi</td></tr><tr><td>C57BL / 6 CD45.1 fareler</td><td>Pekin HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>Uzun süreli transplantasyon</td></tr><tr><td>fosfat tamponlu salin</td><td>Life Technologines</td><td>8115284</td><td>AGM Koleksiyonu</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin çözeltisi</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>AGM eksplant kültürü</td></tr><tr><td>anti-CD45.2-PE-CY7</td><td>eBioscience</td><td>25-0454-80</td><td>Uzun süreli transplantasyon</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>Uzun süreli transplantasyon</td></tr><tr><td>UV lambası</td><td>Pekin jiangmorning yuan biyo-teknoloji co., LTD</td><td>039-14402</td><td>Güç: 30W</td></tr><tr><td>paslanmaz çelik hasır</td><td>AS ONE SHANGHAI Corporation</td><td>2-9817-10 & nbsp;</td><td>Açıklık çapı: 2,5 mm</td></tr><tr><td>hidrokortizon</td><td>Sigma</td><td>H0396</td>, <td>seçici olarak M5300 ortamına seyreltilmiş</td></tr></tbody></table>

aorta-erbezi-mesonephros explant kültür gelişimsel hematopoiesis sistemde uygulanması

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

Hematopoiesis çalışmalar için fare embriyo kullanarak sınırlama operasyonlarında, hangi büyük ölçüde embriyo intrauterin gelişme nedeniyle eklenen rahatsızlık 's. Nakavt (KO) fareler genetik verileri ikna edici rağmen KO fareler tüm genler için gerektiği gibi oluşturmak için gerçekçi değildir. Ayrıca, in vivo gerçekleştirme KO fareler elde edilen verileri birleştirmek için kurtarma deneyler değil uygun. Bu sınırlamalarını aşmak için aort-erbezi-Mesonephros (AGM) explant kültür hematopoetik kök hücre (HSC) geliştirme eğitim için uygun bir sistem olarak geliştirilmiştir. Özellikle kurtarma denemeleri için bu KO farelerde Engelli hematopoiesis kurtarmak için kullanılabilir. Uygun kimyasallar orta ekleyerek, Engelli sinyal yeniden etkinleştirilebilir veya yukarı düzenlenir yolları inhibe olabilir. Bu yöntemin kullanılması, birçok deney HSC gelişiminin kritik düzenleyiciler tanımlamak için gerçekleştirilen, HSC gen ekspresyonu mRNA ve protein düzeyleri, koloni oluşumu yeteneği ve sulandırma kapasitesi ile ilgili. Bu dizi deney memelilerde HSC gelişimi için gerekli temel mekanizmaları tanımlamada yardımcı olabilir.

Son yayın AGM13' te pro-apoptotik yolu engelleyerek endotel hücre kaynaklı serotonin HSCs yaşama teşvik bildirdi. HSC geliştirme teşvik etkisi serotonin onaylamak için fluoksetin dahil edildi. Bir selektif serotonin re-uptake inhibitörü olarak (SSRI), fluoksetin serotonin yeniden emme periferik dokulara16,17,18etkisizleştirmek için kanıtlanmıştır. AGM kullanarak explant kü...

Bu iletişim kuralı kültürlü aort-erbezi-Mesonephros ifade analizleri, koloni oluşturan birimlerinde kültür ve dalak ve uzun vadeli sulandırma için düzenleyici faktörler ve sinyal yolları hematopoetik kök üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılmasını açıklar hücre gelişimi. Bu hematopoetik kök hücre biyolojisi ve işlev çalışmak için etkili bir sistem olarak göstermiştir.

Aorta-erbezi-mesonephros Explant kültür gelişimsel Hematopoiesis sistemde uygulanması

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Bu deneyin genel amacı, hematopoietik kök hücre gelişiminin kritik düzenleyicilerini araştırmak için bir aorta-gonad-mezonephros eksplant kültürü kullanmaktır. Bu yöntem, memelilerde HSC gelişiminin düzenlenmesinde yer alan faktörlerin nasıl tanımlanacağı ile ilgili HSC biyolojisi ve fonksiyon alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bu düzenleyicilerin DNA ekspresyon analizi ve HSC'nin koloni oluşturma yeteneği ve sulandırma kapasitesi yoluyla doğrulanabilmesidir.Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü AGM'nin gövde bölgesindeki çevre dokulardan hassas bir şekilde ayrılması, ustalaşmak için pratik gerektirir. Prosedüre başlamadan önce, paslanmaz çelik ağları, oyuk başına iki mililitre taze hazırlanmış fluoksetin takviyeli ortam içeren altı oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına yerleştirin. Deney kuyucuğu başına bir UV ile sterilize edilmiş 0.65 mikrolitrelik filtreyi, iki üç dakikalık yıkama için taze kaynar su içeren bir cam hücre kültürü kabına yerleştirin ve filtreleri her yıkamadan sonra iki dakika boyunca oda sıcaklığında bir PBS kabına daldırın.Ardından, her bir kuyucuğun hava-sıvı arayüzündeki her

application-aorta-gonad-mesonephros-explant-culture-system

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

mStrawberry OP9 hücreleri ko-kültür tüm ES-türetilen döl tam değerlendirme için izin verir.

Modifiye ES / OP9 Co-Kültür Protokolü Hematopoetik Döl Geliştirilmiş Karakterizasyonu sağlar.

Hematopoez için 3D kültür sistemi, insan kordon kanı ve lösemiye kemik iliği hücreleri kullanılarak anlatılmıştır. Metodu hücre dışı matris proteinlerine ile kaplanmış bir emici sentetik poliüretan iskele kullanımına dayanmaktadır. Bu yapı iskelesi hücreleri geniş bir uyum sağlamak için uyarlanabilir.

Normal ve Anormal İnsan Hematopoezin ex vivo Mimicry

Bu protokol, fare embriyonik tiroid anlajeninin diseksiyonunu ve eksplantların yarı gözenekli filtreler veya mikroskopi plastik slaytlar üzerinde kültürünü tanımlar. Bu sistem, vahşi tip veya nakavt embriyoların tiroid gelişimi sırasında meydana gelen morfogenetik veya farklılaşma olaylarını incelemek için idealdir ve fonksiyon kazancı ve kaybı deneylerine uygundur.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kültür Sistemi Tiroid Geliştirme Çalışması

Ex vivo dik damlacık kültürü, mevcut in vitro ve in vivo deneysel tekniklere bir alternatiftir. Bu protokolün uygulanması kolaydır ve daha az miktarda reaktif gerektirirken, fetal vaskülarizasyon, morfogenez ve organogenezi manipüle etme ve inceleme yeteneğine izin verir.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Bu protokol, fare embriyolarından metanefrik temelleri izole etmek ve kültürlemek için bir yöntem açıklamaktadır.

Fare Embriyonik Böbreklerinin Diseksiyonu ve Kültürü

Vivo klonal analizi ve kader eşleme, aortik explants ve izole düz kas hücreleri ayrıntılı burada kullanarak embriyonik ve perinatal fare aort eğitim için kullanılan protokol. Bu farklı yaklaşımlar normal gelişim embriyonik ve perinatal aort ve hastalık patogenezinde morfogenez incelenmesi kolaylaştırmak.

Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma

Burada fare embriyonik gelişim sırasında hematopoetik kök hücre öncüleri klonal analizi için metodoloji mevcut. Endotel hücre ortak kültür ve fenotipik özellikleri ve tek hematopoetik öncüleri potansiyelini engraftment karakterize nakli ile embriyonik aort-erbezi-mesonephros bölgesinden tek hücre dizin sıralama birleştirin.

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

Bu makalede klasik bıldırcın-tavuk chimera sistemin roman vitro ve ovo içinde deneysel prosedürler birleştirerek organ oluşumu, çalışma Güncellenme Zamanı bir yaklaşım sağlar.

İlk - ve geç-aşamalarında Organ oluşumu kuş modelindeki keşfetmek için iki adımlı yaklaşım: timus ve paratiroid bezleri Organogenesis paradigma

Bu çalışma, organ gelişimini incelemek için iki yöntem, kültürlü embriyonik organ ve organoidlerin vaskülarizasyonuna olanak sağlayan kuş embriyolarından koryoallantoik membran (CAM) üzerine geliştirilmiş bir ksinotransplantasyon kurulumu ve yeni bir sabit z-yönü yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı konfokal görüntüleme sağlayan modifiye deneysel koşulları ile organ kültürü yöntemi.

Vaskülarizasyon, Uzatılmış Gelişim ve Geliştirilmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu

Burada primer neonatal murine testis hücrelerinden testis organoidi üretmek için dört yöntem tanımlanmıştır. Bu teknikler birden fazla araştırma uygulamasına sahiptir ve özellikle testis gelişimi ve fizyolojisi in vitro eğitimi için yararlıdır.

Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi

Burada, hasarlı bir hematopoietik ve bağışıklık sisteminin yeniden inşası için terapötik hematopoietik kök/progenitör hücreleri hasat etmek için kemik morfogenetik protein-2 yüklü jelatin iskeleler tarafından tetiklenen in vivo osteo-organoidler kurduk. Genel olarak, bu yaklaşım hücre tedavileri için umut verici bir hücre kaynağı sağlayabilir.

Terapötik Hematopoietik Kök/Progenitör Hücrelerin Toplanması için İn Vivo Osteo-organoid Yaklaşım

Keşfedin hematopoietik kök hücre gelişiminin kritik düzenleyicilerini AGM eksplant kültürü kullanarak. Bu yöntem DNA ekspresyon analizi ve koloni oluşum yeteneği ile düzenleyicileri doğrulamaya olanak tanır.

Aorta-erbezi-mesonephros Explant kültür gelişimsel Hematopoiesis sistemde uygulanması

Daha fazla video keşfet