Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Bu floresan görüntüleme yaklaşımının genel amacı, bir SNAP etiketi kullanarak tek canlı hücrelerde ilgilenilen bir proteinin yarı ömrünü belirlemektir. Hücresel proteinler, sentez ve bozunma oranları her protein için spesifik olacak ve fizyolojik düzenlemeye tabi olacak şekilde kapsamlı bir şekilde çevrilir. Bununla birlikte, protein yarılanma ömrünü belirlemek için en yaygın olarak kullanılan yöntemler ya bit hücrelerinden gelen popülasyon ortalamaları ile sınırlıdır ya da protein sentezi inhibitörlerinin kullanılmasını gerektirir.

Bu videoda, canlı hücrelerde protein yarılanma ömürlerini ölçmek için floresan hızlandırılmış mikroskopi ile birlikte bir SNAP etiketinin nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Bu yöntemin avantajı, tek hücreli çözünürlüğe ulaşması ve bu nedenle kültürlenmiş hücre popülasyonundaki yarı ömürlerin heterojenliği için bir tahmin sağlamasıdır. Burada sunulan deneysel prosedür, bir SNAP etiketine kaynaşmış bir ilgilenilen proteini ifade eden herhangi bir tür yapışık kültürlenmiş hücreye uygulanabilir.

Bu, endojen protein etiketlemesi veya etiketli proteinlerin aşırı ekspresyonu kullanılarak elde edilebilir. SNAP etiketi, moleküler problara bağlanabilen benzilguanin ile spesifik olarak reaksiyona giren DNA onarım enzimi O6-alkilguanin-DNA alkiltransferazın mutant bir versiyonudur. Bu nedenle, herhangi bir SNAP-tag füzyon proteini, floresan hücre geçirgen bir boya ile geri dönüşümsüz bir şekilde etiketlenebilir.

Artık boyanın yıkanması üzerine, etiketli protein popülasyonu katlanarak bozunur ve karşılık gelen proteinin yarı ömrü çıkarılabilir. Bu videoda, klasik olarak jelatin kaplı tabaklar üzerinde büyütüldüğünde sıkı koloniler oluşturan embriyonik kök hücreleri kullanıyoruz. Tek katmanlı bir hücre tabakası olarak büyümelerine izin vermek ve böylece çiçeklenme görüntüleme deneyleri için tek hücre çözünürlüğü elde etmek için, onları plazma zarında ifade edilen hücresel inc yapışmasının aracılık ettiği hücre etkileşimlerine indirgeyen inc yapışan kaplamalı plakalar üzerinde kültürledik.

PBS'de mikrolitre başına beş nanograma yapışan rekombinant inc'i seyreltin ve görüntüleme için uygun 96 valf plakasına valf başına yapışan 30 mikrolitre seyreltilmiş inc ekleyin. Rekombinant inc yapışması çok kırılgan olduğu için aşırı pipetlemeden kaçının. 37 derecede bir buçuk saat inkübe edin.

Yapıştırma solüsyonunu aspire edin, 100 mikrolitre PBS ile bir kez yıkayın ve 200 mikrolitreye kadar önceden kurtlanmış ESL kültür ortamı ekleyin. SNAP etiketine kaynaşmış bir ilgi proteinini ifade eden ESL satırlarını kullanın. Hücreleri beş ml PBS ile yıkayın.

Sonra iki ml Tripson ekleyin ve 37 derecede dört dakika inkübe edin. Dört ml ESL kültür ortamı ekleyin, yeniden askıya alın ve dört dakika boyunca 1000 T'de döndürün. Süpernatanı aspire edin, taze ortamda tekrar süspanse edin ve hücreleri sayın.

Yapıştırılan kaplamalı görüntüleme plakasında santimetre kare başına 30.000 hücre yerleştirin. Hücre oturduktan 24 saat sonra SNAP boya boyamaya devam edin. ELS kültür ortamındaki hücre boyasını daha önce belirlenen optimal konsantrasyona seyreltin.

Ortamı bir pipet kullanarak aspire edin ve dikkatlice 50 mikrolitre seyreltilmiş SNAP boyası ekleyin. 37 derecede 30 dakika inkübe edin. Boyayı aspire edin ve 200 mikrolitre ön solucan PBS ile üç kez yıkayın.

200 mikrolitre ESL kültür ortamı ekleyin ve 37 derecede 15 dakika inkübe edin. Yıkama adımlarını nazikçe pipetleyerek gerçekleştirin ve hücreler kolayca ayrılma eğiliminde olduğundan otomatik aspiratör kullanmayın. Aynı yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın, ardından 200 mikrolitre görüntüleme ortamı ekleyin.

Çiçeklenme arka planını azaltmak için fenol kırmızısı içermeyen ortam kullanın. Kontrollü sıcaklık ve CO2'ye izin veren bir mikroskop kullanın. Kullanmadan önce sıcaklığı 37 dereceye ve CO2'yi yüzde beşe ayarlayın ve bir ila iki saat dengeye izin verin.

Plakayı mikroskoba yerleştirin ve görüntüleme için uygun noktayı seçin. Parlak alan görüntüleri, ESL'nin tek katmanlı bir şekilde yapıştırılan kaplamalı tabağa bağlı olduğunu gösterir. Hedefi seçin, bu boyuttaki ESL'ler için 20X'lik bir hedef uygundur.

Kaydedilecek floresan kanalı için aydınlatma ayarlarını seçin. Film boyunca azalacağı için güçlü bir sinyal elde etmek için lazer gücünü ve pozlamayı ayarlayın. Zaman atlamalı deney için alım parametrelerini seçin.

Beklenen yarı ömrü iki ila yirmi saat olan proteinler için, 15 dakikalık zaman aralıklarıyla 12 ila 24 saatlik alım sürelerini seçin. Görüntüleme deneyini başlatın. Filmin işlenmesi ve analizi için FIJI Yazılımını kullanın.

Elde edilen görüntüleri bir yığın olarak toplayın ve deforme edin. Yığındaki tüm resimlerden arka planı kaldırmak için arka planı çıkar FIJI işlevini kullanın. İlgilendiğiniz bir hücreyi seçin, FIJI araç çubuğunu kullanarak etrafına bir ilgi bölgesi çizin ve ilgilenilen bölgeyi ROI Yöneticisi'ne ekleyin.

Bir sonraki kareye geçin ve önceki işlemleri tekrarlayın. Film boyunca ilgilendiğiniz hücreyi takip edin ve izlenen her hücre için ayarlanan yatırım getirisini kaydedin. ROI'lerin ortalama yoğunluğu ve alanı için değerler elde etmek üzere hesaplamayı tıklayın.

Yerel arka planı tahmin etmek için, her zaman dilimi için ilgilenilen hücreye yakın bir ilgi alanı ekleyin. Sonunda, ortalama arka plan yoğunluğu değerlerini elde etmek için hesaplamayı tıklayın. İlk olarak, hücresel ROI'nin ortalama yoğunluğu için elde edilen değeri alanıyla çarparak hücrenin ortalama yoğunluğunu hesaplayın.

Ardından, arka plan ROI'sinin ortalama yoğunluğunu hücresel ROI alanıyla çarparak hücrenin entegre arka plan değerini hesaplamaya devam edin. Son olarak, hücrenin entegre yoğunluğu için arka plan düzeltilmiş bir değer elde etmek için, entegre arka plan yoğunluğu değerini entegre hücresel yoğunluk değerinden çıkarın. Hücre popülasyonunun ortalama yarı ömrünü elde etmek için, elde edilen değerleri her hücre için ilk çerçevenin yoğunluk değerine normalleştirin.

Bu, her hücrenin mutlak çiçeklenme yoğunluğundan bağımsız olarak ortalama yarı ömür değerine aynı ağırlıkta katkıda bulunmasını sağlar. Hücre bölünmelerinden sonra, her iki yavru hücreyi ayrı ayrı izleyin ve hücre bölünmesi sırasında protein seyreltmesini hesaba katmak için arka plan çıkarmadan sonra entegre yoğunluklarını toplayın. Her iki ek hücre için ROI setlerini kaydedin.

Protein yarılanma ömrünün tahmini için MATLAB'daki eğri uydurma aracını kullanın. Protein bozunması, F(x)'in verilen zaman noktasındaki çiçeklenme yoğunluğu, a"başlangıç yoğunluğu ve b"bozunma hızı olduğu bir üstel değeri takip eder. Uyumdan bozunma hızı b "değerlerini elde ettikten sonra, yarı ömür, ikinin logaritmasını b'ye bölerek hesaplanabilir" Bu film, bir doksisiklin kullanılamaz opt four SNAP-tag füzyon hücre hattında SNAP boya floresansının bozunmasını gösterir.

Gözlenen çiçeklenme sinyali, kullanılan hücre hattına, ilgili proteinin ekspresyon seviyesine ve kullanılan boyanın özelliklerine bağlı olacaktır. Protein bozunması deneyleri için yeterli bir SNAP boya konsantrasyonu kullanmak önemlidir. Konsantrasyon, zaman atlamasının başlangıcında parlak bir çiçeklenme sinyali verecek kadar yüksek olmalıdır.

Bununla birlikte, çok yüksek boya konsantrasyonlarının kullanılması, yıkamadan sonra bile ortamda artık boya kalmasına neden olabilir. Serbest boya daha sonra film boyunca yeni üretilen SNAP-tag moleküllerine bağlanabilir ve bu da bozunma eğrisini bozar. Bu nedenle, farklı seyreltmeleri test ederek SNAP boya konsantrasyonunu optimize etmek çok önemlidir.

Bu şekil, bir doksisiklin kullanılamaz hücre hattı üzerinde test edilen bir floresan SNAP boyasının sekiz farklı konsantrasyonu için bozunma eğrilerini göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme için üreticinin talimatlarına göre üç mikromolarlık bir başlangıç boya konsantrasyonu seçildi ve 1.4 nanomolar konsantrasyona ulaşana kadar bir ila üç arasında bir seri seyreltme gerçekleştirildi. En yüksek iki konsantrasyon için sinyal azalmazken, gözlenen bozulma daha düşük konsantrasyonlar için üstel bir eğri izler.

Bu örnekte, 12 nanomolar'lık optimal bir konsantrasyon seçilmiştir, çünkü bu konsantrasyon yıkamadan sonra ortamda minimum miktarda kalıntı boya kalmasını sağlar, ancak çiçeklenme sinyali hala net bir bozunma eğrisi gözlemlemek için yeterince parlaktır. Açıklanan protokol, SNAP etiketine kaynaşmış herhangi bir protein için hücreden hücreye değişkenliğin ve yarı ömrün bir tahminini sağlar. Bu şekil, tek hücre bozunmalarını ve üç farklı doksisiklin kullanılamaz SNAP-tag füzyon hücre hattı için popülasyon ortalamasını göstermektedir.

Nanog "ve Oct4" oldukça kısa ömürlüdür ve ortalama yarı ömürleri 2.9 ve 4.8 saattir. Oysa Srsf11" daha uzun ömürlüdür ve ortalama 25.3 saatlik bir yarı ömre sahiptir. Kutu grafikleri, üç protein için yarı ömürlerin dağılımını gösterir.

Floresan zaman atlamalı mikroskopi ile birlikte bir SNAP etiketinin kullanılmasının, ilgilenilen herhangi bir proteinin yarı ömrünün belirlenmesine izin verdiğini gösterdik. Tek hücre bozunması ölçümleri, bir hücre popülasyonundaki yarı ömürlerin heterojenliği için bir tahmin sağlar, bu da protein yarı ömürlerini belirlemek için diğer yöntemler kullanılırken ihmal edilir. Protein bozunmasını izlemek için bir SNAP etiketi kullanırken en önemli adımlardan biri, yıkamadan sonra ortamda veya hücrelerde artık bağlanmamış boya kalmamasını sağlamaktır.

Aksi takdirde, deney sırasında daha sonra yeni üretilen SNAP-tag moleküllerine bağlanabilir ve böylece bozunma eğrisini tehlikeye atabilir. Bu, bir yandan açıklanan tüm yıkama adımlarının dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesiyle elde edilir. Öte yandan, SNAP boya konsantrasyonu, iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmeye izin veren bir aralıkta iken mümkün olduğunca düşük tutulmalıdır.

SNAP boya konsantrasyonu, hücre hattına ve kullanılan boya türüne göre her deney için test edilmeli ve optimize edilmelidir. SNAP etiketinin bazı durumlarda aday proteinlerin yarı ömrünü değiştirmesi mümkün olsa da, aday proteinler testinin belirlenen yarı ömürleri yakından eşleşen yayınlanmış değerlere bağlı olduğundan, bu tür etkiler için hiçbir kanıt görmüyoruz. SNAP etiketinin protein bozunması üzerindeki etkisini daha da dışlamak için, bir seçenek, sikloheksimid ile protein sentezini bloke etmek ve yerli proteini tanıyan bir antikor kullanarak farklı zaman noktalarında tuvalet lekeleri yapmak olabilir.

Ve SNAP-tag aday proteininin bozunmasını etiketlenmemiş yerli versiyonla doğrudan karşılaştırmak.