Name: Hücresel bileşenleri tanımlamak için basit Floresans tabanlı muhabir tahlil Risin toksin için Maya ticareti bir zincir (RTA) gerekli. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Öğrenin, risin toksin A'nın maya hücrelerindeki taşınmasını analiz etmek için floresans tabanlı muhabir tahlil yöntemini. Bu hızlı ve ekonomik teknik, gen fonksiyonlarını incelemek için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada parçalar (SFB 1027, A6) Deutsche Forschungsgemeinschaft hibe tarafından desteklenen nazik vardı.

Not: Resim 1' de genel deneysel iş akışı genel bakış tasvir edilir.
Dikkat: RTA insanlar için çok toksiktir. Emanet laboratuvar izni S2 (Biyogüvenlik seviye 2 eşdeğeri) gereklidir. Lütfen tüm deneme sırasında eldiven.
1. Contegra ifadesi O'nun öğesini RTA Escherichia coli olarak
<ol>
	<li>E. coli hücreleri ifade plazmid pET24-RTA(onun) 6 veya standart elektroporasyon protokolleri9,10kullanarak boş vektör pET24a(+) ile dönüşümü. Boş plazmid içeren hücreler bir negatif kontrol hizmet vermektedir.</li>
	<li>Seçimden sefaloridin içeren (100 µg/mL) LB plakalar üzerinde olumlu klonların sonra RTA ifade Plazmid ve 5 mL LBkan orta (LB orta ile sefaloridin 100 µg/mL) boş vektörde içeren hücre aşılamak ve 37 ° C ve 24 saat için 220 devir/dakika, kuluçkaya.</li>
	<li>1 L LBkan orta 5 mL öncesi kültür ile ek ve hücreleri 0.8-1.0 (yaklaşık 3-4 h) OD600 gelinceye hücreleri 37 ° C ve 220 devir/dakika, kuluçkaya. Bundan sonra kültür sıcaklık 28 ° C için azaltmak ve 1 M H2O. izopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) stok çözüm hazırlamak</li>
	<li>RTA ifade E. coli 1 mM son bir konsantrasyon IPTG ekleyerek teşvik.</li>
	<li>3.5 h 28 ° c ve 220 devir/dakika, hasat hücreleri tarafından Santrifüjü 10.000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika, sonra iki kez ile 5 mL de bağlama arabellek (500 mM NaCl, 10 mM imidazole ve 20 mM KH2PO4 Pelet yıkama pH 7.4 =) 10.000 x g ve 10 dk ve resuspend Pelet 5 mL bağlama arabelleği için 4 ° C '. Not: Bu aşamada Protokolü duraklatılmış ve hücreleri 80 ° C'de için birkaç gün saklanabilir.</li>
</ol>
2. O'nun öğesini RTA benzeşme Kromatografi ile saflaştırılması
<ol>
	<li>Hücreleri aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak buzda solüsyon içeren temizleyicide: 15 s darbe (20 mikron), 30 s Duraklat. Bu beş kez tekrarlayın.</li>
	<li>Hücre lysate, 21,000 x g ve 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi ve steril enjektör filtre sistemi (0.2 µm gözenek boyutu) kullanarak süpernatant filtre. Not: Hücre granül başarıyla sonicated örnekleri şeffaf kenarlıklarını göster.</li>
	<li>5 mL ile Ni2 +donatılmış bir otomatik arıtma sistemi kullanın-steril filtre E. coli süpernatant dan O'nun öğesini RTA kesir arındırmak için benzeşme sütun temel. Genel olarak, 1 mL/dk elüsyon hızını kullanın ve verimli olmayan toksin bağlayıcı ve toksin aktivite kaybı önlemek için tüm arıtma sistemi serin. Not: Verimli RTA arıtma için parametreleri Tablo 1' de listelenmiştir. Ayrıca bkz: Becker ve ark. daha fazla bilgi9için.<ol>
		<li>Kısaca, benzeşim sütun bağlama arabellek depolama arabellek kaldırmak için 20 mL ile equilibrate. Bir Ģırınga kullanarak benzeşme sütuna süpernatant steril filtre uygulayın.</li>
		<li>Sütun bağlama arabellek sütundan ilişkisiz proteinler kaldırmak için 25-35 mL ile yıkayın. 280 Absorbans UV kadar çamaşır adımı gerçekleştirmeniz nm başlangıç UV değeri yakın olduğunu.</li>
		<li>Bağlı RTA kesir elüsyon arabellek 20-35 ml elute (500 mM imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH 7.2 =) ve örnek buz (şekil 2A ve şekil 2B) üzerinde tutun. Not: Elüsyon RTA fraksiyonunun UV emme bir artış tarafından işaretlenir. Unutmayın ki sadece spesifik olmayan ilişkili proteinler ile kontaminasyonu önlemek için bu kesir toplamak için.</li>
		<li>Eluted örnekleri 20 µL Coomassie mavi11 veya Western blot analizi12,13 (isteğe bağlı) Boyama gerçekleştirmek için kullanın. Birincil RTA algılamak ve örnek saflık (şekil 3) doğrulamak için anti-O'nun antikorlar (1:1, 000) ve ikincil anti-mouse-IgG-HRP (1:10, 000) kullanın.</li>
		<li>Eluted RTA kesir 5 mL desalting sütun desalt ve 0, 8 M sorbitol örnek equilibrate.<ol>
			<li>Arıtma sistemi benzeşme sütun desalting sütun tarafından eski yerine koymak ve ilk sütun 0, 8 M sorbitol 20 mL ile equilibrate.</li>
			<li>Eluted RTA kesir bir şırınga ile sütun uygulanır. Sütun 0, 8 M sorbitol 100 mL ile yıkama ve UV emme (şekil 2C) artmaya başlar başlamaz desalted RTA kesir bir 15 mL tüp elute.</li>
			<li>Eluted RTA kesir 4 ° C'de depolayın Not: tuz kirlenmesini önlemek için gürültülerinden artırır doğrudan RTA kesir örnekleme durdurur. Desalting yordam parametreleri tablo 1'de listelenmiştir.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eluted RTA kesir 10.000 x g ve 4 ° C'de 30-180 dk 10 kDa kesme spin sütun için 1-2 mL son hacmi kullanarak için konsantre ve örnek 4 ° C'de 3-4 hafta için saklayın. Dikkat: RTA etkinlik tam bir kaybına yol açar dondurma beri örnek dondurma değil.</li>
	<li>Bir geleneksel protein tayini kit kullanarak protein konsantrasyonu belirlemek. Protein konsantrasyonu 1-1.5 mg/mL aralığında olmalıdır. Not: RTA protein konsantrasyonu çok yüksek ise çökelti eğilimi (&gt; 5 mg/mL).</li>
</ol>
3. Maya dönüştürme ve hücre duvarı kaldırma
<ol>
	<li>Vahşi-türü veya seçili Maya silme mutantlar standart lityum asetat dönüştürme yöntemleri14kullanarak GFP muhabir plazmid pRS315-K28SP- GFP6 ile dönüşümü. Hücreleri lösin drop-out (d/o) üzerinde kuluçkaya olumlu klon seçim için 2-3 gün için 30 ° C'de glikoz tabak (% 2 glikoz, %1,5 agar, % 0.5 amonyum sülfat, %0,17 Maya azot Bankası (YNB) ve %0.087 d/o mix lösin olmadan).</li>
	<li>3 farklı Maya klonlar her plaka almak ve 220 devir/dakika ve 30 ° C-OD600 lösin d/o raffinose orta (%2 raffinose, % 0.5 amonyum sülfat, %0,17 YNB ve %0.087 d/o lösin mix) 100 ml klonlar aşılamak 1.0-2.0 = (2-4 x 107 hücre/mL). Not: Hücre büyümesini farklı Maya silme suşlarının farklıdır. OD600 bir Spektrofotometre ile izleyin.</li>
	<li>OD600 değerleri hesaplamak için seyreltik örnekleri OD600 0,1-0,3 = (1:5-1:10 dilutions) ve OD600 bir Spektrofotometre ölçmek. H2O lösin d/o raffionose orta karşılık gelen tutarı ile desteklenmiş başvuru olarak kullanın.</li></ol>Son olarak, OD600 resuspend 125 5 ml steril su (5 x 108 hücre/mL) =.
	<li>Santrifüj kapasitesi 10.000 x g de 5 min için 25 ° C'de hücreler, hücre iki kez 5 mL steril su ile yıkayın ve 50 mL spheroplasting arabellek hücrelerde resuspend (0,8 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM CaCl2, 2 mM dithiothreitol (DTT) ve 200 µg/mL litik enzim).</li>
	<li>50 mL kültür 100 devir/dakika ve 30 ° C 90 dk. isteğe bağlı için kuluçkaya: faz kontrast mikroskobu tarafından spheroplast oluşumu her 15dk izlemek. Mikroskop altında hücreler koyu şeffaf gri renk olmalıdır. Bright (refractile) hücreleri yeterince sindirilmiş, oysa hayaletler (soluk gri hücreleri küçük, varsa, iç yapısı ile) aşırı sindirilir.</li>
	<li>Spheroplast hazırlık etkinliği her örnek için kontrol edin.
	<ol>
		<li>Bitirme adım 3.5, spheroplasted 50 mL kültürünün 4 µL 496 µL spheroplasting arabellek (yaklaşık 2 × 106 spheroplasts) ile karıştırın ve santrifüj kapasitesi 400 x g de 10 dakika sonra.</li>
		<li>10 mL H2O resuspend Pelet distile, girdap örnek 30 s ve plaka 10 µL lösin d/o glikoz plakaları (% 2 glikoz, %1,5 agar, % 0.5 amonyum sülfat, %0,17 YNB ve %0.087 d/o mix lösin olmadan) örneğinin dışarı için.</li>
		<li>Hücreleri 30 ° C'de 3 gün kuluçkaya Yetişkin hücre kolonileri plaka üzerinde toplam sayısını saymak. Veri değerlendirme için 98 daha yüksek verimliliği ile sadece örnekleri kullanır (Toplam hücre koloni &lt; 40 kolonileri/plaka).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Santrifüj stabilize hücrelerden adım 3.5 g ve iki kez 5 mL içeren 10 dk ve yıkama hücreler için 4 ° C x 400 lösin d/o raffinose orta (0,8 M sorbitol, % 2'raffinose, % 0.5 amonyum sülfat, %0,17 YNB ve %0.087 bırakma mix lösin olmadan). 5 mL stabilize lösin d/o raffinose orta (1 x 108 hücre/mL) hücrelerde resuspend ve doğrudan hücre GFP muhabir tahlil ölçülerini (Bölüm 4) kullanın.</li>

4. GFP muhabir tahlil ölçüm 96-şey plakaları
<ol>
	<li>Tohum dışarı adım 3.7 96-şey tabak (200 µL/de) içine elde Maya hücre spheroplasts.</li>
	<li>70 µL stabilize lösin d/o raffinose orta negatif kontrol içeren eklemek (eluate bir Ni2 +-benzeşme arıtılmış lysate hücre boş vektör ifade E. coli IPTG kaynaklı hücrelerden) veya RTA 5 µM (son RTA konsantrasyon içinde saf 160 g/M'ye RTA karşılık gelen) her şey içinde.</li>
	<li>Hemen GFP ifade ikna etmek ve daha sonra ölçüm başlatmak için 30 stabilize µL galaktoz çözüm (% 30 galaktoz, 0, 8 M sorbitol) ekleyin. Not: deney başına en az 3 teknik çoğaltır gerçekleştirmek ve Maya zorlanma 3 Biyolojik çoğaltır.</li>
	<li>Numune Hazırlama (adımları 4.1-4.3), Floresans Reader'da 96-şey plaka koymak ve ölçüm başlatmak sonra. GFP Floresans algılama için gerekli ayarla 475/509 nm filtre kullanın. Ölçümler 30 ° c, 120 rpm ve sallayarak çapı 1 mm 20 h (10 dk aralıklarla ölçüm) bir zaman penceresi üzerinde gerçekleştirin. Not: Normalde tüm okuyucu sistemlerinde GFP filtre kümesi kullanılabilir. Sıcaklık, ölçüm aralıkları ve RTA konsantrasyon zaman penceresini kendi ihtiyaçları için ayarlanabilir. Temsilcisi sonuçları şekil 4' te gösterilmiştir.</li>
	<li>İsteğe bağlı: kalite kontrol ölçüm ek iç denetimlerini kullanın. Bir negatif kontrol 30 µL stabilize lösin d/o raffinose orta yerine % 30 galaktoz (GFP indüksiyon) ekleyerek hazırlayın. Buna ek olarak, 70 µL 0,8 M stabilize sorbitol G418 çözüm (300 µg/mL) ekleyin. Maya ifadede GFP engeller gibi protein çeviri inhibitörü G418 protein inhibisyonu için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir.</li>
	<li>Yüzde 20 h saat noktası göre aşağıdaki denklemi için göreli GFP Floresans hesaplamak (bkz. şekil 4A): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56588/56588eq1.jpg"> nerede NC negatif kontrol olduğunu
	<ol>
		<li>Alternatif olarak, her ölçüm için göreli GFP Floresans belirlemek (Ayrıca bkz: adım 4.4 Bu durumda 10 min) Yukarıdaki denklem kullanarak. Şekil 4B' de gösterildiği GFP Floresans yoğunluklarda (y ekseni) Zaman içinde (x ekseni) kurutma tarafından bir grafik oluşturun.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-competent+and+folding-defective+forms+of+ricin+A+chain+have+different+fates+after+retrotranslocation+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum.</a> Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).</li>
<li>Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+entry+of+Shiga-like+toxin+a+chain+from+the+yeast+endoplasmic+reticulum+requires+catalytically+active+Hrd1p%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p.</a> PLoS One. 7 (7), e41119(2012).</li>
<li>Moreau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screens+identify+genes+required+for+Ricin+and+PE+intoxications%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications.</a> Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
<li>Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+an+external+Lys-Asp-Glu-Leu+%28KDEL%29+protein+from+the+plasma+membrane+to+the+endoplasmic+reticulum%3A+studies+with+cholera+toxin+in+Vero+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells.</a> J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).</li>
<li>Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Reporter+Assay+to+Identify+Cellular+Components+of+Ricin+Toxin+A+Chain+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking.</a> Toxins (Basel). 8 (12), (2016).</li>
<li>Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+depurination+is+not+sufficient+for+ricin-mediated+cell+death+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae.</a> Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).</li>
<li>Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ricin%3A+structure%2C+mode+of+action%2C+and+some+current+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Ricin: structure, mode of action, and some current applications.</a> Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).</li>
<li>Becker, B., Schmitt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+yeast+as+model+to+study+ricin+toxin+a+uptake+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking.</a> Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).</li>
<li>Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24674070">Coomassie blue staining.</a> Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).</li>
<li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications.+1979%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979.</a> Biotechnology. 24, 145-149 (1992).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).</li>
<li>Vitetta, E. S., Yen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+properties+of+genetically+engineered+ricin+B+chain+lacking+galactose-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity.</a> Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).</li>
<li>Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+an+endoplasmic+reticulum+retrieval+sequence+to+ricin+A+chain+significantly+increases+its+cytotoxicity+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells.</a> J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).</li>
<li>Jablonowski, D., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymocin%2C+a+composite+chitinase+and+tRNase+killer+toxin+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast.</a> Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).</li>
<li>Jablonowski, D., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+RNA+polymerase+II+is+affected+by+Kluyveromyces+lactis+zymocin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin.</a> J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).</li>
<li>Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kluyveromyces+lactis+zymocin+mode+of+action+is+linked+to+RNA+polymerase+II+function+via+Elongator%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator.</a> Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yukarıdaki Protokolü gerçekleştirirken, biz deneme başarılı bir sonuç elde etmek için aşağıdaki önerileri öneririz.
Kapaklı protein ifade için 1 mM IPTG konsantrasyonu aşmayacak şekilde önemlidir. IPTG konsantrasyonları &#62; 1 mM inhibe organizatörü kaynaklı RTA ifade ve toksin verimleri düşürmek için kurşun. Ayrıca, hücreleri 28 ° C eklenmesi vücut oluşumu, verimsiz katlama ve toksin inactivation önlemek için daha yüksek sıcaklıklarda ekili olmamalıdır. RTA ifade (örneğin, 20-28 ° C...

Etkili tedavi tedaviler hala büyük ölçüde eksik olduğundan hastalarda bulaşan bakteri üreten toksin tarafından her sosyal sağlık sistemi için ciddi bir tıbbi ve mali yük özellikle temsil eder. Yeni tedavi stratejileri, tıbben a karmaşık bağımlılık yapan maddeler mekanizmaları geliştirmek için / B toksinler kolera toksini, Shiga toksin veya "Risin" gibi tam olarak uygulanmalıdır roman güçlü deneyleri üzerinde dayalı moleküler seviyede anlaşılması gerekir.
Son yıllarda, birçok araştırma A analiz girişiminde / B toksin taşımacılığında Maya ve radyoaktif toksin gibi zaman alıcı ve maliyet yoğun yöntemleri kullanarak memeli hücreleri etiketleme siRNA tabanlı tarama yanı sıra1,2 3yaklaşıyor. Bazı durumlarda, toksin kaçakçılığı Floresans mikroskobu tarafından görüntülenmeyecektir vivo içinde bireysel toksini alt birimleri fluorophores, kuantum nokta veya floresan proteinler4,5ile kimyasal ve/veya genetik kaplin sonra olmuştur. Ne yazık ki, bu değişiklikler genellikle etkin olmayan ve/veya değiştirilmiş doğal özellikleri toksinler için yol. Enzim lacZ, luciferase veya floresan proteinler gibi temel muhabir sistemlerinin kullanımı dolaylı olarak çok çeşitli bilimsel sorular cevap vermenin başka bir zarif yolu yok (örneğin GFP veya Discosoma sp. kırmızı floresan protein () dsRed)).
Bu makale, basit bir protokol, extracellularly uygulanan RTA S. cerevisiaehücre içi taşıma gereken hücresel bileşenleri tanımladığı açıklanmıştır. Böylece, dolaylı olarak GFP Floresans emisyon tarafından sonra içinde vivo RTA-aracılı protein çeviri inhibisyon ölçen bir protein biyosentezi sensör GFP tarafından takip bir N-terminal ER-Mümessillik sinyal içeren bir floresan-muhabir plazmid görür çeviri6. RTA endositoz ve/veya hücre içi ticareti olumsuz (veya olumlu) etkilenir ki vahşi-türüne göre belirli Maya silme mutant içinde durumda bu bir artış (ya da azalmak) GFP Floresans emisyon6' tespit edilebilir.
Şimdiye kadar tüm yöntemleri Maya hücreleri RTA Ulaştırma analiz RTA ER sitozol retro-translocation sürecine sınırlandı. Böyle yapay bir sistemde, bir ER alma sinyali içeren RTA bir intihar fenotip1,7' kaynaklanan bir indüklenebilir organizatörü üzerinden ifade edilir. B-alt "Risin" in birim bağlama hücre aynı şekilde bu el yazması açıklanan deneysel kurulumunda eksik ve böylece, tamamen doğal durum "Risin" holotoxin zehirlenme8, toksin taşıma plazma temsil etmiyor olsa da, membran acil servise Golgi aygıtı aracılığıyla yakından bu roman tahlil ile taklit. İlginçtir, pilot çalışmada elde edilen ilk sonuçlar RTA tarafından kullanılan ticaret yolları "Risin" holotoxin zehirlenme güzergahı ile çarpıcı benzerlikler ortaya gösterir.
Özet olarak, açıklanan yöntemi belirli bir rolü RTA endositoz seçili hücresel proteinler ve Maya kaçakçılığı belirlemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu deneysel kurulumu kolayca diğer ribozom üretilen ve çeşitli Maya ve bakteriyel türler gibi zymocin veya Shiga toksin salgıladığı toksinler ihracı için adapte.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Bakteri ve maya suşları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21 DE3(Altın)</td><td>Aligent Technologies</td><td>230130</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae BY4742</td><td>Euroscarf</td><td>Y10000</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae BY4742 delesyon mutantları</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1054</td><td>tüm koleksiyon</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Bu protokolde kullanılan plazmitler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET24a(+) (Novagen)</td><td>Millipore</td><td>69772-3</td><td></td></tr><tr><td>pET-RTA(His6)</td><td>Becker et al. (2016)3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td>USBio</td><td>Z1000.250</td><td>hücre duvarı için litik enzim çıkarma</td></tr><tr><td>LB et suyu ortamı</td><td>Thermo Scientific</td><td>10855021</td><td>Plaka üretimi için 15 g agar eklendi</td></tr><tr><td>YNB</td><td>Thermo Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Lösin içermeyen maya bırakma karışımı supplemts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1376-20G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>D-rafinoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-galaktoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750-10MG</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Termo Bilimsel</td><td></td><td></td>11811031</tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Roth</td><td>3899.1</td><td></td></tr><tr><td>SAYFA cetvel önceden boyanmış</td><td>Fermentas</td><td>26616</td><td>protein merdiveni Batı analizi için kullanılır</td></tr><tr><td><güçlü>Ad<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</ güçlü><</td></tr><tr><td>güçlü>RTA saflaştırma, tuzdan arındırma ve okuyucu ölçümleri için malzeme</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre Ultrospec 2100 pro</td><td>Amersham</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>eski model, diğer modeller mevcut</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210470</td><td>eski model, artık mevcut değil</td></tr> <tr><td>ve Auml; KTAPurifier</td><td>Thermo Scientific</td><td>28406266</td><td>Ürünün üretimi durduruldu ve değiştirildi</td></tr><tr><td>HisTRAP HP sütunu</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>HiTRAP tuz giderme sütunu</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0003-29</td><td></td></tr><tr><td>Midisart steril filtre</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td>0.2 & mikro; m gözenek boyutu</td></tr><tr><td>BCA protein test kiti</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>660 nm test kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plakalar</td><td>Thermo Scientific</td><td>260860</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td><güçlü > Antikorlar (isteğe bağlı), < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Anti-Tetra-His</td><td>Qiagen</td><td>34670</td><td>birincil antikoru; 1: 1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-fare-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9044-2ML</td><td>ikincil antikor, 1: 10.000 seyreltme</td></tr></tbody></table>

hücresel bileşenleri tanımlamak için basit floresans tabanlı muhabir tahlil risin toksin için maya ticareti bir zincir (rta) gerekli.

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

Bakteriyel ve bitki A / B toksinler yararlanmak doğal ticaret yolları ökaryotik hücrelerde sitozol onların hücre içi isabet ulaşmak için ve en sonunda öldürmek için. Böyle A / B toksinler genellikle oluşur bir enzimatik etkin Asubunit (örneğin, "Risin" toksin (RTA)) ve bir veya daha fazla hücre için belirli bağlama toksin yüzey reseptörleri hücre için sorumlu olan Bsubunit(s), bağlama. Nasıl bizim mevcut bilgi A / B toksinler verimli endositoz ve intraselüler protein yüksek ökaryotik hücrelerde sıralama gibi temel hücresel mekanizmaları anlamaya yardımcı hücreleri bilim adamları sarhoş edici yetenekli. Tıbbi açıdan, aynı şekilde büyük toksin ticaret yolları hastalar için yeterli tedavi çözümleri bulmak veya sonunda kanser tedavisi için tedavi toksin tabanlı uygulamalar geliştirmek için tanımlamak önemlidir.
Beri genom çapında analizleri a / B toksin memeli hücrelerinde kaçakçılığı, zaman alıcı, karmaşık ve pahalı, çeşitli çalışmalarda a / B toksin taşıma Saccharomyces cerevisiaeMaya model organizma olarak gerçekleştirilen. Maya ve daha yüksek ökaryotik hücrelerin daha az karmaşık, temel hücresel süreçler olmasına rağmen çok sık Maya elde edilen sonuçlar ve vardır benzer memeli durumuna aktarılabilir.
Burada, hücre içi RTA Maya ticareti analiz etmek için hızlı ve kolay muhabir tahlil açıklayın. Yeni tahlil önemli bir avantajı sitozol sadece RTA retro-translocation endoplazmik retikulum (ER) üzerinden araştırmak için bir fırsattır, ama oldukça endositoz ve retrograd toksin acil servise plazma zarı taşıma. Tahlil geçici kullanma-in RTA toksisite Floresans emisyon yeşil flüoresan protein (GFP) aracılığıyla dolaylı ölçüm sağlar bir muhabir plazmid vivo içinde çeviri sonra. RTA verimli 28S rRNA depurination tarafından protein biyosentezi inisiyasyon önlediğinden bu tahlil konak hücre proteinleri tanımlaması değişiklikleri tespiti yoluyla hücre içi RTA ulaşım dahil Floresans emisyon sağlar.

Kabaca başarılı RTA ve sonraki GFP muhabir tahlil deney için tek adımları özetleyen Resim 1, bu el yazması açıklanan Protokolü'nün genel iş akışı gösterilmektedir. Tek tek her adım daha ayrıntılı bir açıklamasını iletişim kuralında bulunabilir. Şekil 2 bir başarılı RTA arıtma beklenen sonucu benzeşme Kromatografi (şekil 2A) ve boş vektör kontrolü (şekil 2B) tarafından gö...

El yazması, bir maya tabanlı Floresans muhabir tahlil kaçakçılığı dahil ve bitki toksin Risin (RTA) bir alt birim sitotoksik süreçleri öldürmek hücresel bileşenleri tanımlamak için nasıl kullanılacağını açıklar.

Hücresel bileşenleri tanımlamak için basit Floresans tabanlı muhabir tahlil Risin toksin için Maya ticareti bir zincir (RTA) gerekli.

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

Bu basit floresan bazlı raportör testinin genel amacı, maya modeli organizmasında risin toksini A veya RTA zincirinin uygun şekilde kaçakçılığı için gerekli hücresel bileşenleri taramaktır. Bu yöntem, bir B toksinini aktive etmede ribozomun hücreler arası taşınması ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Olgumuzda, düz toksin risinin sitotoksik alt birimi plazma zarından sitozoma doğru ilerler.Bu testin ana avantajı, tek bir maya geninin RTA taşınması üzerindeki etkisini hızlı ve ucuz bir şekilde analiz etme fırsatıdır. Bu protokole, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hücre dönüşümü ile başlayın. Beş mililitre LB kanamisin ortamını RTA ekspresyonu plazmidi veya boş vektör içeren hücrelerle aşılayın.Hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve 220 RPM'de inkübe edin. Bir litre LB kanamisin ortamını beş mililitre ön kültür ile destekleyin. Daha sonra hücreleri 37 santigrat derece ve 220 RPM'de, hücreler 600 nanometre 0.8 ila 1.0 arasında bir optik yoğunluğa ulaşana kadar inkübe edin.Daha sonra kültür sıcaklığını 28 santigrat dereceye düşürün. Bir milimolar nihai konsantrasyona IPTG ekleyerek E.Coli'nin RTA ekspresyonunu indükleyin. 28 santigrat

a-simple-fluorescence-based-reporter-assay-to-identify-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bozulma ve geri dönüşüm için maya vakuol asidik lümen organelleri teslim izlemek için sağlam bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış çift emisyon floresan pH biyosensör ve floresan mikroskobu kullanarak tek tek hücrelerin görselleştirme hedef organellerin özel etiketleme dayanmaktadır.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Kaynak: Becker, B. ve diğerleri. Mayada Risin Toksin A Zinciri (RTA) kaçakçılığı için gerekli hücresel bileşenleri belirlemek için basit bir floresans tabanlı raporlayıcı testi. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, Escherichia coli'de His-etiketli risin toksin A zincirinin (RTA) indüklenebilir ifadesini göstermektedir. Rekombinant ekspresyon plazmidi ile dönüştürülmüş bakterilerin seçici kültürlenmesi, His-etiketli RTA ekspresyonunun indüksiyonu ve bakterinin daha ileri analiz için hazırlanması...

E. coli'de Histidin etiketli Risin Toksin A Zincirinin İndüklenebilir İfadesi

Akış sitometrisi ve mikroskopiye dayanan iki yardımcı yöntem mayada bir MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan gen ekspresyonunun dinamiklerinin tek hücre düzeyinde miktarının, ki olanak sunulmaktadır.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

Bu protokol soydaş GFP gazetecilere ve flow sitometri aracılığı GFP ifade uyarmak için atfs yeteneği ölçümü ile yapay transkripsiyon faktörleri (atfs) hızlı inşası için deneysel bir prosedür açıklanmaktadır.

Hızlı Sentezi ve GFP-tabanlı Muhabirleri ile Kimyasal Aktif Transkripsiyon Faktörleri Taraması

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Tip III sekresyon sistemi yoluyla konak hücrelere efektör translokasyonu, gram negatif bakteriler arasında yaygın bir virülans stratejisidir. Translokasyonun kantitatif analizi için beta-laktamaz efektör füzyon bazlı bir test uygulandı. Yersinia ile enfekte olmuş hücrelerde, bir FRET raportörünün beta-laktamaz tarafından dönüşümü lazer tarama mikroskobu kullanılarak izlenir.

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Veziküler kaçakçılık olaylarının doğru bir şekilde ölçülmesi, genellikle belirli proteinlerin rolleri ve mutasyonların etkileri hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu makale, kantitatif floresan mikroskobu ve akış sitometrisi kullanılarak canlı hücrelerde endositik olayların nicelleştirilmesi için bir araç olarak pH'a duyarlı bir GFP varyantı olan süperekliptik pHluorin'i kullanma yöntemlerini sunmaktadır.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Bu makalede, her iki S. cerevisiae ve HEK293T hücrelerinde protein kendinden montajı ölçmek için fret tabanlı akış sitometri Protokolü açıklanır.

Algılama ve ölçme protein Self-montaj In vivo tarafından akış sitometri

Bireysel çeviri olaylarını izlemek, kap bağımlı çeviri mekanizmalarının yüksek çözünürlüklü kinetik çalışmalarına izin verir. Burada floresan etiketli antikorlar ve epitop etiketli nascent peptitler arasındaki görüntüleme etkileşimlerine dayanan bir in vitro tek moleküllü test gösteriyoruz. Bu yöntem, aktif in vitro kap bağımlı çeviri sırasında başlatma ve peptit uzama kinetiğinin tek moleküllü karakterizasyonunu sağlar.

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Öğrenin, risin toksin A'nın maya hücrelerindeki taşınmasını analiz etmek için floresans tabanlı muhabir tahlil yöntemini. Bu hızlı ve ekonomik teknik, gen fonksiyonlarını incelemek için değerli bir araçtır.

Hücresel bileşenleri tanımlamak için basit Floresans tabanlı muhabir tahlil Risin toksin için Maya ticareti bir zincir (RTA) gerekli. (Video) | JoVE Journal

Hücresel bileşenleri tanımlamak için basit Floresans tabanlı muhabir tahlil Risin toksin için Maya ticareti bir zincir (RTA) gerekli.

Daha fazla video keşfet