Gıda kaynaklı patojen tespit etmek için bir elektrokimyasal DNA biyoalgılayıcı gelişimi

Gıda kaynaklı patojenler, küresel olarak halk sağlığı sorunlarının büyük bir kısmına katkıda bulunmakta ve bu da insan ölüm ve morbidite oranını önemli ölçüde etkilemektedir. Gıda kaynaklı patojenlerin tespiti için kullanılan geleneksel yöntemler, karmaşık numune işlemleri gerektirir ve zaman alıcıdır. Son zamanlarda, biyosensörlerin hızlı algılama ve pratiklik avantajları ile umut verici ve kapsamlı bir algılama yöntemi olduğu kanıtlanmıştır.

Biyosensörlerin geliştirilmesi, polilaktik asit ile stabilize edilmiş altın nanopartiküller ile modifiye edilmiş elektrot üzerine kuruludur. Serigrafi baskılı karbon elektrot, çalışma elektrodu aktif yüzey alanını artırmak için modifiye edildi. Redoks kompleksi olarak kullanılan metilen mavisi, hareketsizleştirilmiş prob DNA'sının tek sarmallı DNA'sı ile güçlü bir bağa sahiptir.

Bu yüksek afinite ilişkisi, yüksek bir tepe akımı ile temsil edilir. Tek sarmallı DNA'nın tamamlayıcı dizisi ile hibridizasyonu, bağlı metilen mavisi moleküllerinin yerini alır, bu da diferansiyel darbe voltametrisinin akımını azaltır. Bunun nedeni, guanin bazları arasındaki ulaşılamayan etkileşimin neden olduğu, tamamlayıcı çift sarmallı DNA ile modifiye elektrotun yüzeyinde toplanan daha az miktarda metilen mavisi olabilir.

Hazırlanan çözeltilerin rengi sarıdan başlayarak siyahımsı ve son olarak koyu yakut kırmızısına değişir. Bu, altın tuzunun sitrat iyonları tarafından indirgendiğini gösterdi. Çözünmüş polilaktik asit, önceden hazırlanmış altın nanopartikül çözeltisi ile karıştırıldı ve daha sonra oda sıcaklığında homojen bir şekilde karıştırıldı, bu daha sonra polilaktik asit stabilize edilmiş altın nanopartiküller olarak gösterildi.

Polilaktik asit stabilize altın nanopartiküllerini karakterize etmek için ultraviyole görünür spektroskopi, x-ışını kırınımı, transmisyon elektron mikroskobu ve enerji dağıtıcı x-ışını spektrometresi ile alan emisyon taramalı elektron mikroskobu kullanıldı. Polilaktik asit stabilize edilmiş altın nanopartiküllerin homojen çözeltisinin yaklaşık 25 mikrolitresi, serigrafi baskılı karbon elektrot üzerine hızlı bir şekilde pipetlendi ve kullanımdan önce 24 saat boyunca havayla kurutuldu. Modifiye elektrotlar daha sonra aktif yüzey alanını, elektrokimyasal empedans spektroskopisini, tekrarlanabilirliği, tekrarlanabilirliği ve kararlılığı ölçmek için potasyum ferrosiyanür içinde elektrokimyasal olarak karakterize edildi.

İmmobilizasyon koşulunun optimizasyonu, 0.2 ila 1.4 mikromolar arasında değişen tek sarmallı DNA konsantrasyonu, 30 ila 220 dakika arasında değişen zaman ve 25 ila 75 santigrat derece arasında değişen sıcaklık olmak üzere üç faktör kullanılarak belirlendi. Öte yandan, hibridizasyon koşulunun optimizasyonu, beş ila 35 dakika arasında değişen zaman ve 25 ila 75 santigrat derece arasında değişen sıcaklık olmak üzere iki faktör aracılığıyla belirlendi. İşlem görmüş modifiye elektrotlar daha sonra 30 dakika boyunca 20 mikromolar metilen mavisine daldırıldı.

Spesifik olarak emilmeyen DNA ve fazla metilen mavisi, tuzlu asetat tamponu pH 4.5 ile yıkanarak uzaklaştırıldı ve daha sonra deiyonize su ile durulandı. Metilen mavisi indirgemesinin tepe akımı, diferansiyel darbe voltametri tekniği kullanılarak ölçüldü. Diferansiyel darbe voltametrisi ölçümü, hiçbir indikatör içermeyen fosfat tampon salin pH 7.0 kullanılarak gerçekleştirildi.

Tüm etkileşimler için benzer bir prosedür uygulandı. Bu çalışmada elektrokimyasal DNA biyosensör validasyonu için referans suş olarak Vibrio parahaemolyticus ve diğer sekiz bakteri suşu, yani Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus ve Vibrio alginolyticus kullanılmıştır. Canlılıklarını korumak için her iki haftada bir, kendi agarlarında bakteri suşlarının rutin bir alt kültürü gerçekleştirildi.

Vibrio parahaemolyticus hücrelerinin miktarı, yayılmış plaka tekniği kullanılarak belirlendi. Bakteri hücre kültürünün bir milimetresi, 10'luk bir seyreltme faktörü elde etmek için %3 sodyum klorür içeren dokuz milimetre triptikaz soya suyuna aktarıldı. Daha sonra, 10 ila 10 kez seyreltme faktörünün 10 ila 10 katı seyreltme faktöründen başlayarak her bir seyreltme faktörünün 0.1 mililitresi, koloni sayımı için sırasıyla bir CHROMagar Vibrio plakasına yayıldı.

Köfteler ıslak pazardan elde edildi ve daha sonra analiz için bir buz soğutucu kutu içinde hızlı bir şekilde laboratuvara getirildi. Midyeler, hasadın başlangıcından pazarda soğuk hava depolarına yerleştirilene kadar eşit şekilde hasat edildiği varsayımıyla, muamele edilmiş ve muamele edilmemiş grup olmak üzere iki gruba ayrıldı. Tedavi edilen gruptaki cockles, 24 saat boyunca eksi 20 santigrat derecede saklanarak ön işleme tabi tutuldu, ardından DNA ekstraksiyonundan önce dört saat boyunca 20 santigrat derecede ultraviyole ışığa maruz bırakıldı.

Kontrol grubu için kullanılan donma sıcaklığı ve ultraviyole maruziyetinin onu öldürmesi veya en azından midyelerde doğal olarak biriken gıda kaynaklı patojenleri sınırlaması bekleniyordu. 70 santigrat derece gibi daha yüksek bir pastörizasyon rejimi uygulanmadı, çünkü bu çalışmada kontrollü durumun amacı taze midyelerin gerçek durumunu taklit etmekti. Bu arada, tedavi edilmeyen gruptan alınan numuneler, laboratuvara gelir gelmez herhangi bir ön işlem yapılmadan doğrudan analiz edildi.

Cockles, steril forseps ve laminer bir akış kabini kullanılarak dokuların kabuklardan çıkarılmasından önce damıtılmış suda yıkandı ve kirden arındırıldı. Yaklaşık 10 gram midye dokusu örneği 19 mililitre steril triptikaz soya suyu içinde %3'lük sodyum klorür içeren homojenizatör ile 60 saniye süreyle homojenize edildi. Daha sonra, çivili numuneler için dokuz milimetre homojenize numune suyuna bilinen miktarda gıda kaynaklı patojen eklendi.

Çivilenmemiş numuneler negatif kontrol olarak kullanıldı. Biyosensör ve polimeraz zincir reaksiyonu testi için kullanılacak olan DNA örneği ekstraksiyonu için yaklaşık bir mililitre numune bir Eppendorf tüpüne pipetlendi. Gıda kaynaklı patojenin genomik DNA'sı daha sonra çivili ve çivisiz örneklerden ekstrakte edildi.

Genomik DNA, modifiye edilmiş bir kaynatılmış lizis prosedürünü takiben ekstrakte edildi. Genomik DNA, net bir süspansiyon elde etmek için dört santigrat derecede üç dakika boyunca dakikada 12.000 dönüşte santrifüjlendi ve süpernatant daha fazla kullanım için eksi 20 santigrat derecede tutuldu. Ekstrakte edilen genomik DNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını belirlemek için bir biyofotometre kullanıldı.

Tüm suşların kimliği daha sonra standart biyokimyasal testler kullanılarak belirlendi ve 16 SR RNA gen dizilimi ile doğrulandı. Son olarak, genomik DNA iki dakika boyunca 92 santigrat derecede denatüre edildi ve biyosensörün uygulanmasından önce buzlu suda hızla soğutuldu. Gıda kaynaklı patojenlerin daha fazla doğrulanması, ilgili geni hedef alan polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak yapıldı.

Amplifiye edilmiş ürün ve boyutları %1.5 agaroz jel üzerinde elektroforez yoluyla belirlendi. Jel görüntüleri bir jel dokümantasyon sistemi kullanılarak yakalandı. Polilaktik asit stabilize altın nanopartiküllerinin üretimi, yüzey plazmasının ve rezonans zirvesinin büyümesinin 540 nanometre civarında kurulduğu ultraviyole görünür spektrumlardan doğrulandı.

Polilaktik asit stabilize altın nanopartiküllerinin oluşumu ve varlığı, partikül boyutuna bağlı olarak 500 ila 600 nanometre dalga boyu aralıklarında gösterilmiştir. Polilaktik asit stabilize altın nanopartiküllerinin tüm kristalit zirveleri, 31.7, 38.2, 44.4, 64.7 ve 77.7 derecedeki iki tiyatroda gözlendi. Kristalit tepe yoğunlukları, daha geniş kırınım tepe noktaları 31.7 dereceye girdiğinde de arttı, bu da soğuk nanopartiküllerin polilaktik aside gömülü olduğunu ve polifazik altın nanoyapıların oluşumunu düşündürüyor.

Transmisyon elektron mikroskobu parçacık dağılım eğrisinden ve polilaktik asit stabilize edilmiş altın nanoparçacıkların görüntülerinden, altın nanoparçacıkların neredeyse küresel bir şekle sahip olduğu görülebilir. Nanopartiküllerin boyutu, Scherrer'in formülünden elde edilenden biraz daha büyük olan yaklaşık 37 nanometre aralığındaydı ve sentezlenmiş nanopartiküllerin poli-kristal bir doğasını düşündürüyordu. Polilaktik asit stabilize altın nanopartiküllerinin ana boyutu, 100 Bragg'in yansımasının genişliği belirlenerek Sherrer denklemi kullanılarak hesaplandı.

Tablodan, polilaktik asit stabilize edilmiş altın nanopartiküllerin kristalit boyutu 27 nanometre olarak hesaplanmıştır. Alan emisyon taramalı elektron mikroskobu görüntülerinden ve enerji dağıtıcı x-ışını spektrumlarından, modifiye edilmiş serigrafi baskılı karbon elektrot, en yüksek altın ağırlık yüzdesine, en büyük yoğunluğa ve en büyük nanoparçacık kapsama yapısına sahipti. Enerji dağıtıcı x-ışını spektrumu, üretilen polilaktik asit stabilize altın nanopartiküllerinin yalnızca altından oluştuğunu ve karbon ve oksijene karşılık gelen tepe dışında başka bir element göstermediğini doğruladı.

Anodik ve katodik tepe potansiyelleri, farklı tarama hızlarında tutarlıydı, bu da elektrokimyasal reaksiyonun tepe ayrımına bağlı olarak tersine çevrilebilir olduğunu düşündürdü. Modifiye elektrotların aktif yüzey alanı, çıplak elektrot ve modifiye elektrot için sırasıyla 0.26 santimetre kare ve 0.41 santimetre kare olarak hesaplandı. Bu sonuç, polilaktik asit stabilize altın nanopartiküllerinin aktif yüzey alanı üzerinde sağladığı iyileşmenin, çıplak elektrot ile karşılaştırıldığında nispeten daha yüksek olduğunu doğruladı.

Çıplak elektrot için yük transfer direncinin değeri 1.932 ohm iken, modifiye elektrot 1.444 ohm'a düştü. Modifiye elektrottaki yük transfer direnci değerinin azalması, yerel dielektrik sabitindeki bir azalmadan ve/veya elektrikli çift katmanın kalınlığındaki bir artıştan kaynaklanmış olabilir, bu da potasyum ferrosiyanürün metal veya çözelti arayüzünde absorpsiyon ile işlev gördüğünü düşündürür. Tepe akımları, polilaktik asit stabilize altın nanopartiküller kullanılarak çıplak elektrotun modifikasyonu ile kademeli olarak arttı, bu da daha yüksek bir hassasiyetin düşük yük transfer direncinin tersi olduğunu gösterdi.

Modifiye elektrotun nispi standart sapması %4.26 olarak türetilmiştir. Polilaktik asit stabilize altın nanopartikül modifikasyonlu elektrot, birkaç ölçümden sonra daha iyi nispi standart sapma verdi. Modifiye elektrot için% 4.05'lik nispi standart sapma değerleri, polilaktik asit stabilize altın nanopartikülleri için elektrot imalatının daha iyi tekrarlanabilirliğini gösterir. DNA'nın optimize edilmiş konsantrasyonu 1.2 mikromolar tek sarmallı DNA idi.

Tek sarmallı DNA'nın optimum immobilizasyon süresi 180 dakika olarak seçildi. Tek sarmallı DNA'nın optimum immobilizasyon sıcaklığı 55 santigrat derece olarak seçildi. Çift sarmallı DNA'nın optimum hibridizasyon süresi 10 dakika olarak seçildi.

Çift sarmallı DNA'nın optimum hibridizasyon sıcaklığı 35 santigrat derece olarak seçildi. Tamamlayıcı DNA, incelenen DNA, tamamlayıcı olmayan DNA, üç baz uyumsuz DNA ve bir baz uyumsuz DNA arasında 0.73 mikroamperlik en düşük tepe akımını sergiledi. Hedeflenen DNA'dan gelen yüksek akımın, diğer oligonükleotid dizilerinin akımından daha küçük olduğu açıktır.

Bu sonuç, biyosensörün yüksek hassasiyet ve özgüllük ile ayrım yapmak için kullanılabileceğini gösterdi. Oluşturulan DNA biyosensörü, modifiye elektrotun yüzeyinde hareketsizleştirilmiş prob DNA'sı yoluyla hibridizasyon tespiti seçiciliğine sahipti. Modifiye edilmiş elektrot üzerindeki metilen mavisinin diferansiyel darbe voltametrisi tepe akımında sürekli azalma, tamamlayıcı DNA konsantrasyonundaki bir artışın bir sonucu olarak tetiklendi.

0.2 pikomolar ila 0.02 milimolar arasındaki çeşitli hedef DNA konsantrasyonlarının günlüğü ile metilen mavisi indirgeme tepe akımının günlüğü arasındaki doğrusal bir korelasyon, 0.96'lık bir doğrusal regresyon katsayısı ile gösterilir. Fabrikasyon DNA biyosensörü için geri kazanım yüzdesi, altı aylık depolamadan sonra yavaş yavaş ilk sinyalinin %80'inden daha azına düşmedi, bu da modifiye elektrotun yüzeyindeki tek sarmallı DNA probunun oldukça kararlı olduğunu gösteriyor. 45 santigrat derecenin altındaki bir sıcaklıkta iyi uzun vadeli stabilite, polilaktik asit stabilize altın nanopartikülleri ile tek sarmallı DNA arasındaki güçlü reaksiyonun nedeni olabilir.

Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio alginolyticus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae ve Vibrio parahaemolyticus olmak üzere dokuz farklı bakteri türü için polimeraz zincir reaksiyonu amplifikasyon ürünleri tarandı. Çapraz reaktivite değerlendirmesinden sonra elde edilen diferansiyel darbe voltametrisi tepe akımı, diğer bakteri türlerine kıyasla Vibrio parahaemolyticus'un çok net bir şekilde tespit edildiğini gösterir. Baz çiftlerinin sayısı azalarak görülebilir, gözlenen diferansiyel darbe voltametri sinyali artar.

Bu, problara kadar daha büyük miktarda metilen mavisi molekülü ile ilgilidir. Polimeraz zincir reaksiyonu analizinden, Vibrio parahaemolyticus, şerit yedi, sekiz, dokuz, 10, 11 ve 12 ile gösterildiği gibi, hem işlenmiş hem de işlenmemiş çivili numunelerde bulundu. Oysa bir, iki, üç, dört, beş ve altıncı şeritteki muamele edilmiş ve işlenmemiş çivilenmemiş numuneler Vibrio parahaemolyticus'tan yoksundu.

Tespit sonuçları, çivili ve çivisiz örneklerden oluşan tedavi edilen grupta Vibrio parahaemolyticus'un varlığını başarıyla belirleyen gelişmiş DNA biyosensörü kullanılarak elde edilir. Bu sonuçlar, daha önce tartışılan polimeraz zincir reaksiyonu sonuçları ile pozitif korelasyon göstermektedir. Polilaktik asit stabilize altın nanopartiküllerin uygulanması, daha fazla üretim duygusu için bir değişiklik olarak uygulama için büyük bir potansiyele sahiptir.

Redoks kompleksi, hibritlenmemiş biyo-tanıma molekülü ile daha güçlü bir şekilde bağlandığında yüksek bir seçicilik elde edilebilir, bu da takip etmeye değer bir yenilik olabilir.