Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü

Bu metodolojinin genel amacı, lenssiz video mikroskobu ile izlenen büyük yapışık hücre popülasyonunun dinamiklerini elde etmek ve analiz etmektir. Bu nedenle, bu tekniğin biyolojinin birçok alanında ve hücre çoğalması veya hücre sistiti veya ilaç taraması veya farklı biyoproses izleme çalışmaları için ilginç olduğunu düşünüyoruz. Yani bu teknik etiketsizdir ve çok basittir.

Ancak büyük hücre popülasyonlarını incelemede çok etkilidir. Bakteri tespit etme alanından memeli hücrelerini görüntüleme alanına geçtiğimizde bu yöntem için ne gibi bir fikir. Daha sonra biyologun, devrenin doğrudan inkübatöre hızlandırılmış olarak alınmasına ihtiyaç duyacakları faydalı oldu.

Daha sonra inkübatörle uyumlu, özelleştirilmiş lenssiz bir video mikroskobu yaptık ve çok geniş görüş alanında bulunan binlerce hücrenin resmini elde etmek için holografik bir rekonstrüksiyon algoritması geliştirdik. Bu prosedüre, 6 oyuklu bir cam alt plakayı oda sıcaklığında 1 saat boyunca fibronektin ile kaplayarak başlayın. 1 saat sonra, fazla fibronektini çıkarın ve 6 kuyulu cam alt plakayı PBS ile durulayın.

Bu gösteride, DMEM'de büyütülen hela hücreleri ve ayrıca aktive edilmiş fetal buzağı serumunda %10 ısı ile desteklenmiş glutamin ortamı ve %1 penisilin ve streptomisin kullanılmıştır. Kültür plakası başına yirmi bin hücre tohumlayın. Cam tabanlı bir kap kullanmak önemlidir.

Lenssiz satın almanın kalitesi için. Kültür plakasını lenssiz video mikroskobunun üstündeki inkübatöre yerleştirin. Bu hızlandırılmış çekim için kullanılan lenssiz video mikroskobu ticari olarak temin edilebilir.

29.4 milimetre kare görüntüleme alanına ve 1.67 mikrometre piksel aralığına sahip metal oksit yarı iletken görüntü sensörüne sahiptir. Çoklu dalga boyu aydınlatması, hücrelerden yaklaşık 5 santimetre uzaklıkta 150 mikro metrelik bir iğne deliğinin üzerine yerleştirilmiş çok çipli bir ışık yayan diyot cihazı ile sağlanır. Hızlandırılmış çekime başlamadan önce, kapak plakasında yoğuşma olup olmadığını kontrol etmek önemlidir.

Çünkü yoğuşma, alımın görüntü kalitesini düşürecektir. Kültür plakasının kapağında yoğuşma meydana gelmişse, kapağı temizleyin. Video lenssiz mikroskobu piyasada bulunan bir edinme yazılımı ile kontrol edin.

Hem hızlandırılmış edinimi hem de holografik rekonstrüksiyonu gerçekleştirir. Yazılım arayüzüne gerekli giriş parametrelerini girin. Kare hızını, her 10 dakikada bir 1 alıma, hücre kültürü tipini yapışkan hale getirin ve deneyin süresini 3 gün olarak ayarlayın.

Zaman atlamalı alımı başlatın. Bu görüntü, bir karede 29,4 milimetre karelik bir alanda mavi kanaldaki ham bir alımın tam görüş alanının bir örneğini göstermektedir. Panel B, panel A'nın detayıdır ve panel C, panel B'nin detayıdır.Holografik rekonstrüksiyon algoritması, hücre kültürünün faz görüntüsünü elde etmek için lenssiz edinimi otomatik olarak işleyecektir.

Faz sarma işleminden önceki hücrelerin örnek bir görüntüsü ve ardından faz açma işleminden sonra bir görüntü gösterilir. Hücre izleme, tek parçacıkların otomatik olarak izlenmesi için açık kaynaklı bir Fiji eklentisi olan TrackMate algoritması kullanılarak gerçekleştirilir. Yüklemeden sonra, Fiji'ye tam hızlandırılmış çekim ve algoritmaları metin protokolünde açıklandığı gibi yapılandırdıktan sonra, giriş parametrelerini ayarlayın.

Tahmini blob çapını 15 piksele, dedektör eşiğini 0,25'e, bağlantı maksimum mesafesini 15 piksele, boşluk kapatma maksimum mesafesini 15 piksele ve yoldaki nokta sayısını 3,5'e ayarlayın. Hücre izleme algoritmasındaki ilk adım, lenssiz edinimde hücrelerin tespit edilmesidir. Hücre izleme algoritmasının sonuçları, tüm hücre izleri elli kareden fazla veya yaklaşık 8 saat boyunca gösterilerek gösterilir.

Medyan hıza karşılık gelen bir renk kodu ile. Alt panel, üst panelden sarı dikdörtgenin ayrıntılı bir görüntüsüdür. Hücre izlemenin temsili bir video klibi burada gösterilmektedir.

Hücre izleme işleminin sonunda, sonuçları 3 metin dosyası biçiminde oluşturmak için analiz düğmesini seçin. Bu verilere dayanarak, metin protokolünde ve ek kod dosyalarında ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, hücre segmentasyonu gerçekleştirin ve özel algoritmalar kullanarak hücre bölünmelerini tespit edin. Tüm tek hücre ölçümlerini tam zaman atlamalı edinim üzerinden derlemek, zamanın bir fonksiyonu olarak çeşitli metriklerin dağılım grafiklerini üretir.

Tam görüş alanındaki toplam hücre sayısı 2,7 günde iki binden on beş bine çıkar. Zaman noktalarının sayısı ile çarpıldığında, bu, algılanan hücrelerden oluşan büyük bir veri kümesine yol açar. Her biri koordinatları ve kuru kütle, alan, ortalama kalınlık, ana erişim uzunluğu ve en boy oranı gibi morfolojik özellikleri ile karakterize edilir.

Hücre izleme ve hücre segmentasyon algoritmalarının kombinasyonu, tek hücre düzeyinde kinetik ölçümleri mümkün kılar. Bu örnek, yaklaşık altmış altı saat süren ve sarı daire içine alınmış zaman noktalarında 4 hücre bölünmesi sergileyen hücre izinin analizini göstermektedir. Zamanın bir fonksiyonu olarak birkaç metrik hesaplandı: hücre yüzey alanı, kuru kütle, ortalama kalınlık ve hücre motilitesi.

2.7 günlük gözlem için hücre döngüsü süresinin dağılımı agouziyen'e yakındı. Ortalama 16.5 saat ile. Otomatik olarak ölçülen hücre döngüsü uzunlukları, manuel olarak ölçülenlerle iyi bir şekilde ilişkilidir.

Hücrenin ilk kuru kütlesi, son kuru kütlesi ve hücre döngüsü sırasındaki ortalama büyüme hızı gibi diğer parametreler de incelendi. Bir kez ustalaştıktan sonra, hızlandırılmış alımın eksiksiz veri analizi, CPU yapılandırmasına ve donanım performansına bağlı olarak birkaç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, başlangıçtaki hücre konsantrasyonunu dikkatli bir şekilde belirlemek çok önemlidir.

İlk hücre konsantrasyonu çok büyükse, hücre izleme algoritması hücre yörüngelerini düzgün bir şekilde tanımlamada başarısız olacaktır. Ancak, hücre konsantrasyonu çok düşükse, tam analizin istatistikleri de çok düşük olacaktır. Bu prosedürü takiben, biyoloji, temel biyoloji veya kemotaksis alanlarındaki diğer soruları yanıtlamak için hücre izleme analizleri gibi otomatik analizler gerçekleştirilebilir.

Bu yeni teknik, aynı zamanda, hücre döngüsünü incelemek için ilginç bir bakış açısı getirecek olan hücre soyunun izlenmesinin de önünü açıyor. Bu videoyu izledikten sonra, lenssiz video mikroskobu ile hızlandırılmış çekimin nasıl yapılacağını ve büyük bir hücre popülasyonunun nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.