3D mitokondriyal Ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas seri-bölüm elektron tomografi tarafından ortaya

Bu videonun genel amacı, Drosophila dolaylı uçuş kasının mitokondriyal üst yapısını incelemek için seri kesitli elektron tomografisinin uygulamasını belirlemektir. Bu yöntem, yapı ve mitokondri ile işlevsel ilişki gibi yapı hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücresel üst yapının üç boyutlu olarak ortaya çıkmasıdır.

Deneye başlamak için, beş Drosophola örneğini buz üzerinde uyuşturun ve her bir sineği fosfat tamponunda bir mililitre% 4 düşük erime agarozuna batırın. Agarozun buz üzerinde katılaşmasına izin verin. Ardından, agaroz jele gömülü Drosopola'yı 100 mikrometre kalınlığında dilimler halinde bölümlere ayırmak için titreşimli bir bıçak mikrotomu kullanın.

Dilimleri, sıfır noktası bir molar fosfat tamponunda% 2.5 glutaraldehit içeren fiksatif çözeltiye daldırın. Doku bölümlerini üç damla fosfat tamponunda yıkayın, ardından %20 BSA içeren iki damla fosfat tamponu ile yıkayın. Bölümleri, yüksek basınçlı dondurma için altın taşıyıcılara veya tampon ve% 20 BSA ile doldurulmuş HPF'ye yerleştirin.

Ardından, taşıyıcıları içeren numuneyi kullanım kılavuzuna göre yüksek basınçlı bir dondurucuya yükleyin. Dondurulduktan sonra, taşıyıcıları sıvı nitrojen altında tutucudan serbest bırakın ve bunları negatif 140 santigrat dereceye soğutulmuş serbest bir ikame cihazına aktarın. Aseton içinde %2 glutaraldehit, %2 osmiyum tetroksit, %0.1 uranil asetat içeren FS kokteyli ile serbest ikame protokolünü gerçekleştirin.

Numuneleri oda sıcaklığında reçineye gömün. Daha sonra reçineyi 65 santigrat derecede 16 saat polimerize edin. Doku içeren istenen blok yüzünü ortaya çıkarmak için numune bloklarını kesin.

Ardından, 10 nanometre altın parçacıklarını 30 dakika boyunca% 1 BSA ile ön işlemden geçirin. Altın parçacıklarını fosfat tamponlu tuzlu su veya PBS içinde yıkayın ve askıya alın. Referans işaretleyiciler oluşturmak için altın parçacıklarını karbon film ile kaplanmış bakır kayar ızgaraların üzerine yerleştirin.

Bir ultramikrotom kullanarak 200 ila 250 nanometre kalınlığında seri kesitler kesin. Ardından, ince bölümler için mükemmel bir halka kullanarak seri bölümleri yuva ızgaralarında toplayın. Bölümleri Reynolds kurşun sitrat ile 10 dakika boyayın.

Bölümlerin üstüne ikinci bir kat referans altın parçacıkları yerleştirin. Izgarayı çift eksenli bir tomografi tutucusuna yükleyin ve 200 kilovoltta çalışan transmisyon elektron mikroskobuna yerleştirin. Mikroskobu ösentrik odakta hizalayın.

Otomatik veri toplama yazılımını kurun, çok ölçekli görüntüleme ayarında elektron ışınını ayarlayın ve hizalayın, tomografi toplama ayarı altında karbon filmi olmayan boş bir alanda kamera karanlık ve parlak referansları elde edin. Ardından, düşük büyütme oranında bir ızgara atlası toplayın. Tomografi toplama için hedef olarak seri kesitlerdeki mitokondriyi seçin, her hedef için A ekseninde iki derecelik artışlarla eksi 60 dereceden pozitif 60 dereceye kadar bir eğim serisi elde edin.

Son olarak, ikinci eğim serisini toplayın. Numune tutucuyu 90 derece döndürün. Yeni bir atlas edinin.

Karşılık gelen pozisyonları seçin ve her hedef için B ekseninde eğim serisini elde edin. Bu yöntem kullanılarak, bir mitokondrinin tüm hacmini kaplayan seri kesitlerden 2 boyutlu mikrograflar ve 3 boyutlu tomografiler oluşturuldu. Birleştirilen seri kesitli tomogramların, z ekseni dikey olarak gösterilen uzunlamasına bir kesit oluşturacak şekilde öngörüldüğü tahmin edilir.

Mitokondriyal kristaların enerjik durumunu ve yaşlanmasını yansıtan yapısal özelliklerini analiz etmek için seri kesit elektron tomografisi uygulandı. Mitokondriyal elektron tomografik rekonstrüksiyon dilimleri, z ekseni boyunca lameller zarlar arasındaki geçişleri ortaya çıkarır. 3 boyutlu olarak solak bir spirali gösteren tomografik segmentasyon.

Cristae anahtarlama desenleri analiz edildi ve segmentasyon modelinde renk oluşturuldu. Tomografik bir dilim, cristae membranları boyunca lateral matris birleşimini gösterir. Lateral matriks birleşmesi ve temsili cristae'yi gösteren tomogramın bir segmentasyon modeli oluşturuldu.

Bu videoyu izledikten sonra, herhangi bir hücresel yapıyı üç boyutlu olarak incelemek için uyarlanabilecek seri kesitli elektron tomografisinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.