Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi
December 21st, 2017
Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.
Bu protokolün genel amacı, tek moleküllü FiSH deneylerinde görselleştirme için floresan etiketli DNA probları için E.Coli'deki bireysel transkriptleri etiketlemektir. Bu yöntem, sistem biyolojisi alanındaki, transkriptlerin karakterizasyonu, örneğin ilgilenilen alanın hücreden hücreye yeteneği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Hücre duvarı lokalizasyonunun transkriptlerinin yanı sıra.
Bu tekniğin temel avantajı, transkripsiyonel süreçlerin istatistikleri hakkında miktarda bilgi sağlamasıdır. Protokole başlamak için, E.Coli MG1655'i gece boyunca bir orbital çalkalayıcıda 260 RPM ve 37 santigrat derecede LB ortamında büyütün. Ertesi gün, gece boyunca kültürü taze ortamda bir ila 100 arasında seyreltin ve optik yoğunluğunu bir spektrofotometrede 0,2 ila 0,4 değerine kadar ölçün.
Daha sonra, hücreleri dört santigrat derecede 4.500 G'de beş dakika santrifüjleyerek peletleyin. Süpernatanı tüm tüplerden çıkarın. Her tüpe bir mililitre 1XPBS ekleyin ve hücreden hücreye agregasyonu en aza indirmek için peleti yeniden askıya alın.
Sonra dört mililitre fiksasyon tamponu ekleyin ve tüpü hafifçe girdaplayın. Numuneleri bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin. Hücre görüntülemeyi engelleyebilecek hücreden hücreye agregasyonu en aza indirmek için peleti yeniden askıya alın.
İnkübasyondan sonra, hücreleri peletleyin, süpernatanı çıkarın ve bir mililitre 1XPBS ekleyin. Süspansiyonları 1.8 mililitrelik konik tabanlı mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücreleri santrifüjleme ile peletleyin.
Süpernatanı dikkatlice çıkararak bakteri geçirgenliğine başlayın. Pelet dışındaki tüm sıvıyı çıkarmak için küçük hacimli pipetler kullanın. Ardından, peleti 300 mikrolitre DEPC ile arıtılmış suda yeniden süspanse edin.
350 mikrolitre yüksek dereceli mutlak etanol ekleyin ve tüpü ters çevirerek çözeltiyi hafifçe karıştırın. 350 mikrolitre daha etanol ekleyin ve tekrar karıştırın. Daha sonra numuneyi tüp döndürücü ile oda sıcaklığında bir saat boyunca 20 RPM'de döndürün.
Hücreleri geçirgenlikten pellet haline getirin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı çıkarın. Numunelere bir mililitre %20 yıkama tamponu ekleyin.
Onları birkaç dakika bekletin. Daha sonra, 750 G ve dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleme ile pelet hücreleri. Süpernatanı çok nazikçe çıkarın ve peletin dışındaki tüm sıvıyı çıkarmak için küçük hacimli pipetler kullanın.
Daha sonra, oligonükleotid prob seti stok çözeltisini, nihai oligonükleotid konsantrasyonu 250 nanomolar olacak şekilde hibridizasyon tamponu alikotuna ekleyin ve tüpü kuvvetlice girdaplayın. Numuneleri, kabarcık oluşumunu önlerken, oligonükleotid problarını içeren 50 mikrolitre hibridizasyon tamponunda askıya alın. Numuneleri gece boyunca karanlıkta, 30 santigrat derecelik bir ısı bloğunda bırakın.
Yıkamayı hazırlamak için, görüntülenecek her numune için yeni bir mikro santrifüj tüpü edinin. Her tüpe bir mililitre yıkama tamponu ekleyin. Hibritleştirilmiş numunelerden yıkama tamponunu içeren yeni tüpe 10 ila 15 mikrolitre ekleyin.
Hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın. Numuneleri iki kez daha yıkayın.
Peleti 25 mikrolitrelik yıkama tamponunda tekrar askıya alın. 10 mililitre 2X SSC tamponuna 150 miligram agaroz ekleyerek bir agaroz jeli hazırlayın. Agaroz tamamen eriyene kadar çözeltiyi her seferinde 10 ila 15 saniye mikrodalgada pişirin.
Ardından tüpü birkaç dakika soğuması için bir kenara koyun. Ardından, slaytın merkezi açıkta kalacak şekilde slaytın üzerine ayırıcı bir silikon çerçeve yerleştirin. Sürgünün ortasına 10 milimetre genişliğinde, bir ila iki milimetre kalınlığında sert bir halka yerleştirin.
Sızdırmazlık için merkeze az miktarda jel bırakın ve jelin sertleşmesi için birkaç dakika bekleyin. Daha sonra yüksek bir kubbe şekli oluşana kadar daha fazla jel ekleyin. Jelin sertleşmesi için yaklaşık 10 dakika bekleyin ve halkayı çıkarın.
Jelin üzerine 10 mikrolitre yıkama bakteri hücresi koyun ve sıfır numaralı kapak kayma sürgüsü ile kapatın. Foto ağartmayı önlemek için numuneyi karanlıkta tutun. E.coli hücrelerinin smFiSH ölçümleri, değişken hücre dışı D-fukoz konsantrasyonlarına yanıt olarak galK indüksiyon seviyesini gösterir.
Arka plan sinyali, galK silinmiş bir gerinim veya negatif kontrol olarak delta galK JW0740 ile gösterilir. Çoğu hücrede çok sayıda leke görülür. Bakteri kültürüne iki milimolar D-fukoz eklendiğinde tek veya birkaç galK transkriptine karşılık gelir.
Oysa hücre dışı D-fukoz yokluğunda birkaç nokta görülür. Bu protokolün uygulanması için başka bir örnek, vahşi tipte veya JW1648 sodB silinmiş bir suşta smFiSH'nin floresan ve faz kontrast görüntüleri ile sodB geni tarafından sağlanır. Bu protokolle hazırlanan örnekler, hücredeki transkriptlerin doğru bir şekilde hassaslaştırılmasını sağlayan STORM kullanılarak da görüntülenebilir.
Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sistem biyolojisi alanındaki araştırmacıların tek tek hücrelerdeki transkripsiyon olaylarının istatistiklerini keşfetmelerinin yolunu açtı.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu el yazması, E. coli'de tek moleküllü floresan in situ hibridizasyon (smFISH) deneylerinde kullanılmak üzere bireysel haberci RNA (mRNA) transkriptlerini floresan işaretli DNA probları ile etiketleme yöntemini açıklamaktadır. Bu teknik, sabitlenmiş bireysel hücrelerde tek mRNA moleküllerinin eşzamanlı tespiti, lokalizasyonu ve kantitasyonunu sağlar.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Sistemlerin Biyolojisi
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Tek moleküllü floresan in situ hibridizasyon (smFISH) güçlü bir görselleştirme yöntemidir.
- Bu yöntem, tek hücre düzeyinde transkripsiyonel süreçlerin çalışılmasını sağlar.
- mRNA lokalizasyonu ve kantitasyonunun anlaşılması sistem biyolojisi için kritik öneme sahiptir.
- E. coli bu deneyler için bir model organizma olarak hizmet eder.
Çalışmanın Amacı
- E. coli'de bireysel mRNA transkriptlerini etiketlemek.
- Floresan işaretli DNA probları kullanarak mRNA lokalizasyonunu görselleştirmek.
- Hücreler arası transkripsiyonel değişkenlik hakkında daha fazla bilgi elde etmek.
Kullanılan Yöntemler
- E. coli MG1655'i gece boyunca LB ortamında büyütün.
- Gecelik kültürü taze ortamda seyreltin.
- Uygun büyüme koşullarını sağlamak için optik yoğunluğu ölçün.
- smFISH analizi için floresan işaretli DNA probları uygulayın.
Ana Sonuçlar
- Bireysel mRNA transkriptlerinin başarılı bir şekilde etiketlenmesi.
- Sabitlenmiş hücreler içinde mRNA lokalizasyonunun görselleştirilmesi.
- Tek molekül düzeyinde transkripsiyonel süreçlerin kantitasyonu.
- Transkript ekspresyonundaki hücreler arası değişkenliğe dair içgörüler.
Sonuçlar
- Yöntem, mRNA dinamiklerinin incelenmesi için sağlam bir yaklaşım sunar.
- Sistem biyolojisi alanına değerli bilgiler katkıda bulunur.
- Bu teknik, gen ekspresyonu ile ilgili çeşitli araştırma sorularına uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) in E. coli enables direct quantification and spatial mapping of mRNA transcripts at single-cell resolution, addressing key challenges in understanding transcriptional heterogeneity. This capability supports predictive confidence in early discovery by revealing cell-to-cell variability and subcellular transcript localization. The method is strategically positioned for target validation and mechanistic de-risking in microbial systems biology and synthetic biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of gene expression variability across individual bacterial cells.
- Supports mechanistic de-risking by mapping transcript localization and abundance at single-molecule resolution.
- Facilitates functional target validation by distinguishing true biological effects from population-averaged artifacts.
- Provides high-content data for hypothesis-driven pathway analysis in microbial models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream screening of gene regulation or synthetic constructs.
- Delivers reproducible, quantitative mRNA copy number outputs for assay standardization.
- Enables multiplexed transcript detection within single cells, limited by spectral overlap of fluorophores.
- Supports robust evaluation of gene induction or repression in response to experimental perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling precise quantification of gene expression changes in microbial models.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation for engineered strains or pathway interventions.
- Reduces risk in advancing microbial targets by supplying single-cell resolution data on transcript dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This smFISH labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbial systems, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Delivers direct measurement of transcriptional events and spatial transcript distribution for pathway clarification.
- Screening: Supplies standardized, quantitative readouts for evaluating gene expression modulation in engineered or wild-type strains.
- Analytics: Enables statistical analysis of mRNA copy number distributions and cell-to-cell variability using open-source or custom software.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by validating gene expression changes at single-cell resolution.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for transcript quantification in diverse bacterial systems and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial gene expression studies.
- Operational Value: Standardizes transcript labeling and imaging for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for microbial targets and synthetic constructs by providing high-resolution expression data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial targets and engineered pathways based on quantitative single-cell analytics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial cell handling, fixation, and fluorescence microscopy.
- Needs access to fluorescence imaging platforms with low-intensity detection and appropriate filter sets.
- Demands cross-team standardization of probe design and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other bacterial strains or gene targets may require probe redesign and spectral optimization.
- Multiplexing is limited by spectral overlap of available fluorophores, constraining simultaneous gene detection.
