Hücresel bileşenleri tanımlamak için basit Floresans tabanlı muhabir tahlil Risin toksin için Maya ticareti bir zincir (RTA) gerekli.

Bu basit floresan bazlı raportör testinin genel amacı, maya modeli organizmasında risin toksini A veya RTA zincirinin uygun şekilde kaçakçılığı için gerekli hücresel bileşenleri taramaktır. Bu yöntem, bir B toksinini aktive etmede ribozomun hücreler arası taşınması ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Olgumuzda, düz toksin risinin sitotoksik alt birimi plazma zarından sitozoma doğru ilerler.

Bu testin ana avantajı, tek bir maya geninin RTA taşınması üzerindeki etkisini hızlı ve ucuz bir şekilde analiz etme fırsatıdır. Bu protokole, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hücre dönüşümü ile başlayın. Beş mililitre LB kanamisin ortamını RTA ekspresyonu plazmidi veya boş vektör içeren hücrelerle aşılayın.

Hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve 220 RPM'de inkübe edin. Bir litre LB kanamisin ortamını beş mililitre ön kültür ile destekleyin. Daha sonra hücreleri 37 santigrat derece ve 220 RPM'de, hücreler 600 nanometre 0.8 ila 1.0 arasında bir optik yoğunluğa ulaşana kadar inkübe edin.

Daha sonra kültür sıcaklığını 28 santigrat dereceye düşürün. Bir milimolar nihai konsantrasyona IPTG ekleyerek E.Coli'nin RTA ekspresyonunu indükleyin. 28 santigrat derece ve 220 RPM'de 3,5 saat sonra, hücreleri 10 dakika boyunca 10.000 g ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile hasat edin.

Daha sonra peleti beş mililitre bağlayıcı tampon ve pelet ile 10.000 g ve dört santigrat derecede 10 dakika yıkayın. Yıkamayı bir kez tekrarladıktan sonra, peleti beş mililitre bağlayıcı tamponda tekrar askıya alın. 15 saniyelik bir darbenin beş döngüsünü ve 30 saniyelik bir duraklamayı kullanarak hücreleri buz üzerinde sonikleştirin.

Hücre sıvısını 15 dakika boyunca 21.000 g ve dört santigrat derecede santrifüjledikten sonra, süpernatanı steril bir şırınga filtre sistemi kullanarak filtreleyin. HIS etiketli RTA fraksiyonunu steril filtrelenmiş E.Coli süpernatantından saflaştırmak için beş mililitrelik, nikel bazlı bir afinite sütunu ile donatılmış otomatik bir saflaştırma sistemi kullanın. Genel olarak, dakikada bir mililitrelik bir kinaye hızı kullanın ve verimsiz toksin bağlanmasını ve toksin aktivitesi kaybını önlemek için tüm arıtma sistemini soğutun.

Depolama arabelleğini çıkarmak için benzeşim sütununu 20 mililitre bağlama arabelleği ile kısaca dengeleyin. Daha sonra steril, filtrelenmiş süpernatanı bir şırınga kullanarak afinite kolonuna uygulayın. Bağlanmamış proteinleri kolondan çıkarmak için kolonu 25 ila 35 mililitre bağlayıcı tampon ile yıkayın.

280 nanometredeki UV emiciler ilk UV değerine yakın olana kadar yıkama adımını gerçekleştirin. Daha sonra bağlı RTA fraksiyonunu 20 ila 35 mililitre elüsyon tamponu ile elüte edin ve numuneyi buz üzerinde tutun. UV, 280 değeri arttıktan kısa bir süre sonra RTA fraksiyon örneklemesini başlatmak ve orijinal taban çizgisine tekrar ulaştığında RTA fraksiyon örneklemesini durdurmak önemlidir.

Kaçan RTA fraksiyonunu tuzdan arındırmak için, arıtma sisteminin afinite sütununu tuzdan arındırma sütunu ile değiştirin ve sütunu 20 mililitre 0.8 molar sorbitol ile dengeleyin. Atlanan RTA fraksiyonunu bir şırınga vasıtasıyla kolona uygulayın. Kolonu 100 mililitre 0.8 molar sorbitol ile yıkayın ve UV emilimi artmaya başlar başlamaz tuzdan arındırılmış RTA fraksiyonunu 15 mililitrelik bir tüpte seyreltin.

Tuz kontaminasyonunu önlemek için, iletkenlik arttığında doğrudan fraksiyon örneklemesinde durun. Eluded RTA fraksiyonunu dört santigrat derecede saklayın. Mayayı metin protokolünde anlatıldığı gibi dönüştürdükten sonra, her plakadan üç farklı maya klonu seçin.

Klonları 220 RPM'de ve 30 santigrat derecede 100 mililitre lucine bırakma rafinoz ortamında 600 nanometrede 1.0 ila 2.0 arasında bir optik yoğunluğa aşılayın. Hücreleri 25 santigrat derecede 10.000 g'da beş dakika santrifüjleyin. Hücreleri beş mililitre steril su ile iki kez yıkadıktan sonra, hücreleri 50 mililitre sferoplasti tamponunda tekrar süspanse edin.

50 mililitrelik kültürü 100 RPM ve 30 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin. 400 g'da ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjlemenin ardından, hücreleri beş mililitre stabilize lucine bırakma rafinoz ortamı ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri doğrudan GFP raportör tahlil ölçümleri için kullanmak üzere hücreleri aynı ortamın beş mililitresinde yeniden askıya alın.

Maya hücresi sferoplastlarını 96 oyuklu plakaya tohumlayın. Her bir oyuğa, negatif kontrolü içeren, boş vektörü veya saflaştırılmış RTA'yı beş mikromolar nihai RTA konsantrasyonunda ifade eden 70 mikrolitre stabilize lucine bırakma rafinoz ortamı ekleyin. Toplam hacimlerini 270 mikrolitreye çıkarmak için kalan kuyucukların her birine 70 mikrolitre stabilize lucine bırakma ortamı ekleyin.

Protein inhibisyonu için pozitif bir kontrol için, G418 mayada GFP ekspresyonunu önlediğinden, 70 mikrolitre 0.8 molar sorbitol stabilize G418 çözeltisi ekleyin. GFP ekspresyonunu indüklemek için hemen 30 mikrolitre stabilize galaktoz çözeltisi ekleyin. % 30 galaktoz yerine 30 mikrolitre stabilize lucine bırakma rafinoz ortamı ekleyerek ek bir negatif kontrol hazırlayın.

Numune hazırlamayı bitirdikten sonra, 96 oyuklu plakayı bir floresan okuyucuya koyun ve GFP floresan tespiti için gerekli olan 475, 509 nanometre filtre setini kullanarak ölçüme hazırlanın. 30 dakikalık ölçüm aralıklarıyla 20 saatlik bir zaman penceresi boyunca 120 santigrat derece, 10 RPM ve bir milimetre sallama çapında ölçümler yapın. Burada, RTA'nın afinite kromatografisinin ve boş vektör kontrolünün temsili bir saflaştırma grafiği gösterilmektedir.

Kara kutudaki mavi tepe, bağlı RTA kesrini temsil eder. Kara kutuda gösterildiği gibi, negatif kontroldeki kolondan hiçbir protein kaçmaz. Burada, afinite saflaştırılmış bir RTA fraksiyonunun tuzdan arındırma diyagramı gösterilmektedir.

Diyagram, RTA protein fraksiyonunun ve tuz fraksiyonunun ayrılmasını göstermektedir. Başarılı saflaştırma ve tuzdan arındırma işleminden sonra Coomassie boyama sonuçları, farklı RTA varyantlarının hücre lizatını veya saflaştırılmış örneklerini gösterir. Bu çalışmada modifiye edilmemiş RTA kullanılmıştır.

Floresan aralıklı raportör testini doğrulamak için, yabani tip maya sferoplastlarının nispi GFP floresansı, 20 saatlik GFP indüksiyonundan sonra indüklenmiş ve indüklenmemiş koşullar altında ölçüldü. Bağıl GFP floresansı ayrıca RTA, G418 veya negatif kontrol varlığında da analiz edildi. Bağıl GFP floresansı, karşılık gelen proteinlerin mayada RTA trafiğine dahil olduğu ve dahil olmadığı bilinen seçilmiş mutantlar için de ölçüldü.

Noktalı çizgi bir anlamlılık eşiğini temsil ediyordu. RTA ekspresyonu ve saflaştırılmasına hakim olduktan sonra, floresan raporu tahlilinin sonuçları bir gün içinde alınabilir. Ek olarak, bu yöntem, B toksinlerinin ribozomu inaktive edilmesi alanındaki araştırmacıların, ökaryotik bir model organizma mayasındaki zehirlenme köklerini incelemelerinin yolunu açmaktadır.