Name: Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Öğrenin, tek molekül floresans in situ hibridizasyon deneyleri için Escherichia coli hücrelerindeki bireysel mRNA transkriptlerini floresan işaretli DNA problarıyla etiketleme yöntemini. Bu teknik, transkripsiyonel süreçlerin hücreden hücreye değişkenliğini incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser bir İsrail Bilim Vakfı Hibe 514415 (js) ve bir BSF-NSF (MCB) hibe 2016707 (js) tarafından desteklenmiştir. Destek Siegfried ve Irma Ullman ne bağlı elektrikli sandalyeye (js) da kabul edilmektedir.

1. sonda tasarım
Not: Bu protokol piyasada bulunan Oligonükleotid probları zaten fluorophores ile öğesini kullanır. Sondalar belirli dizileri bir hedef için tamamlayıcı bir dizi oluşur mRNA, floresan molekülünü Birleşik her sonda. Alternatif olarak, başka bir yerde5,16açıklandığı gibi probları için floresan işaretleri eklemek mümkündür.
<ol>
	<li>Tasarım smFISH sondalar Arjun Raj (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); tarafından geliştirilen Probe Tasarımcısı16 algoritması kullanılarak Bu el yazması kullanılan smFISH sondalar dizisi malzemeleri tabloda listelenir. Not: Minimum algılanabilir sinyal için bir küme probları ~ 30 sayısıdır. Özellikle çok kısa transkript ölçülür Eğer hassas numarası faiz, gen göre değişebilir.</li>
	<li>Optik kurulum uygun bir boya seçin (malzemelerin tabloya bakın). Not: Cy3 boya veya düşük bir fotoğraf beyazlatma duyarlılık ile optik eşdeğer bir boya önerilir. Çift etiketleme için bir Cy5 ya da bir optik eşdeğer adaydır boya (malzemelerin tabloya bakın). Fırtına görüntüleme etiketli mRNA uygun boyaları kapasitelerini Floresans emisyon birden fazla döngüleri için karakterizedir. Bazı smFISH boya kullanılabilir fırtına görüntüleme için (malzeme tabloya bakın). İki (veya daha fazla) Tutanaklar aynı hücrede farklı genler karşılık gelen görüntü biri olan spectra az veya hiç çakışma var boyalar için Birleşik Oligonükleotid probları seçmelisiniz.</li>
</ol>
2. reaktif hazırlık
Not: Filtre uygulanmış pipet ipuçları ve tüpler gibi RNase free sarf malzemeleri kullanarak örnekleri RNAse free tutmak için ve herhangi bir çalışma ortamı temiz tutmak için önemlidir. Hedef transkript bozulma önlemek için hücre fiksasyon kullanılan tüm reaktifler nükleaz ücretsiz olması gerekir (malzemelerin tabloya bakın) veya diethylpyrocarbonate (DEPC)-tedavi ve sterilize.
<ol>
	<li>Arabellekleri için smFISH
	<ol>
		<li>1 x PBS (fosfat tamponlu tuz, bir fosfat tampon konsantrasyonu 0.01 M ve Sodyum Klorür konsantrasyon 0.154 m, (pH 7,4) ile çözüm) RNase free hazır olun. 10 x PBS RNase free seyreltik (malzemelerin tabloya bakın) nükleaz-serbest su (malzemelerin tabloya bakın) 1:10, v/v oranı.<ol>
			<li>Alternatif olarak DEPC tedavi 1 hazırlamak PBS x.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>RNase free hazırlamak 2 x SSC (serum sodyum sitrat arabellek, 0,03 M sodyum sitrat, (pH 7,0) 0.3 M NaCl). RNase free seyreltik 20 x SSC (malzemelerin tabloya bakın) nükleaz ücretsiz su 1:10 v/v oranı.<ol>
			<li>Alternatif olarak, DEPC tedavi 2 hazırlamak x SSC.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oligonükleotid sonda hisse senedi çözüm.
	<ol>
		<li>Bir sonda hazır 25 µM. oluşturmak için TE arabelleği (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 200 µL kurutulmuş Oligonükleotid sonda grubunda yeniden dağıtılması Mix de tarafından yukarı ve aşağı, pipetting ve sonra girdap ve santrifüj kısaca.</li>
		<li>Donma ve hisse senedi çözüm tüp tezcan önlemek için karşılık gelen tutarı çalıştırmak tek bir deneysel kullanılacak beklenen stok çözümün birkaç aliquots edin. -20 ° c veya daha düşük stok çözüm depolamak ve ışıktan korumak. Not: 250 hibridizasyon reaksiyonlar 5 nmol sonda kümesi sağlar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hibridizasyon arabellek (aşağıdaki Skinner vd. 7 ):
	<ol>
		<li>5 mL su nükleaz ücretsiz 50 mL polipropilen alt konik tüp ekleyin. Dextran sülfat 1 g için su ekleyin ve dinç vortexing tarafından çözülür. Kadar kabarcıklar (~ 30 min) ortadan içeriği bir orbital shaker karıştırın.</li>
		<li>Deiyonize suyla formamide, E. coli tRNA, 10 mg çözüm 3,530 µL 20 SSC x 1 mL, 100 µL 200 mM vanadyl-ribonucleoside kompleks ve 50 mg/ml BSA 40 µL ekleyin. Homojen olana son hacim için 10 mL DEPC tedavi su veya su nükleaz-Alerjik ve girdap eklenmesi tarafından çözüm getirin. Not: donma ve erime çözüm önlemek için karşılık gelen tutarı çalıştırmak tek bir deneysel kullanılacak beklenen stok çözümün birkaç aliquots olun. Mağaza-20 ° C'de hisse senedi çözüm Şişeyi açmadan önce oda sıcaklığına kadar sıcak formamide bildirin emin olun. Arka plan azaltmak için en uygun formamide konsantrasyonu (% 10-40 hacmen oranı) kalibre için önerilmektedir. 
		Uyarı: UYARI! Formamide çok zehirli ve bilinen bir teratogen. Gözleri ya da deri, solunum veya sindirim ile temasından sakının. Bir duman başlık altında koruyucu eldiven ve önlük giyerken başa.</li>
		<li>Çözüm 0,22-µm filtreden geçirilerek sterilize. Aliquots içinde tutmak ve bir yıl için-20 ° C depolama yapar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 x PBS'ye % 37 formaldehit (v/v) ekleyerek fiksasyon arabellek (1 x PBS % 4.6 formaldehit) hazırlamak (bkz. 2.1.1) 1:8 v/v oranı ve girdap. DİKKAT: UYARI! Formaldehit çok zehirli ve bilinen bir kanserojen. Bir duman başlık altında koruyucu eldiven ve önlük giyerken başa.</li>
	<li>SmFISH için yıkama arabellek hazırlamak (% 20 formamide 2 x SSC) 2'ye deiyonize suyla formamide ekleyerek x SSC (bkz: 2.1.2) 1:4 v/v oranı ve girdap.</li>
	<li>Görüntüleme arabellek arabellek yıkamak için 5 mM cysteamine ve oksijen gidericiler (7 µM glikoz oksidaz, 56 nM katalaz ve % 10 glikoz (w/v)) ekleyerek smFISH için hazırlamak (% 20 formamide 2 x SSC)</li>
	<li>Fırtına arabellekleri
	<ol>
		<li>Arabellek A 50 mM Tris-HCl ve 10 mM NaCl nükleaz ücretsiz su ekleyerek hazırlayın. Not: RT yıl boyunca dükkanda.</li>
		<li>Arabellek B 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl ve % 10 w/v ekleyerek glikoz nükleaz ücretsiz su için hazırlayın. Not: Mağaza 4 ° C'de için bir yıl kadar.</li>
		<li>MEA arabellek 77 mg cysteamine 1 ml (1 M çözüm sağlar) arabelleği A çözülerek hazırlayın. Not: Bu 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.</li>
		<li>Gloxy arabellek 8,440 AU (rasgele adet) glikoz oksidaz ekleyerek hazırlamak ve 1 ml 70,200 AU katalaz tampon A. Not: 50 x hisse senedi çözüm, yapar o-ebilmek var olmak stok 4 ° C'de 1 ay için.</li>
		<li>MEA arabellek ve 1 Gloxy arabellek arabellek B. x 50 mM ekleyerek fırtına için görüntüleme arabellek hazırlamak Not: Görüntüleme arabellek fırtına için 5 mM cysteamine, oksijen gidericiler (7 µM glikoz oksidaz ve 56 nM katalaz) 50 mm Tris ile 10 mM NaCl ve % 10 glikoz pH 8.0 oluşur. Sadece görüntüleme önce hazırlamak, saklanır ve RT yaklaşık 2 saat için kullanılır.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. örnek fiksasyon
<ol>
	<li>Bakteri hücreleri (örneğin, E. büyümek</li></ol>coli MG1655) büyüme medya seçimi (örneğin, LB orta) gecede inan orbital shaker 260 devir/dakika ve 37 ° c Not: arka plan sondalar non-spesifik bağlanması nedeniyle belirlemek için faiz gen silinmiş bir yük ölçümlerde, (bkz: şekil 1 ve ΔsodB içinde Δgalk aynı yordamı yapılmalıdır Şekil 2).
	<li>Gecede kültür 1: taze ortamda 100 sulandırmak ve optik yoğunluğu (OD600) bir Spektrofotometre 0,2 - değeri kadar her ~ 1 h ölçü birimi 0.4; 4 mL kültür-meli var olmak yeterli. Not: Seçilen mikroskop faz kontrast veya fark girişim kontrast yetenekleri varsa, E. coli dış membran 2 mikron lipofilik floresan marker ile Etiketlenmiş (malzemelerin tabloya bakınız), hangi eklenmektedir Bakteriyel süspansiyon 20 dk önce fiksasyon17. Fiksasyon ve daha ileri tedavi aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirilir. Bir farklı emisyon spektral örtüşme etiketli-sonda seti ile en aza indirmek için spektrum, sahip bir floresan işaretçisi seçmeye özen göstermelidir.</li>
	<li>Pelet hücreleri tarafından Santrifüjü 4 ° C'de 4500 g de 5 min için Süpernatant tüm tüpler kaldırın.</li>
	<li>1 mL 1 x PBS için her tüpün ekleyin ve hücre-hücre toplama en aza indirmek için Pelet resuspend. Sonra yavaşça fiksasyon tampon ve girdap 4 mL ekleyin.</li>
	<li>24 ° C'de 30 min için bir orbital Çalkalayıcı-260 devirde örneklerinde kuluçkaya</li>
	<li>Pelet hücreleri tarafından Santrifüjü 10 dk, 1000 g, 4 ° C. Süpernatant kaldırın. 1 mL 1 x PBS ekleyin.</li>
	<li>Süspansiyonlar (malzemelerin tabloya bakın) 1.8 µL alt konik mikro-santrifüj tüpleri için aktarmak ve iki kere 3,6 adımı yineleyin.</li>

4. örnek Permeabilization
<ol>
	<li>Süpernatant çok dikkatli bir şekilde çıkarın. Küçük hacimli Pipetler, gerekirse, pelet dışında tüm sıvı kaldırmak kullanın.</li>
	<li>300 µL DEPC tedavi su veya su nükleaz ücretsiz resuspend. 350 µL yüksek dereceli mutlak etanol (% 99) ekleyin ve karışımı yavaşça tüp ters çevirme. Etanol ve mix yeniden, son etanol konsantrasyonu % 70 (v/v oranı) ulaşmak için başka bir 350 µL ekleyin. DİKKAT: UYARI! Etanol yanıcı.</li>
	<li>Örnek 20 rpm (RT) oda sıcaklığında 1 h için bir tüp rotator ile döndürme, veya bir gece 4 ° C'de. Örnekleri 4 ° C'de bir haftaya saklanabilir.</li>
</ol>
5. hibridizasyon
<ol>
	<li>Pelet hücreleri tarafından Santrifüjü 7 dk, 750 x g, 4 ° C. Süpernatant kaldırın.</li>
	<li>1 mL % 20 örnekleri arabelleğe yıkama ve ayakta birkaç dakika veya pipet Pelet tamamen erimesi için bırakın ekleyin.</li>
	<li>Pelet hücreleri Santrifüjü için 750 x g, 4 ° c de 7 min tarafından</li>
	<li>Süpernatant çok yavaşça pipetting tarafından çıkarın. Küçük hacimli Pipetler gerekirse, pelet dışında tüm sıvı kaldırmak kullanın.</li>
	<li>Oligonükleotid sonda ayarla hisse senedi çözüm hibridizasyon arabellek aliquot böylece son Oligonükleotid konsantrasyon 250 eklemek nM; girdap şiddetle. Not: Bir iki veya daha fazla farklı hedef mRNA'ların aynı hücrede aynı anda etiketleyebilirsiniz. Her iki hedef grupları sonda hibridizasyon arabelleğe ekleyin. Boyalar farklı emisyon spektral örtüşme (örneğin, Cy3 ve Cy5) en aza indirmek için spectra sahip seçmek için özen göstermelidir. Fırtına görüntüleme için amaçlanan örnekleri ayarla (örneğin, tablo malzemelerin) fırtına için uygun bir boya ile konjuge bir Oligonükleotid sonda ile melezleşmiştir emin olun.</li>
	<li>(Bkz. Adım 5,4) örnekleri (çözüm oldukça viskoz) kabarcıklar nesil kaçınırken Oligonükleotid probları içeren 50 µL hibridizasyon arabelleği askıya.</li>
	<li>Örnekleri gece karanlıkta 30 ° C sıcak bir blok üzerinde bırakın. Not: Bu örnekleri 6 ay 4 ° C'de depolanmış olabilir</li>
</ol>
6. çamaşır
<ol>
	<li>Görüntü için her örnek için bir yeni microcentrifuge tüp kullanın. 1 mL yıkama arabellek ekleyin.</li>
	<li>10-15 µL melezleşmiştir örneklerinden yıkama tamponu ve mix/girdap içeren yeni tüp ekleyin.</li>
	<li>Pelet hücreleri tarafından 7 dakika aralıklarla, 750 x g 4 ° C'de Süpernatant kaldırın. Not: arka plan azaltmak için 30 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
	<li>İki kez daha fazla yıkamak (1 mL yıkama arabellekte resuspend, santrifüj kapasitesi ve Pelet kaldırın).</li>
	<li>25 µL yıkama arabellekte resuspend. Not: bir fotoğraf beyazlatma azaltmak için yıkama arabelleğe tek molekül Floresans deneyler6boya kararlılığını artırmak için sistem (2,6) atma bir oksijen ekleyebilirsiniz.</li>
</ol>
7. görüntüleme için örnek hazırlanması
Not: Hücreleri floresan ve faz kontrast mikroskop altında uygun görüntüleme izni vermesi için immobilize gerekir. Hangi bakış farklı alanları farklı odak uçaklar yansıma örnekleri hazırlamak için aşağıdaki yöntemleri kullanılabilir.
<ol>
	<li>Özel jel hazırlık
	<ol>
		<li>150 mg özel 10 mL 2 x SSC arabelleğe ekleyin. 2 eklemek değil x SSC için özel, ya da o değil düzgün dağıtılması.</li>
		<li>Mikrodalga fırında 10-15 s her zaman-e kadar büyük kabarcıklar oluşmaya başlar. Birkaç dakika soğuması için bir kenara koyun.</li>
		<li>Böylece slaytın Merkezi maruz kalır ayıran bir silikon çerçeve slayt üzerinde yer.</li>
		<li>Bir 10 mm çapında (1-2 mm kalınlığında) katı halka slaytın ortasına yerleştirin ve jel küçük bir miktar, sızdırmazlık için mevduat. Sertleşmesine o için birkaç dakika bekleyin.</li>
		<li>Yüksek kubbe şekli kurdu kadar daha jöle ekleyin. Sertleşmesine bunun için 10 dakika bekleyin ve (iyi cımbız veya başka bir yöntemi kullanarak) yüzük kaldırın.</li>
		<li>(Bkz: 6.5) yıkanmış bakteriyel hücre jel ve mühür #0 coverslip slayt ile ~ 10 μL Kasası.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odası numune hazırlama smFISH için
	<ol>
		<li>Alternatif olarak (için adım 7.1) örnekleri (bkz: 6.5) yıkanmış bakteri hücreleri Poli-D-lizin-kaplı cam alt tek kullanımlık plastik petri yemekleri immobilizing tarafından görüntüleme için hazır olun.</li>
		<li>Karanlık gecede görselleştirme hücre yüzeyine yapışma sağlamak için önce oda sıcaklığında örneklerinde kuluçkaya. Görselleştirme daha önce bir kez yıkama arabellek ile yıkayın (. 5); smFISH (2,6) için yıkama buffer(2.5) veya görüntüleme arabellek ile ıslak örnek tutmak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fırtına için odası numune hazırlama
	<ol>
		<li>Örnekleri fırtına için Poli-D-lizin-kaplı cam alt tek kullanımlık plastik petri yemekler üzerinde görüntüleme için hazır olun.</li>
		<li>Örnekleri, RT, karanlık gecede kuluçkaya. Görselleştirme yıkama daha önce bir kez ile yıkama arabellek için smFISH (2.5); ve görüntüleme arabellek fırtına (2.7.5) ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8.Transkript görselleştirme
<ol>
	<li>Görüntü hücre motorlu bir sahne ile donatılmış geniş alanlı floresan mikroskop ile (malzemelerin tabloya bakın). Not: Bir boya ile floresan emisyon birden fazla döngüleri yetenekli etiketli hücreleri fırtına değiştirilmek üzere kullanın. 3D süper çözünürlük görüntüleme sistemi kullanarak örnek resim (örneğin, malzemelerin tabloya bakın).</li>
	<li>(Önerilen) kullan bir 60-100 x N.A &#62; 1.3 yağı daldırma faz kontrast objektif lens cıva veya metal halide lamba; gibi güçlü bir ışık kaynağı ile LED tabanlı ışık kaynakları da önerilir.</li>
	<li>Bir standart soğutmalı CCD kamera, ideal olarak düşük ışık düzeyi görüntüleme hızı (biz kullanmak yerine bir kamera ile 16 µm piksel boyutu) için optimize edilmiş kullanımı (malzeme tabloya bakın). Not: Kullanım bir soğutulmuş EMCCD (elektron birleştiğinde şarj cihaz çarparak) kamera CCD kamera algılama, özellikle tek moleküllerin engeller termal gürültü azaltmak gereklidir.</li>
	<li>Filtresi kullan seçilen fluorophores için uygun ayarlar.</li>
	<li>Düzgün hücre sınırlarını belirlemek için her örnek faz kontrast optik ile veya dış hücre membran fluorescently etiketleme görünümünde farklı alanları görüntülerini elde etmek. Görüntüleri tüm kanallar için farklı odak uçaklar (z-yığın), (genellikle 13 dilimleri ayırarak tarafından 250 nm alınır). Not: Mikroskop ve filtre setleri, motorlu sahne ticari tarafından kontrol edilmelidir (malzemelerin tabloya bakın) ya da bir yığın görüntülerin sırayla yakalayabilir şirket içi bilgisayar yazılımı.</li>
</ol>
9. veri analizi
<ol>
	<li>Görüntü yığınları veri analizi için uygun bir biçime dönüştürme.</li>
	<li>Hedef kopya sayısını tahmin mRNA floresan foci hücrede toplam yoğunluğunu, yerine ayrık 'noktalar' şu anda mevcut diğer iletişim kuralları olduğu gibi sayma.</li>
	<li>Görüntü analizi ile açık kaynak yazılım18 veya özel olarak oluşturulmuş bir program ile yerine getirir. Veri ayrıntıları için bkz: görüntüleme ve analiz Skinner vd. 7</li>
</ol>

<ol><li>Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+Prog.+Phys%22%5BJournal%5D)">Noise in biology.</a> Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).</li>
<li>Arbel-Goren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+degradation+and+noise+of+small+RNA-controlled+genes+in+a+switch+activated+network+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).</li>
<li>Arbel-Goren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+post-transcriptional+regulation+on+phenotypic+noise+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).</li>
<li>van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Spatial+Organization+of+mRNA%2C+Plasmids%2C+and+Ribosomes+in+a+Bacterial+Host+Overexpressing+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins.</a> PLOS Genet. 12 (12), e1006523(2016).</li>
<li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).</li>
<li>Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li>
<li>Barakat, T. S., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+DNA-RNA+fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+to+study+X+chromosome+inactivation+in+differentiated+female+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells.</a> J. Vis. Exp. (88), e51628(2014).</li>
<li>Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+imaging.+Spatially+resolved%2C+highly+multiplexed+RNA+profiling+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells.</a> Science. 348 (6233), aaa6090(2015).</li>
<li>van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+messengers%3A+An+update+and+outlook+on+RNA+visualization+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria.</a> Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).</li>
<li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li>
<li>Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+shapes+the+turnover+of+a+bacterial+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome.</a> Elife. 5, 1-22 (2016).</li>
<li>Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Imaging+of+Endogenous+mRNA+Using+RNA-Based+Fluorescence+%22Turn-On%22+Probe%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe.</a> ACS Chem. Biol. , (2016).</li>
<li>Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+kinetics+of+gene+activity+in+individual+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria.</a> Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).</li>
<li>Golding, I., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8+Spatiotemporal+Dynamics+in+Bacterial+Cells%3A+Real-Time+Studies+with+Single-Event+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution.</a> Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).</li>
<li>So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).</li>
<li>Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+Escherichia+coli+nucleoids+reveals+highly+structured+and+asymmetric+segregation+during+fast+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth.</a> J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).</li>
<li>Sliusarenko, O. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/store/10.1111/j.1365-2958.2011.07579.x/asset/j.1365-2958.2011.07579.x.pdf?v=1&t=j60xj2a2&s=d100b2a0951afb9e2333f2b49655db78ab4e282e">Microbetracker software.</a> Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 8(2006).</li>
<li>Arbel-Goren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+degradation+and+noise+of+small+RNA-controlled+genes+in+a+switch+activated+network+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).</li>
<li>Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272811000909/pdfft?md5=6d05a9738e887934c944928bf6182e5c&pid=1-s2.0-S0005272811000909-main.pdf">A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

E. coli hücrelerdeki smFISH yöntem2kullanarak farklı genler transkript sayısı bizim laboratuvar olarak ölçülen var. Kısacası, bu yordamı aşağıdaki adımlardan oluşur: hücre fiksasyon, membranlar sonda penetrasyon için izin vermek için permeabilization sonda hibridizasyon ve örnek bir standart floresan mikroskop kullanarak görüntüleme. Bu yordam önceden yayınlanmış olanlar bazı değişiklikler6,7,16i...

Stochasticity gen ifadesinin temel ve kaçınılmaz bir unsuru ve hücre-hücre heterojenite1, transkriptler ve proteinler2,3düzeyinde hem de açmaktadır. İyi tanımlanmış koşullar altında hücreler arasında değişkenlik miktarının benzersiz bir pencere gen ekspresyonu ve onun yönetmelik altında yatan temel işlemleri halinde sunmaktadır. Bakterilerde hücre-hücre heterojen bir önemli kaynağı transkripsiyon düzeyinde gerçekleşir. Transkript numaraları sadece stochasticity transkripsiyonu, aynı zamanda düzenleme gibi çoğu işlemleri nedeniyle küçük RNA'ların ve RNAases2tarafından değişir. Doğrudan erişim Bu heterojenlik nicel bir moda bir fluorescently smFISH içinde belirli bir gen bireysel Tutanaklar etiketleyerek yoludur. Bu metodoloji algılama ve belirli RNA molekülleri, hücre altı yerelleştirme sabit, bireysel bakteri hücreleri4sağlar. mRNA'ların seçmeli olarak faiz5,6transkript bağlamak için tasarlanmış fluorescently etiketli ~ 20 Bankası-uzun oligonucleotides bir dizi melezleşmiştir. Birden çok etiket yukarıda arka plan Floresans algılama sağlar ve bireysel mRNA molekülleri kırınım-sınırlı noktalar bir floresan mikroskop altında7 (bkz: şekil 1) olarak görünür. MRNA molekülleri, tamamlayıcı oligomer probları ikincil fluorescently etiketli muhabir teknikleri8kullanarak algılanır konjuge anhidridler (örneğin, biotin veya digoxigenin) taşımak etiketleme için diğer yaklaşım vardır.
Tutanaklar, ek olarak smFISH hakkında kantitatif bilgi başka yöntemleri de vardır. Kuzey gibi bazı leke veya kantitatif PCR, toplu yoklama ve böylece ne mRNA kopya sayısı ne de tek tek hücreler içindeki konumlarını ölçebilirsiniz. Bu nedenle bu yöntemler hücre hücre değişkenlik ölçmek uygun değildir. Hata-sağlam Floresans in situ hibridizasyon (MERFISH) hem RNA'ların kopya numarası hücrelerindeki hem de denilen hücre içi konumlarını miktar multiplexed için izin veren bir son görüntü tabanlı teknik geliştirilmiştir. MERFISH tanımlanmış bir arada sabit sayıda Oligonükleotid fluorescently etiketli sonda gelen oluşan benzersiz bir barkod atama temel alır. Bu barkodları smFISH ölçümleri sıralı tur olarak okunduğu, photobleaching ile hibridizasyon, böylece artan işlem hacmi iki büyüklük9,10tarafından aşağıdaki her yuvarlak. Bu teknik bir otomatik akışkan sistemi ve sonda kümesinin uygun tasarım gerektirir.
Birden çok floresan Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)11gibi roman süper çözümleme teknikleri ile birlikte bireysel transkript etiketlerine göre ile birlikte çözünürlükte panolarında bir artış sağlar transkript hücre altı lokalizasyonu. FIRTINADA, Floresans emisyon (yanıp sönen) prob molekül başına birden fazla döngüleri için uygun kombinasyonu floresan problar ve görüntüleme arabellek sağlar. Fırtına da E. coli transcriptome görüntü ve aynı anda transkriptlerinizin faiz12etiketleme tarafından RNA, genom çapında mekansal organizasyonu gözlemlemek için kullanılabilir.
Yukarıda gözden tüm tek hücreli yöntemleri sabit hücrelerdeki transkript görüntüleme üzerinde temel alır. Bu nedenle, onlar transkript hücrelerdeki Kinetik özelliklerinin ile ilgili herhangi bir bilgi vermeyin. Transkript canlı hücreleri13izlemek için mRNA'ların ilgi siteleri bağlama, bir dizi gen füzyonu tarafından etiketli. Bu ikinci o zaman bakteriyofaj gibi yeşil flüoresan protein (GFP)10,14,15floresan bir protein için erimiş MS2 kat protein gibi bir RNA-bağlayıcı protein tarafından tanınır.
Burada DNA probları fluorescently etiketli smFISH deneyler, kullanmak için bir dizi bireysel mRNA'ların özellikle E. colietiketleme yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, aynı etiketleme şeması fırtına ölçümleri ile küçük değişiklikler için kullanılan gösterir.

<table><tbody><tr><td>Dekstran sülfat sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Saf Etanol, %99,5, ACS reaktifi, mutlak</td><td>Mallinckrodt Baker - Avantor</td><td>8025.25</td><td></td></tr><tr><td>Dietilpirokarbonat (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen 20X SSC</td><td>Yaşam Teknolojileri/Ambion</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen 10X PBS</td><td>Yaşam Teknolojileri/Ambion</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>TE tamponu (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, moleküler biyoloji için</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>nükleaz içermeyen su</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji için formaldehit çözeltisi, suda %36,5-38</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Deiyonize formamid, nükleaz içermez</td><td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>E. coli tRNA (ribonükleik asit, escherichia'dan transfer tipi xx)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753-500UN</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure BSA (50mg / ml)</td> <td>Thermo Fisher Scientific / Ambion</td><td>AM2616</td><td></td></tr><tr><td>Vanadil-ribonükleozit kompleksi, VRC, 200 mM</td><td>New England Biolab</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Sisteamin ve oksijen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>Aspergillus niger'den Glikoz Oksidaz, Tip VII, 50KU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-fukoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8150</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO Hücre Etiketleme Çözeltisi Ömrü</td><td> Teknolojiler</td><td>V2286</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz, düşük erime noktalı reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Yapıştırıcı silikon izolatör 24-2mm Çap X 1.8 mm derinlik JTR24R-A2-2.0</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A2-2.0<açıklık> < / açıklık>666208</td><td></td></tr><tr><td>poli-D-lizin kaplı cam alt Cam Alt Kültür Yemekleri</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Süper yaşam nitril pudrasız muayene eldivenleri</td><td>Supermax</td><td>TC-N-9889</td><td></td></tr><tr><td>Marka sterilizasyon inkübatör bandı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR61750</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri (1.8 ml)</td><td>Axygen - Corning Yaşam Bilimleri</td><td>MCT-175C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon yuvarlak tabanlı polipropilen tüpler (14 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Konik tabanlı santrifüj polipropilen tüpler (50 ml)</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler (Corning 5 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler (Corning 10 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler (Corning 25 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre küvetleri</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen pipet uçları 0,2 - 20 &mu; l</td><td>FroggaBio</td><td>FT20</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen pipet uçları 10 - 200 &mu; l</td><td>Axigene / corning</td><td>TF-200</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen pipet uçları 100 - 1000 &mu; l</td><td>FroggaBio</td><td>FT1000</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen pipet uçları 100 - 1000 &mu; l</td><td>Sorenson</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga tek kullanımlık 10 mL iğne G-21</td><td>Becton Dickinson, Biosciences</td><td>BD-309643</td><td></td></tr><tr><td>Minisart 0.2 um Şırınga Filtresi</td><td>Sartorius</td><td>16534 K</td><td></td></tr><tr><td>Nikon aletleri mikroskop tipi A daldırma yağı A, 8cc</td><td>Nikon</td><td>MXA20233</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları 76 x26, 3 "x1" x1mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>421-004ET</td><td></td></tr> <tr><td># 0 lamel slayt 24x60</td><td>Thermo Fisher Scientific/Menzel</td><td>BNBB024060A0</td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td>M.R.C</td><td>TOU-50</td><td></td></tr><tr><td>Sıcak blok</td><td>M.R.C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fried Electric Company</td><td>G-560-E Mikrosantrifüj</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Taşınabilir Pipet Yardımı XP2, Pipet Kontrol Cihazı</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-501-I</td><td></td></tr><tr><td>OD600 Bakteri Büyüme Oranları için Spektrofotometre DiluPhotometer</td><td>Midsci</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>iXon X3 EMCCD kamera</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td> </td></tr><tr><td>Eclipse Ti mikroskop</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td> </td></tr><tr><td>CFI plan apochromat DM 100X yağ objektif lambda PH-3 NA 1.45 WD 0.13</td><td>Nikon</td><td>MRD31905</td><td> </td></tr><tr><td>Filtre seti (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP</td><td>Nikon</td><td>49005</td><td> </td></tr><tr><td>Filtre seti (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P</td><td>Nikon</td><td>49009</td><td> </td></tr><tr><td>Nis-elements AR otomatik reaserch yazılımı</td><td>Nikon</td><td>MQS31000</td><td> </td></tr><tr><td>STORM mikroskobu</td><td>Vutara</td><td>SR-200</td><td> </td></tr><tr><td>NA 1.2 suya daldırma objektif<açıklık> </açıklık></td><td>Olympus</td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>SRX görüntü elde etme ve analiz yazılımı</td><td>Vutara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evolve 512 EMCCD kamera</td><td>Fotometri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stellaris&reg; FISH Probları, CAL Fluor ile Özel Test&reg; Kırmızı 590 Boya</td><td>Biyoarama Teknolojileri A.Ş</td>. <td>SMF-1083-5</td><td></td></tr><tr><td><galK mRNA için güçlü>Prob Dizisi: < / güçlü></td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttttttttttcagactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tagccaaatgcgttggcaaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctgaatggtgtgagtggcag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caccaatcaaattcacgcgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgaaaccgtcgttgtagtagtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgataatcaatcgcgcaggg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtggtgcacaactgatcacg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgcgaactttacggtcatc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gctgattttcataatcggct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcatcgagggaaaactcgtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gttttcatgtgcgacaatgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cacgccacgaacgtagttag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttacgcagttgcagatgttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tccagtgaagcggaagaact</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgctgcaatacggttccgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtccagcggcagatgataaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgaccgttaagcgcgatttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>agcctacaaactggttttct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcggaaattagctgatccat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>aaggcatgatctttcttgcc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cagtgagcggcaatcgatca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgggcatggaaactgctttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gatgatgacgacagccacac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gggtacgtttttgaagttactg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttgtattcgctgccaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggtttcgcactgttcacgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tggctgctggaagaaacgcg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttcaatggtgacatcacgca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>catgcgcaacaacagcgttgaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggcgttttcagtcagtatat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atacgtttcaggtcgccttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgagactccgccatcaactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>Gaaatcatcgcgcatagagg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caatttgcggcacggtgatt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttgacgatttctaccagagt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acctttgtcgccaatcacag</td> ggatçagcgcgacgatacag <td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atattgttcagcgagctt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtctctttaatacctgtttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctccttgtgatggtttacaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>Stellaris&reg; FISH Probları, Quaser Fluor ile Özel Test&reg; Kırmızı 670 Boya</td><td>Biyoarama Teknolojileri A.Ş</td>. <td>SMRNA için SMF-1083-5</td><td></td></tr><tr><td> Prob Dizisi: < / güçlü></td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttttttttttcagactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tagccaaatgcgttggcaaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctgaatggtgtgagtggcag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caccaatcaaattcacgcgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgaaaccgtcgttgtagtagtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgataatcaatcgcgcaggg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtggtgcacaactgatcacg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgcgaactttacggtcatc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gctgattttcataatcggct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcatcgagggaaaactcgtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gttttcatgtgcgacaatgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cacgccacgaacgtagttag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttacgcagttgcagatgttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tccagtgaagcggaagaact</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgctgcaatacggttccgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtccagcggcagatgataaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgaccgttaagcgcgatttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>agcctacaaactggttttct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcggaaattagctgatccat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>aaggcatgatctttcttgcc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cagtgagcggcaatcgatca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgggcatggaaactgctttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gatgatgacgacagccacac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gggtacgtttttgaagttactg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttgtattcgctgccaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggtttcgcactgttcacgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tggctgctggaagaaacgcg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttcaatggtgacatcacgca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>catgcgcaacaacagcgttgaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggcgttttcagtcagtatat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atacgtttcaggtcgccttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgagactccgccatcaactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>Gaaatcatcgcgcatagagg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caatttgcggcacggtgatt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttgacgatttctaccagagt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acctttgtcgccaatcacag</td> ggatçagcgcgacgatacag <td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atattgttcagcgagctt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtctctttaatacctgtttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctccttgtgatggtttaçäca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr></tbody></table>

transkript bireysel escherichia coli hücrelerdeki tek molekül floresans in situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Bir yöntem bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için sabit bakterilerde etiketleme için tanımlanır. smFISH mRNA kopya numarası ilgi genlerin hücre hücre değişkenlik ölçümü transkriptleri hücre altı konumunu sağlar. Ana adımları bakteriyel hücre kültürü fiksasyonu, hücre zarları permeabilization ve hedef transkript hibridizasyon setleri ile piyasada kısa Oligonükleotid fluorescently etiketli probları vardır. smFISH farklı floresan işaretleri arasında spektral örtüşme tarafından uygulanan sınırlamaları ile aynı hücrede birden çok gen transkript görüntüleme izin verebilirsiniz. Aşağıda resimli Protokolü tamamlanmasını takiben, hücreleri kolayca düşük yoğunluktaki floresan için uygun bir fotoğraf makinesi ile birleştiğinde bir mikroskop kullanarak yansıması. Bu görüntüler, segmentasyon faz kontrast kare veya hücre zarı boyama, elde edilen hücre dağılımları ile birlikte mRNA kopya numarası dağıtım örneği açık kaynak veya özel olarak yazılmış yazılım kullanarak hücre hesaplama sağlar. Burada açıklanan etiketleme yöntemi Ayrıca resmi transkript Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına) ile uygulanabilir.

Biz smFISH ölçümleri galK ve sodB transkript E. coli hücrelerdeki yürüttü. Transkript belirli dizileri için hedef sıra, floresan molekülünü Birleşik her sonda tamamlayıcı bir dizi melezleşmiştir (malzemelerin tabloya bakın). Floresan ve faz kontrast görüntüleri MG1655 vahşi-tip e.coli suşu (WT) veya bir JW0740 (Keio koleksiyon)19 galK silinmiş yük (ΔgalK) 2 mm D-fucose şekil 1A ve 1Bgösterili...

Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Bu protokolün genel amacı, tek moleküllü FiSH deneylerinde görselleştirme için floresan etiketli DNA probları için E.Coli'deki bireysel transkriptleri etiketlemektir. Bu yöntem, sistem biyolojisi alanındaki, transkriptlerin karakterizasyonu, örneğin ilgilenilen alanın hücreden hücreye yeteneği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hücre duvarı lokalizasyonunun transkriptlerinin yanı sıra.Bu tekniğin temel avantajı, transkripsiyonel süreçlerin istatistikleri hakkında miktarda bilgi sağlamasıdır. Protokole başlamak için, E.Coli MG1655'i gece boyunca bir orbital çalkalayıcıda 260 RPM ve 37 santigrat derecede LB ortamında büyütün. Ertesi gün, gece boyunca kültürü taze ortamda bir ila 100 arasında seyreltin ve optik yoğunluğunu bir spektrofotometrede 0,2 ila 0,4 değerine kadar ölçün.Daha sonra, hücreleri dört santigrat derecede 4.500 G'de beş dakika santrifüjleyerek peletleyin. Süpernatanı tüm tüplerden çıkarın. Her tüpe bir mililitre 1XPBS ekleyin ve hücreden hücreye agregasyonu en aza indirmek için peleti yeniden askıya alın.Sonra dört mililitre fiksasyon tamponu ekleyin ve tüpü hafifçe girdaplayın. Numuneleri bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin. Hücre görüntülemeyi engelleyebilecek hücreden hücreye agregasyonu en aza indirmek için peleti yeniden askıya alın.İnkübasyondan sonra, hücreleri peletleyin, süpernatanı çıkarın ve bir mililitre 1XPBS ekleyin. Süspansiyonları 1.8 mililitrelik konik tabanlı mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücreleri santrifüjleme ile peletleyin.Süpernatanı dikkatlice çıkararak bakteri geçirgenliğine başlayın. Pelet dışındaki tüm sıvıyı çıkarmak için küçük hacimli pipetler kullanın. Ardından, peleti 300 mikrolitre DEPC ile arıtılmış suda yeniden süspanse edin.350 mikrolitre yüksek dereceli mutlak etanol ekleyin ve tüpü ters çevirerek çözeltiyi hafifçe karıştırın. 350 mikrolitre daha etanol ekleyin ve tekrar karıştırın. Daha sonra numuneyi tüp döndürücü ile oda sıcaklığında bir saat boyunca 20 RPM'de döndürün.Hücreleri geçirgenlikten pellet haline getirin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı çıkarın. Numunelere bir mililitre %20 yıkama tamponu ekleyin.Onları birkaç dakika bekletin. Daha sonra, 750 G ve dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleme ile pelet hücreleri. Süpernatanı çok nazikçe çıkarın ve peletin dışındaki tüm sıvıyı çıkarmak için küçük hacimli pipetler kullanın.Daha sonra, oligonükleotid prob seti stok çözeltisini, nihai oligonükleotid konsantrasyonu 250 nanomolar olacak şekilde hibridizasyon tamponu alikotuna ekleyin ve tüpü kuvvetlice girdaplayın. Numuneleri, kabarcık oluşumunu önlerken, oligonükleotid problarını içeren 50 mikrolitre hibridizasyon tamponunda askıya alın. Numuneleri gece boyunca karanlıkta, 30 santigrat derecelik bir ısı bloğunda bırakın.Yıkamayı hazırlamak için, görüntülenecek her numune için yeni bir mikro santrifüj tüpü edinin. Her tüpe bir mililitre yıkama tamponu ekleyin. Hibritleştirilmiş numunelerden yıkama tamponunu içeren yeni tüpe 10 ila 15 mikrolitre ekleyin.Hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın. Numuneleri iki kez daha yıkayın.Peleti 25 mikrolitrelik yıkama tamponunda tekrar askıya alın. 10 mililitre 2X SSC tamponuna 150 miligram agaroz ekleyerek bir agaroz jeli hazırlayın. Agaroz tamamen eriyene kadar çözeltiyi her seferinde 10 ila 15 saniye mikrodalgada pişirin.Ardından tüpü birkaç dakika soğuması için bir kenara koyun. Ardından, slaytın merkezi açıkta kalacak şekilde slaytın üzerine ayırıcı bir silikon çerçeve yerleştirin. Sürgünün ortasına 10 milimetre genişliğinde, bir ila iki milimetre kalınlığında sert bir halka yerleştirin.Sızdırmazlık için merkeze az miktarda jel bırakın ve jelin sertleşmesi için birkaç dakika bekleyin. Daha sonra yüksek bir kubbe şekli oluşana kadar daha fazla jel ekleyin. Jelin sertleşmesi için yaklaşık 10 dakika bekleyin ve halkayı çıkarın.Jelin üzerine 10 mikrolitre yıkama bakteri hücresi koyun ve sıfır numaralı kapak kayma sürgüsü ile kapatın. Foto ağartmayı önlemek için numuneyi karanlıkta tutun. E.coli hücrelerinin smFiSH ölçümleri, değişken hücre dışı D-fukoz konsantrasyonlarına yanıt olarak galK indüksiyon seviyesini gösterir.Arka plan sinyali, galK silinmiş bir gerinim veya negatif kontrol olarak delta galK JW0740 ile gösterilir. Çoğu hücrede çok sayıda leke görülür. Bakteri kültürüne iki milimolar D-fukoz eklendiğinde tek veya birkaç galK transkriptine karşılık gelir.Oysa hücre dışı D-fukoz yokluğunda birkaç nokta görülür. Bu protokolün uygulanması için başka bir örnek, vahşi tipte veya JW1648 sodB silinmiş bir suşta smFiSH'nin floresan ve faz kontrast görüntüleri ile sodB geni tarafından sağlanır. Bu protokolle hazırlanan örnekler, hücredeki transkriptlerin doğru bir şekilde hassaslaştırılmasını sağlayan STORM kullanılarak da görüntülenebilir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sistem biyolojisi alanındaki araştırmacıların tek tek hücrelerdeki transkripsiyon olaylarının istatistiklerini keşfetmelerinin yolunu açtı.

method-for-labeling-transcripts-individual-escherichia-coli-cells-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Bu protokol, Flüoresans gerçekleştirmek için deneysel bir işlem...

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Burada doğrudan transfer RNA transfer RNA'ın göreli düzeyleri, ya da herhangi bir kısa diğer RNA, spike-in toplama göre farklı örnekleri arasında karşılaştırmak için bir yol yanı sıra arıtılmış Escherichia coli RNA düzeyleri şarj ölçmek için bir yöntem mevcut hücre başvurusu gen ifade.

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Bu tek molekül floresans in situ hibridizasyon Protokolü bitkisel büyüme ve mayoz sırasında RNA molekülleri mayası sayısını ölçmek için optimize edilmiştir.

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Mutagenesis site yönettiği belirli mutasyonların Deoksiribonükleik asit (DNA) tanıtmak için kullanılan bir tekniktir. Bu iletişim kuralı site yönettiği mutagenesis ile 2 adım nasıl açıklar ve ilgi herhangi bir DNA parçası geçerlidir yaklaşım 3 adımlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR) dayalı.

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Burada, karmaşık protein örnek tek molekül düzeyinde her protein türler için etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Bu protokol, mRNA sentezi ve bozulmasının in vivo kinetiklerini ölçmek için yerinde hibridizasyonda (smFISH) tek moleküllü floresan uygulamasını açıklar.

Situ Hibridizasyonda İki Renkli Tek Moleküllü Floresan Kullanarak Escherichia coli'de Uzay ve Zamanda MRNA KinetikLerini Sondalama

Tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH), belirli RNA'ların seviyelerini ve lokalizasyonunu tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntemdir. Burada, belirli RNA'ların tek hücreli nicelleştirilmesi için ıslak tezgah işleme, görüntüleme ve görüntü analizi için onaylanmış laboratuvar protokollerimizi rapor ediyoruz.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Burada, tek tek hücreleri tanımlamak ve metabolizmalarını anlamak için orta kızılötesi fototermal-FISH (MIP-FISH) olarak da bilinen optik fototermal kızılötesi floresan yerinde hibridizasyon (OPTIR-FISH) kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu metodoloji, tek hücre çözünürlüğü ile hücresel metabolizmanın haritalanması da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için geniş çapta uygulanabilir.

Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)

Bu makale, uzun RNA'ların terminal konumlarında çift renkli etiketlenmesini ve tek moleküllü FRET TIRF mikroskobu uygulamaları için fosfolipid veziküllerde kapsülleme yoluyla yüzey immobilizasyonunu açıklamaktadır. Bu tekniklerin birleştirilmesi, RNA dinamiklerinin tek molekül düzeyinde hassas bir şekilde görselleştirilmesini ve analiz edilmesini sağlar.

Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

Öğrenin, tek molekül floresans in situ hibridizasyon deneyleri için Escherichia coli hücrelerindeki bireysel mRNA transkriptlerini floresan işaretli DNA problarıyla etiketleme yöntemini. Bu teknik, transkripsiyonel süreçlerin hücreden hücreye değişkenliğini incelemeye olanak tanır.

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

Daha fazla video keşfet