Kolesterol parçacıkları morfolojisi oransal olarak Lipid düşürücü ilaçlar farklı etkileri

Bu çalışmanın genel amacı, lipid düşürücü ilaçların kolesterol partiküllerinin morfolojik özelliklerini bir plak dizisi yöntemi kullanarak modüle etmedeki etkisini değerlendirmek ve ateroskleroz tanısı ve ilaç etkilerini belirlemek için potansiyel biyobelirteçleri belirlemektir. Lipid düşürücü ilaçların kolesterol partikül oluşumunu modüle etmedeki rolü tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, lipid düşürücü ilaçların, kolesterol partikül oluşumunun profillerini ve morfolojik özelliklerini değiştirmede doğrudan bir rol oynadığını gösteriyoruz.

Plak dizisi tabanlı in vitro görüntüleme yönteminin diğer partikül tespit yöntemlerine göre en büyük avantajı, serum içinde lipid düşürücü ilaçların etkisini değerlendirmek için kolesterol partiküllerinin görüntülenmesine olanak sağlamasıdır. Plaxgen'in laboratuvar teknisyeni Jason Lundry, bir kimya analizörü kullanarak plak dizisi testini nasıl kurduğumuzu gösterecek. Millipore Sigma'da kıdemli bilim adamı olan Raymond Kong, görüntüleme akışı sitometrisini kullanarak numune işlemeyi nasıl yaptığımızı gösterecek.

Son olarak, Plaxgen laboratuvar teknisyeni David Liu, kolesterol parçacık görüntüleri için veri analizini gösterecek. Kolesterol partikülü oluşumu için plak dizisi testini ayarlamak için bir kimya analizörü-1 kullanın. Tahlil boyunca, her bir oyuktaki son reaksiyon hacmini 200 mikrolitrede tutun ve tüm tahlilleri üç nüsha halinde gerçekleştirin.

İlk olarak, yuvarlak tabanlı, düşük protein bağlayıcı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 194 nokta beş mikrolitre fosfat tamponlu salin veya PDS yükleyin. Her bir oyuğa, her bir lipit düşürücü ilaç çözeltisinden iki nokta beş mikrolitre ekleyin, negatif kontrol örneklerine ilaç eklenmez. Ardından, ilacı çözeltiye eşit şekilde karıştırmak için kimya analizörü-1 reaksiyon plakasına yerleştirerek plakayı 30 saniye çalkalayın.

Son olarak, her oyuğa iki mikrolitre floresan etiketli kolesterol agrega çözeltisi ekleyin. Plakayı daha önce olduğu gibi kimya analizörü-30 reaksiyon plakasına yerleştirerek 1 saniye çalkalayın. Ardından, plakayı 37 santigrat derece ve 200 rpm'ye ayarlanmış iki saat boyunca bir laboratuvar çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, akış sitometrisini görüntüleyerek parçacıkların görüntülerini elde edin. Doğru cihaz ayarlarını yüklemek için veri toplama şablonunu açın. Dosya'ya tıklayın, ardından Şablonu Yükle'yi seçin ve şablon dosyasını seçin.

Cihazı numune yüklemeye hazırlamak için Yükle'ye tıklayın. Örnek Yükle iletişim kutusu açıldığında, 50 mikrolitre örneği görüntüleme akış sitometresine yüklemek için Tamam'a tıklayın. Parçacıklar görüntüleme alanında gerçek zamanlı olarak görülene kadar bekleyin.

Görüntüleme alanındaki parçacıklar iyi odaklandığında, karanlık alan, parlak alan, yeşil floresan ve sarı floresan için her nesnenin görüntülerini aynı anda yüksek verimli bir şekilde almak için Al'a tıklayın. Alımın sonunda, numuneyi iade etmek için İade Et düğmesine tıklayın. Her numuneden 5.000 ila 10.000 parçacık elde etmek için bu adımları tekrarlayın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi nesne floresan yoğunluğunu ve morfolojik varyasyonlarını belirlemek için görüntü analiz yazılımını kullanarak tüm ham görüntü dosyalarını analiz edin. Oyuk başına 200 mikrolitrelik bir son reaksiyon hacmi kullanarak, reaktifleri kademeli olarak yükleyerek yuvarlak tabanlı düşük protein bağlayıcı 96 oyuklu bir plaka hazırlayın. İlk önce kontrol kuyularını hazırlayın.

Her kuyucuğa 193 mikrolitre PBS yükleyin. Hasta serumunun% 2.5'ini ekleyin, kuyucuk başına sadece bir serum örneği yükleyin. Ardından, kimya analizörü reaksiyon plakasına yerleştirerek plakayı 30 saniye çalkalayın.

Daha sonra, her bir oyuğa iki mikrolitre floresan etiketli kolesterol agrega çözeltisi ekleyin. Yine plakayı kimya analizörü-1 reaksiyon plakasına yerleştirerek 30 saniye çalkalayın. Kuyuları ilaçlarla hazırlamak için, her kuyucuğa 191 mikrolitre PBS yükleyin.

Daha sonra, her hasta serumunun% 2.5'ini ekleyin ve plakayı bir kimya analizörü-1 reaksiyon plakasına yerleştirerek 30 saniye boyunca çalkalayın. Negatif kontrol kuyuları dışındaki tüm kuyucuklara iki mikrolitre ezetimib, lovastatin, simvastatin veya niasin çözeltisi ekleyin. Kuyucuk başına sadece bir ilaç eklemek.

Plakayı daha önce olduğu gibi 30 saniye sallamaya devam edin. Daha sonra, plakayı 30 saniye çalkalamadan önce her bir oyuğa iki mikrolitre floresan etiketli kolesterol agrega çözeltisi ekleyin. Ardından, plakayı 37 santigrat derece ve 200 rpm'ye ayarlanmış bir laboratuvar çalkalayıcıda iki saat inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, daha önce olduğu gibi aynı ayarları izleyerek akış sitometrisini görüntüleyerek numuneleri alın. Metin protokolünde açıklandığı gibi tüm görüntü dosyalarını toplu olarak işlemek için görüntü analiz yazılımını kullanın. Burada, enzimatik olmayan bir mekanizma ile statinler tarafından indüklenen küresel ve doğrusal iplik şekilli kolesterol partiküllerinin tanımlanmasını gösteren temsili sonuçlar gösterilmiştir.

Diğer lipid düşürücü ilaçlar tarafından indüklenen kolesterol partikül oluşumunun iki farklı morfolojisinin doğrulanması gösterilmiştir. Ezetimib, niasin, fibrat ve omega-3 yağ asidi dahil. Burada, X ekseninin yeşil floresan kanalında tespit edilen kolesterol parçacıklarının bir spektrumunu gösterdiği nokta grafikleri gösterilmiştir.

Ve Y ekseni yan saçılmayı gösterir, geçit, floresan nokta grafiklerinde tespit edilen çok düşük yoğunluklu lipo-protein, düşük yoğunluklu lipoprotein ve yüksek yoğunluklu lipoprotein parçacıklarının bölgelerini gösterir. Bu sonuçlar, lipid düşürücü etkinin, ilaç, ezemid, lovastatin, simvastatin ve niasin varlığında saflaştırılmış VLDL ve LDL kolesterol partiküllerinin profillerini nasıl değiştirdiğini göstermektedir. Burada, VLDL, LDL ve HDL kolesterol partikül oluşumunun profillerini modüle eden çeşitli lipid düşürücü ilaçların diferansiyel etkisinin tanımlanması için üç farklı serum örneğinin bir ekranı gösterilmektedir.

Bu profiller, üç farklı serum örneği arasındaki yanıt seviyelerinde de bir değişiklik olduğunu göstermektedir. İlaç olmadan ve çeşitli lipid düşürücü ilaçların varlığında oluşan küresel ve doğrusal şekilli kolesterol partikülleri için serum numunesi bir'in taranması, hem küresel hem de doğrusal iplik şekilleri gösteren serum türevli kolesterol partiküllerinin iki farklı morfolojisini doğrular. Bu nedenle, kolesterol partikül oluşumu ve klinik önemi ile ilişkiyi modüle eden lipid düşürücü ilaç etkisinin tanımlanması için bir in vitro görüntüleme yaklaşımını başarıyla gösterdik.

Ön sonuçlarımız umut vericidir ve büyük ölçekli klinik örnekler kullanarak bu plak dizisi testini daha fazla doğrulama sürecindeyiz. Standart lipid paneliniz serumdaki LDL ve HDL kolesterol seviyelerini ölçer. Plak dizisi testimiz, ateroskleroz riskinin doğruluğunu artırmayı umuyor ve serum kullanarak lipid düşürücü ilaç yanıtını tahmin ediyor.