Name: Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Öğrenin tek hücreli protein yarı ömrü ölçümü için SNAP-tag ve floresans mikroskobu kullanımını. Bu yöntem hücre popülasyonlarındaki protein yıkımı heterojenliğini analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hızlandırılmış mikroskobu deneyler biyomoleküler eleme tesisi (BSF adlı), EPFL gerçekleştirilmiştir. Marc Delachaux (hizmet Audiovisuel, EPFL) videografisi ve film düzenleme için teşekkür ederiz.

Not: Bu çalışmada, E14 ES hücre kültürünü kullanıldı. Ancak, bu iletişim kuralını doğrudan diğer fare ES hücre kültürünü bir protein endojen protein etiketleme veya overexpression kullanarak bir ek etiketi için erimiş ilgi ifade etmek için geçerlidir. Sonuçlar bölümünde gösterilen örnekler için Doksisiklin indüklenebilir ek-etiket füzyon hücre satırları kullanılmıştır (ek-etiket için aşağıdaki proteinler erimiş: MicroRNAs, Oct4, Srsf11, veya floresan proteinler mOrange2 ve sfGFP ve kontrolü altında koymak için bir Doksisiklin indüklenebilir organizatörü. Daha fazla bilgi için11 Doksisiklin indüklenebilir ek-etiket füzyon hücre satırları oluşturulmasında kullanılan plazmid bakınız). Sıkı zamanlama ve protein ilgi ifade yoğunluğunu kontrol için izin verdiği Doksisiklin indüklenebilir sistemi özellikle yararlı olabilir. C-terminal ek-etiket-in konumlandırma tavsiye edilir, N-terminal değiştirme olarak amino asit dizisi half-life hedef protein (N-son kural12) değiştirmek daha yüksektir.
1. E-cadherin kaplama ve hücre tohumlama
<ol><li>Bir protein için ek-tag4erimiş ilgi ifade bir ES hücre satırı oluşturmak.</li>
	<li>Kat 100 mm hücre kültür yemekleri (fosfat tamponlu tuz (PBS) olmadan Ca2 +/Mg2 +içinde seyreltilmiş) % 0,1 jelatin 1 h. için 4 mL ile jelatin kaldırmak ve hemen 1 h. kullanım kurumaya bırakın veya kaplamalı yemekleri 2 aya kadar saklayabilirsiniz.</li>
	<li>Hücre kültürünü ES hücre kültür orta (Glasgow en az temel takıma % 10 ES hücre nitelikli fetal sığır serum, 2 mM sodyum pyruvate, %1 non-gerekli amino asitler, % 1 penisilin/streptomisin, 2 mM L-glutamin, 100 µM 2 - Orta, ilgi büyümek mercaptoethanol, lösemi inhibitör faktörü (LIF), 3 µM CHIR99021 ve 0.8 µM PD184352) jelatin kaplı yemekleri yemek başına 10-20 Mio hücre bir izdiham ulaşan kadar 2 gün 37 ° C ve % 5 CO2 . Not: Burada, LIF süpernatant toplama tarafından takip ve filtreleme HEK 293T hücreleri, geçici transfection tarafından üretildi. LIF her toplu iş iş potansiyelini pluripotency korumak test edildi, ama konsantrasyonlarının tespit. Ancak, rekombinant LIF da piyasada bulunan ve sık kullanılan fare ES hücre kültürü için konsantrasyon 1000 adet/mL13.</li>
	<li>96-şey plaka başına iyi (5 ng/PBS içinde Ca2 +/Mg2 +ile seyreltilmiş µL,. E-cadherin Fc chimera protein (E-cad-Fc) rekombinant fare 30 µL ile görüntüleme için uygun ceket Hisse senedi-80 ° C'de depolanan 100 ng/µL konsantrasyonları kullanın.) E-cad-Fc çok kırılgan olduğu gibi geniş pipetting, kaçının. 1,5 saat için 37 ° C'de kuluçkaya. Not: mikroskop bağlı olarak, diğer formatlar kullanılabilir olur.</li>
	<li>E-cad-Fc Aspire edin, bir kez PBS 100 µL Ca2 +/Mg2 +ile yıkayın ve Önceden ısıtılmış ES hücre kültür ortamının 100 µL ekleyin.</li>
	<li>PBS 5 mL olmadan Ca2 +/Mg2 +faiz hücrelerle yıkayın. Aspire edin ve tripsin-EDTA 2 mL % 0.25 ekleyin. 4 dk. 37 ° C'de için kuluçkaya ES hücre kültür orta 4 mL ekleyin, resuspend ve 1000 x g 4 dk. aspiratı süpernatant de aşağı spin ve Pelet 2 mL taze ES hücre kültür orta resuspend. Not: PBS olmadan Ca2 +/Mg2 + trypsinization önce hücreleri yıkama için hücre adezyon için gerekli olan Ca2 + iyonları, kaldırmak için kullanılır. Buna ek olarak, E-cad-Fc seyreltme ve kaplama (1.4. adım) kullanmak için PBS Ca2 +/Mg2 +ile E-cad-Fc hücrelere ES yapışma beri kaplamalı yemekleri olduğunu Ca2 +-bağımlı14.</li>
	<li>Resuspended hücreleri 1:10 ES hücre kültür orta ve sayım odası (0,1 mm derinlik TMMOB için yük 10 µL) kullanan sayısı, 1 ml seyreltik.</li>
	<li>Tohum 30.000 hücre/cm2 ' E-cad-Fc görüntüleme plaka kaplı. İyi ücret 200 µL ES hücre kültür orta ile doldurun. Doksisiklin indüklenebilir hücre hatlarında Doksisiklin uygun bir doz ile teşvik (doz ve zamanlama indüksiyon önceden optimize edin. Burada kullanılan hücre hatları ile 500 ng/mL Doksisiklin görüntüleme önce 24 saat tedavi edildi). 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçkaya ve etiketleme ve hücre tohum sonra 24 h Imaging darbe ile devam edin.</li>
</ol>2. nabız ek-etiket etiketleme
Not: protein çürüme deneyler için bu yeterli bir ek boya toplama kullanmak çok önemlidir. Konsantrasyonu hızlandırılmış, başında parlak bir sinyal vermeye yüksek olmalıdır Floresans zamanla azalacak gibi. Ancak, çok yüksek boya konsantrasyonları kullanarak kalan boya orta veya hücreleri yıkamadan sonra bile bırakılmak neden olabilir. Ücretsiz boya daha sonra çürüme eğri tahrif edecek film boyunca yeni üretilen ek-etiket moleküllerine bağlamak. Gözlenen Floresans sinyal boya, kullanılan hücre hattı gibi ifade düzeyi karşılık gelen protein özellikleri üzerinde bağlıdır. Bu nedenle, farklı dilutions, canlı hücre görüntüleme için üretici tarafından önerilen seyreltme itibaren test ederek boya toplama en iyi duruma getirmek çok önemlidir. Bu çalışma için bir far-red floresan substrat kullanıldı. En iyi bir konsantrasyon 12 nM Doksisiklin indüklenebilir overexpression hücre hatlarında kararlıydım.
<ol><li>Önceden ısıtılmış ES hücre kültürü ortamında uygun toplama için ek boya sulandırmak. Hafifçe daha önce 96-şey plaka numaralı seribaşı hücrelerden orta kaldırmak için bir pipet kullanın ve seyreltilmiş ek boya iyi başına 50 µL ekleyin. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Bir pipet ile seyreltilmiş boya Aspire edin ve 3 x 200 µL (olmadan Ca2 +/Mg2 +) Önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. ES hücre kültür ortamının 200 µL ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya</li>
	<li>Önceki çamaşır adımları iki kez daha tekrarlayın. Not: Geniş çamaşır ilişkisiz herhangi bir boya kaldırmak için önemlidir. 15 dk incubations görüntüleme deney başlamadan önce ek-etiket füzyon proteinlerin sağlam etiketleme sağlamak ise PBS tekrarlanan çamaşır adımlarla ortamda, kalan ekstraselüler boya kaldırın. Ancak, nazik pipetting tarafından çamaşır adımlarını gerçekleştirin ve E-cad-Fc seribaşı hücreleri kolayca ayırmak eğilimi olarak bir otomatik aspiratör kullanmayın.</li>
	<li>Orta görüntüleme 200 µL ekleyin. Floresan arka plan azaltmak, fenol red ücretsiz orta kullanın (takıma % 10 ES hücre nitelikli fetal sığır serum, 2 mM sodyum pyruvate, %1 non-gerekli amino asitler, % 1 penisilin/streptomisin, 2 mM L-glutamin, 100 µM 2-mercaptoethanol, LIF, 3 µM CHIR99021 ve 0.8 µM PD184352).</li>
</ol>3. hızlandırılmış mikroskobu
<ol><li>Mikroskop bırakmak ısı kontrollü ve CO2canlı görüntüleme için uygun kullanın. Sıcaklığı 37 ° C, CO%2 5'için kullanın ve 1-2 h için equilibrate için izin vermek için önceden ayarlayın.</li>
	<li>Plaka mikroskop yer ve noktalar görüntüleme için uygun bulmak. Nerede bu analiz kolaylaştıracaktır gibi hücreler eşit olarak dağıtılmış ama çok yoğun, noktalar seçin. Analiz için gerekli hücre sayısı için seçili noktaların sayısını ayarlayın. Bu çalışmada, 3-5 noktalar hücre satır başına kaydedildi.</li>
	<li>Hedefi seçin. 20 X amaç ES hücre boyutu için uygundur.</li>
	<li>Kaydedilecek floresan kanal (lar) aydınlatma ayarlarını seçin. Lazer güç ve ilgi hücrelerden Floresans sinyalin yoğunluğunu göre pozlama ayarlamak. O film boyunca azaltmak ama lazer güçler fototoksisite ve photobleaching en aza indirmek için 30 daha yüksek önlemek bu yana güçlü bir ilk sinyal aldığınızdan emin olun. Bu çalışmada, bir uyarma filtre 632/22 için nm (dalga boyu/bant), emisyon filtre 679/34 nm (dalga boyu/bant), lazer güç % 10 ve pozlama süresi 100 MS kullanılmıştır.</li>
	<li>Görüntüleme aralıkları ve hızlandırılmış deneme süresi seçin. Beklenen yarı-ömrü 2-20 h olan proteinler için 12-24 h edinme zamanlarında 15 dk zaman aralıkları ile seçin. Shorter-Lived proteinler için aralıkları ve longer-lived proteinler artış satın alma saatleri buna göre azaltın.</li>
	<li>Görüntüleme başlatın.</li>
</ol>4. görüntü işleme ve analiz
<ol><li>Alınan görüntüleri TIFF biçiminde bir yığın olarak toplamak. Daha fazla işleme ve analiz için FIJI yazılım15kullanın. Hızlandırılmış veri yığını olarak mikroskop bilgisayar yazılımı tarafından toplanan değil, tüm çerçeveleri hızlandırılmış deneme yazılımı açın ( dosya tıklayarak tarafından | Açık... veya sürükle ve araç çubuğu'na karşılık gelen dosyaları atılan) tıklatın ve resmi | Yığınlar | Görüntü yığını.</li>
	<li>Yığındaki tüm resimlerden arka plan çıkarmak için çıkarma arka plan işlevini kullanın. Bunu yapmak için işlemi ' ı tıklatın | Arka plan çıkarma. Çalışırken topu RADIUS açılır penceresinde seçin. En azından görüntüsü hücreleri büyüklüğünde bir RADIUS kullanın. Evet , arka plan çıkarma yığındaki tüm hücrelere uygulamak için seçin işlem yığın? açılır pencere.</li>
	<li>İlgi bir hücre seçin ve faiz (ROI) etrafında araç çubuğunu kullanarak bir bölgenin çizin. Nükleer sinyalleri için Oval seçim ilk araç çubuğunda karşılık gelen sekmeyi tıklayarak ve sonra faiz çekirdeği üzerinde tıklayarak ve oval etrafında ayarlayarak kullanın. Sitoplazmik sinyalleri veya çok yoğun bölgeler için serbest seçim hücre özetliyor yakından takip edebilmek için kullanın. Tüm arka plan pikseller (Adım 4,8-4,9) sonraki çıkarma nedeniyle tam olarak hücre anahatları takip için gerekli olmadığı halde çok büyük arka plan, bölgelerinde eklemekten kaçının.</li>
	<li>Analiz tıklatarak ROI Yöneticisi faiz bölgesine eklemek | Araçlar | ROI Yöneticisi | Eklemek, veya T klavye tuşlarına basarak.</li>
	<li>Sonraki kareye yığın penceresinde sekmesini taşıyarak veya üst karakter tuşuna basarak devam + &lt; klavye, sonra önceki eylemlerin yineleyin. Hücre film seyri boyunca ilgi izleyin ve yatırım Getirisi her çerçevenin ROI Yöneticisi'ne ekleyin. Son ROI izlenen her hücre için daha fazla tıklatarak ayarlayın kaydetmek | Kaydet... ROI Yöneticisi'nde. Not: Ayrıca her iki kızı hücreleri hücre bölünmeler sonra izlemek ve onların entegre yoğunluklarda arka plan çıkarma sonra toplamı (protein seyreltme hücre bölünmesi sırasında hesaba 4.6-4,9 adımlara bakın). Her iki kızı hücreleri için yatırım Getirisi setleri kaydedin.</li>
	<li>Bir kez faiz hücre film izlenir, ortalama yoğunluğu ve ROIs alan değerlerini elde etmek için, ölçü birimi,'ı tıklatın. Elde edilen değerler bir elektronik tablo programına kopyalama ve hücrenin ham entegre yoğunluk her zaman noktası aşağıdaki gibi hesaplar: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq1.jpg"> nerede cdemekortalama yoğunluğu vealanCkarşılık gelen yatırım Getirisi alan.</li>
	<li>Yerel arka plan tahmin etmek için hücrenin her zaman dilimi için ilgi yakın bir yatırım Getirisi ekleyin. Herhangi bir hücresel Floresans sinyal eklemekten kaçının. Kabaca bir hücre boyutudur dairesel bir yatırım Getirisi kullanın ve taşıma veya buna göre gerekirse, örneğin komşu hücreleri burnunu sokarsan küçültmek. Elektronik tabloya ölçülen yoğunluk değerleri kopyalamak ve yatırım Getirisi bir arka plan yatırım Getirisi elde etmek için ayarla ayarla cep ile daha önce açıklandığı gibi devam edin.</li>
	<li>Entegre yoğunluk hücre için arka plan-düzeltilmiş değer elde etmek için önce her zaman noktası arka entegre yoğunluğunu hesaplamak: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq2.jpg"> arka plan sinyal ve alanC ortalama yoğunluğu nerede BG demek hücre çevreleyen ROI alanıdır. Her iki alanda aynı boyutta olmadığı sürece arka plan yatırım Getirisi, alanı kullanmayın.</li>
	<li>Her zaman için hücrenin son arka plan düşülen entegre yoğunluk Hesapla: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq3.jpg">
</li>
	<li>Tek hücre çürümesine eğrileri normalize etmek her zaman-nokta yoğunluk değeri ilk zaman noktası yoğunluk değeri tarafından bölün. Not: Eğri uydurma (bkz. Adım 4.11) de her tek hücre veya nüfus ortalama gerçekleştirilebilir. Bir popülasyonun ortalama önyargıları farklı floresan yoğunluklarda hücreler arasında üzerinden önlemek için hesaplanır, bir normalleştirme gerek yoktur. Normalleştirme böylece her hücre son bozunma eğrisi için aynı ağırlık katkıda bulunur sağlar. Buna ek olarak, normalleştirme bağımsız olarak (bkz. Şekil 3A-3 C) onların mutlak Floresans yoğunluklarda tek hücre bozunmaları görselleştirmek yararlı olabilir. Ancak, eğer sadece tek hücreli yarı-hayat belirlenir ve verileri değil ortalama olarak, normalleştirme adım atlanabilir ve eğri uydurma doğrudan ham veriler üzerinde gerçekleştirilir.</li>
	<li>Protein half-life tahmini için bir eğri uydurma aracını kullanın. Bu çalışmada, MATLAB kullanıcı arabiriminin Apps bölümünde varsayılan olarak bulunduğu araç kutusu 3.4.1 uygun MATLAB eğrisi kullanıldı. Floresan yoğunluğu ithalat ve saat değerleri Veri al sekmesini tıklatarak elektronik tablo içine MATLAB'araç Montaj eğrisi açın ve floresan çürüme veri ve zaman Puan X veri ve Y seçin veri sekmesini seçin Özel denklem eğri uydurma tab ve üstel bir çürüme denklemi girin: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq4.jpg"> f(t) floresan yoğunluğu zaman-noktada verildi, olduğu yerde bir ilk yoğunluğu ve b çürüme oranı. Uygun seçenekleri... sekmesinde, hem a ve balt sınırı için 0 seçin. A ve b için tahmini değerleri daha sonra sonuçları penceresinde görünür. Yarı ömrü aşağıdaki gibi hesaplar: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq5.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15173609">Determining Protein Half-Lives.</a> Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).</li>
<li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4+kinetics+predict+cell+lineage+patterning+in+the+early+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo.</a> Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).</li>
<li>Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).</li>
<li>Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+fusion+proteins+with+synthetic+fluorophores+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).</li>
<li>Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+O6-alkylguanine-DNA+alkyltransferase+for+applications+in+protein+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Design+Select%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling.</a> Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).</li>
<li>Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).</li>
<li>Bojkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+In+Vivo+Protein+Half-Life%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring In Vivo Protein Half-Life.</a> Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).</li>
<li>Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+quantitative+measurements+of+gene+expression+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells.</a> Methods. 120, 65-75 (2017).</li>
<li>Komatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Measurements+of+Protein+Dynamics+Using+Fluorescence+Activation-Coupled+Protein+Labeling+Method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method.</a> J Am Chem Soc. 133 (17), 6745(2011).</li>
<li>Deluz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+mitotic+bookmarking+of+SOX2+in+pluripotency+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation.</a> Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).</li>
<li>Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-end+rule+pathway+and+regulation+by+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The N-end rule pathway and regulation by proteolysis.</a> Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).</li>
<li>Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Study+of+Protocols+for+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+Culturing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81156(2013).</li>
<li>Nagaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Cadherin-Coated+Plates+Maintain+Pluripotent+ES+Cells+without+Colony+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation.</a> PLoS ONE. 1 (1), e15(2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hilsenbeck, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+single-cell+tracking+and+quantification+of+cellular+and+molecular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties.</a> Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).</li>
<li>Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAST%3A+An+automated+segmentation+and+tracking+tool+for+the+analysis+of+transcriptional+kinetics+from+single-cell+time-lapse+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings.</a> Methods. 85, 3-11 (2015).</li>
<li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nature Comm. 8, (2017).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIDRE%3A+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li>
<li>Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22076938">5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation.</a> Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).</li>
<li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+Regulation+of+Akt+and+Oct4+Promotes+the+Self-Renewal+and+Survival+of+Embryonal+Carcinoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells.</a> Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).</li>
<li>Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+of+Oct4+Enhances+Its+Stability%2C+DNA+Binding%2C+and+Transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation.</a> J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Engineered+Protein+Tag+for+Multiprotein+Labeling+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells.</a> Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).</li>
<li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Protein çürüme izlemek için ek etiketi kullanan hiçbir kalıntı ilişkisiz boya orta veya hücreleri olarak aksi takdirde yıkama sonrası bu sol emin olmak için yeni bağlamak olduğunda en önemli adım ek-etiket molekülleri daha sonra sırasında deneme ve orada üretilen Münir uzlaşma bozunma eğrisi. Bir yandan dikkatle açıklanan çamaşır adımları uygulayarak elde bu. Öte yandan, boya konsantrasyon hala iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için izin verir bir aralıktaki olurken mümkün olduğunca düşük tutulmalıdır. <strong clas...

İyi hücresel protein sentezi ve yıkımı oranları belirli her protein ve fizyolojik düzenleme tabi olmak ile geniş ciro, tabi olduğu bilinmektedir. Geleneksel olarak, protein yıkımı oranları ölçülen radyoaktif darbe chase analizi gibi toplu yöntemleri kullanarak veya sikloheksimit1gibi protein sentez inhibitörleri içeren olmuştur. Daha yakın zamanlarda, kararlı izotop kütle spektrometresi ile birlikte (SILAC) hücre kültüründe amino asitler ile etiketleme bir küresel ölçekte2protein ciro ölçmek için kurulmuştur. Ancak, bu yöntemlerin nüfus sayı ortalaması alınarak sınırlıdır ve hücre-hücre değişkenlik hakkında bilgi bu nedenle kaybolur. Ayrıca, hücre nüfus arasında iseEşitlenmemiş protein yıkımı geçici değişimler tanımlanamıyor.
Alternatif olarak, protein yarı-hayat da hangi sık sık tek hücreli çözünürlük sağlama avantajına sahip floresan tabanlı yaklaşımlar tarafından belirlenebilir. Örneğin, bir photoactivatable yeşil flüoresan protein (paGFP) erken memeli embriyo3Oct4 half-life belirlemek için kullanılır. Canlı hücreler içinde protein çürüsün izlemek için başka bir yöntem bir ek etiketi Floresans hızlandırılmış görüntüleme ile birlikte kullanmaktır. EK-etiket DNA onarım enzim O6- alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) özellikle moleküler probları4,5' e, birleştiğinde (BG) türevleri ile benzylguanine tepki verir, mutasyona uğramış bir sürümüdür 6. bu nedenle, herhangi bir ek-etiket füzyon proteini bir Floresan, hücre geçirgen boya ile geri dönüşümsüz olarak etiketlenmiş. Darbe bir protein ek etiketi artık boya fiyasko tarafından takip, erimiş ilgi etiketlerine göre etiketli protein nüfus düşüşü izleme ve dolayısıyla protein half-life belirlemek için izin verir. Nabız-chase proteinlerin etiketleme için ek-etiketleri başarıyla kullanılmaktadır ve protein belirlemek için yarı-yapışık hayatımızda hücre kültür ve in vivo5,7,8,9. Yaygın olarak kullanılan çeşitli kapsayan ek-etiket yüzeylerde floresan spectra her özel uygulama için en iyi boya seçimi etkinleştirmek ticari olarak kullanılabilir. Böylece, ek-etiketleri diğer floresan füzyon protein veya boya ile çok renkli görüntüleme için de kullanılabilir. Hücre geçirgen boyalar hücre içi hem de membran bağlı proteinler izlemek için geçerlidir, ancak hücre geçirimsiz boyalar proteinler membran hayvan zinciri, etiketleme için uygundur. Ayrıca, bazı Bu sondalar neredeyse hiçbir Bazal Floresans sergi ve sadece ek-etiket10bağlama üzerine güçlü bir floresan sinyal yayan başlar.
Bu iletişim kuralı tek hücrelere ek etiketini kullanarak ilgi farklı protein yıkımı oranları ölçmek nasıl açıklar. Burada E-cadherin kültür fare embriyonik kök (ES) hücrelere bu yöntemi uygulamak, ama herhangi bir yapisan kültürlü hücre türü ile kullanmak mümkün olmalıdır. Biz ek-etiket füzyon protein Floresans hızlandırılmış görüntüleme tarafından takip darbe etiketleme tek hücre yarı-hayat ilgi çeşitli proteinlerin belirlemek için izin verir ve yarı-hayatımızda hücre hücre çeşitliliği için bir tahmin sağlar gösterir bir nüfus kültürlü hücre.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ES hücre hattı, ilgilenilen bir SNAP-tag füzyon proteinini ifade eder</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Falcon 100 mm TC ile İşlenmiş Hücre Kültürü Kabı</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyu, Siyah/Şeffaf, Doku Kültürü İşlem Görmüş Plaka</td><td>Corning</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer ile geliştirilmiş sayma haznesi, 0,1 mm</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>CO2 İnkübatörü</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5804000528</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2200 Hücre Görüntüleme Sistemi</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Esansiyel Orta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, embyonik kök hücre nitelikli</td><td>ThermoFisher</td><td>16141-079</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113-24-6</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Temel Ortam&nbsp; Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>ThermoFisher</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00H</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Lösemi İnhibitör faktör</td><td>-</td><td>-</td><td>HEK-293T hücrelerinin geçici transfeksiyonu ile laboratuvarda üretilir, ardından süpernatantın toplanması ve filtrelenmesi ile üretilir.</td></tr><tr><td>CHIR99021 (GSK-3 İnhibitörü XVI)</td> <td>Merck Millipore</td><td>361559</td><td></td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>391210-10-9</td><td></td></tr><tr><td>Sığır derisinden elde edilen jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun PBS 10x konsantre</td><td>BioConcept</td><td>3-05K00-I</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Ca++/Mg++</td><td>BioConcept</td><td>3-05F29-I</td><td></td> içermeyen PBS'si</tr><tr><td>Tripsin-EDTA-Çözeltisi% 0.25</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Fare E-Cadherin Fc Chimera proteini</td><td>R & D sistemleri</td><td>748-EC-050</td><td></td></tr><tr><td>Doksisiklin hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>SNAP-Cell 647-SiR</td><td>New England BioLabs</td><td>S9102S</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A18967-01</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı< / güçlü > <</td> <td>güçlü > Şirket< / güçlü</td> <td>> < güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td><td>< güçlü>Yorumlar<</td></tr><tr><td>strong>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI-</td><td></td><td>-Açık</td> <td>kaynaklı görüntü analiz yazılımı</td></tr><tr><td>MATLAB R2014a</td><td>Mathworks-Microsoft</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

tek hücreli miktar protein yıkımı oranları hızlandırılmış floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Protein sentezi dinamik bir durumda olduğundan ve bozulması ve yarı hayatlarını çeşitli şartlar altında ayarlanabilir. Ancak, en sık protein half-life ya olduğunu belirlemek için yaklaşımlar kullanılan lysed hücrelerden popülasyon ortalamaları için sınırlı veya protein sentez inhibitörleri kullanılmasını gerektirir. Bu iletişim kuralı protein yarı-hızlandırılmış Floresans mikroskobu ile birlikte ek-etiket füzyon protein kullanarak hayatımızda tek yaşam yapışık hücreleri, ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bir ek etiketi için erimiş ilgi herhangi bir protein kovalent birleştiğinde bir Floresan, hücre geçirgen boya tarafından benzylguanine türev bağlanabilir ve etiketli protein nüfus çürüme kalan boya fiyasko sonra izlenebilir. Sonraki hücre izleme ve miktar bir üstel çürüme eğri eğri uydurma tarafından protein yıkımı oranları Tek Kişilik hücrelerde belirlemek için izin izlenen her hücre için zaman sonuçlar üzerinde tümleşik Floresans yoğunluğunu. Bu yöntem için yarı-hayat kolayca diğer yöntemlerle ölçülen olamaz kültürlü hücrelerinin bir popülasyondaki heterojen bir tahmin sağlar. Burada sunulan yaklaşım kültürlü yapışık hücreleri bir protein bir ek etiketi için erimiş ilgi ifade, her türlü için geçerlidir. Burada E-cadherin kaplı hücre kültür Tabaklarda yetiştirilen fare embriyonik kök (ES) hücre protein oranları geniş bir yarı-hayat ile belirlenebilir nasıl tek hücre yıkımı göstermek için kullanın.

Açıklanan protokol tahmini hücre hücre değişkenlik half-life için bir ek etiketi için erimiş herhangi bir verilen protein sağlar. Aksi takdirde koloniler halinde yetişen ES hücreleri tek hücre çözümlenmek rekombinant E-cadherin-Fc kullanımı görüntü plaka kaplama için sağlar. Tek hücreler ayrı ayrı Film ( şekil 1A) ders boyunca izlenebilir.
Her tek hücre proteini half-life belirlemek için her iki kızı hücreleri entegre yoğunluklarda özetliyor ile entegre, arka plan...

Bu iletişim kuralı protein yarı-tek yaşam yapisan hücrelerde, hayatını darbe etiketleme ve floresan hızlandırılmış görüntüleme ek-etiket füzyon proteinlerin kullanarak belirlemek için bir yöntem açıklanır.

Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Bu floresan görüntüleme yaklaşımının genel amacı, bir SNAP etiketi kullanarak tek canlı hücrelerde ilgilenilen bir proteinin yarı ömrünü belirlemektir. Hücresel proteinler, sentez ve bozunma oranları her protein için spesifik olacak ve fizyolojik düzenlemeye tabi olacak şekilde kapsamlı bir şekilde çevrilir. Bununla birlikte, protein yarılanma ömrünü belirlemek için en yaygın olarak kullanılan yöntemler ya bit hücrelerinden gelen popülasyon ortalamaları ile sınırlıdır ya da protein sentezi inhibitörlerinin kullanılmasını gerektirir.Bu videoda, canlı hücrelerde protein yarılanma ömürlerini ölçmek için floresan hızlandırılmış mikroskopi ile birlikte bir SNAP etiketinin nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Bu yöntemin avantajı, tek hücreli çözünürlüğe ulaşması ve bu nedenle kültürlenmiş hücre popülasyonundaki yarı ömürlerin heterojenliği için bir tahmin sağlamasıdır. Burada sunulan deneysel prosedür, bir SNAP etiketine kaynaşmış bir ilgilenilen proteini ifade eden herhangi bir tür yapışık kültürlenmiş hücreye uygulanabilir.Bu, endojen protein etiketlemesi veya etiketli proteinlerin aşırı ekspresyonu kullanılarak elde edilebilir. SNAP etiketi, moleküler problara bağlanabilen benzilguanin ile spesifik olarak reaksiyona giren DNA onarım enzimi O6-alkilguanin-DNA alkiltransferazın mutant bir versiyonudur. Bu nedenle, herhangi bir SNAP-tag füzyon proteini, floresan hücre geçirgen bir boya ile geri dönüşümsüz bir şekilde etiketlenebilir.Artık boyanın yıkanması üzerine, etiketli protein popülasyonu katlanarak bozunur ve karşılık gelen proteinin yarı ömrü çıkarılabilir. Bu videoda, klasik olarak jelatin kaplı tabaklar üzerinde büyütüldüğünde sıkı koloniler oluşturan embriyonik kök hücreleri kullanıyoruz. Tek katmanlı bir hücre tabakası olarak büyümelerine izin vermek ve böylece çiçeklenme görüntüleme deneyleri için tek hücre çözünürlüğü elde etmek için, onları plazma zarında ifade edilen hücresel inc yapışmasının aracılık ettiği hücre etkileşimlerine indirgeyen inc yapışan kaplamalı plakalar üzerinde kültürledik.PBS'de mikrolitre başına beş nanograma yapışan rekombinant inc'i seyreltin ve görüntüleme için uygun 96 valf plakasına valf başına yapışan 30 mikrolitre seyreltilmiş inc ekleyin. Rekombinant inc yapışması çok kırılgan olduğu için aşırı pipetlemeden kaçının. 37 derecede bir buçuk saat inkübe edin.Yapıştırma solüsyonunu aspire edin, 100 mikrolitre PBS ile bir kez yıkayın ve 200 mikrolitreye kadar önceden kurtlanmış ESL kültür ortamı ekleyin. SNAP etiketine kaynaşmış bir ilgi proteinini ifade eden ESL satırlarını kullanın. Hücreleri beş ml PBS ile yıkayın.Sonra iki ml Tripson ekleyin ve 37 derecede dört dakika inkübe edin. Dört ml ESL kültür ortamı ekleyin, yeniden askıya alın ve dört dakika boyunca 1000 T'de döndürün. Süpernatanı aspire edin, taze ortamda tekrar süspanse edin ve hücreleri sayın.Yapıştırılan kaplamalı görüntüleme plakasında santimetre kare başına 30.000 hücre yerleştirin. Hücre oturduktan 24 saat sonra SNAP boya boyamaya devam edin. ELS kültür ortamındaki hücre boyasını daha önce belirlenen optimal konsantrasyona seyreltin.Ortamı bir pipet kullanarak aspire edin ve dikkatlice 50 mikrolitre seyreltilmiş SNAP boyası ekleyin. 37 derecede 30 dakika inkübe edin. Boyayı aspire edin ve 200 mikrolitre ön solucan PBS ile üç kez yıkayın.200 mikrolitre ESL kültür ortamı ekleyin ve 37 derecede 15 dakika inkübe edin. Yıkama adımlarını nazikçe pipetleyerek gerçekleştirin ve hücreler kolayca ayrılma eğiliminde olduğundan otomatik aspiratör kullanmayın. Aynı yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın, ardından 200 mikrolitre görüntüleme ortamı ekleyin.Çiçeklenme arka planını azaltmak için fenol kırmızısı içermeyen ortam kullanın. Kontrollü sıcaklık ve CO2'ye izin veren bir mikroskop kullanın. Kullanmadan önce sıcaklığı 37 dereceye ve CO2'yi yüzde beşe ayarlayın ve bir ila iki saat dengeye izin verin.Plakayı mikroskoba yerleştirin ve görüntüleme için uygun noktayı seçin. Parlak alan görüntüleri, ESL'nin tek katmanlı bir şekilde yapıştırılan kaplamalı tabağa bağlı olduğunu gösterir. Hedefi seçin, bu boyuttaki ESL'ler için 20X'lik bir hedef uygundur.Kaydedilecek floresan kanalı için aydınlatma ayarlarını seçin. Film boyunca azalacağı için güçlü bir sinyal elde etmek için lazer gücünü ve pozlamayı ayarlayın. Zaman atlamalı deney için alım parametrelerini seçin.Beklenen yarı ömrü iki ila yirmi saat olan proteinler için, 15 dakikalık zaman aralıklarıyla 12 ila 24 saatlik alım sürelerini seçin. Görüntüleme deneyini başlatın. Filmin işlenmesi ve analizi için FIJI Yazılımını kullanın.Elde edilen görüntüleri bir yığın olarak toplayın ve deforme edin. Yığındaki tüm resimlerden arka planı kaldırmak için arka planı çıkar FIJI işlevini kullanın. İlgilendiğiniz bir hücreyi seçin, FIJI araç çubuğunu kullanarak etrafına bir ilgi bölgesi çizin ve ilgilenilen bölgeyi ROI Yöneticisi'ne ekleyin.Bir sonraki kareye geçin ve önceki işlemleri tekrarlayın. Film boyunca ilgilendiğiniz hücreyi takip edin ve izlenen her hücre için ayarlanan yatırım getirisini kaydedin. ROI'lerin ortalama yoğunluğu ve alanı için değerler elde etmek üzere hesaplamayı tıklayın.Yerel arka planı tahmin etmek için, her zaman dilimi için ilgilenilen hücreye yakın bir ilgi alanı ekleyin. Sonunda, ortalama arka plan yoğunluğu değerlerini elde etmek için hesaplamayı tıklayın. İlk olarak, hücresel ROI'nin ortalama yoğunluğu için elde edilen değeri alanıyla çarparak hücrenin ortalama yoğunluğunu hesaplayın.Ardından, arka plan ROI'sinin ortalama yoğunluğunu hücresel ROI alanıyla çarparak hücrenin entegre arka plan değerini hesaplamaya devam edin. Son olarak, hücrenin entegre yoğunluğu için arka plan düzeltilmiş bir değer elde etmek için, entegre arka plan yoğunluğu değerini entegre hücresel yoğunluk değerinden çıkarın. Hücre popülasyonunun ortalama yarı ömrünü elde etmek için, elde edilen değerleri her hücre için ilk çerçevenin yoğunluk değerine normalleştirin.Bu, her hücrenin mutlak çiçeklenme yoğunluğundan bağımsız olarak ortalama yarı ömür değerine aynı ağırlıkta katkıda bulunmasını sağlar. Hücre bölünmelerinden sonra, her iki yavru hücreyi ayrı ayrı izleyin ve hücre bölünmesi sırasında protein seyreltmesini hesaba katmak için arka plan çıkarmadan sonra entegre yoğunluklarını toplayın. Her iki ek hücre için ROI setlerini kaydedin.Protein yarılanma ömrünün tahmini için MATLAB'daki eğri uydurma aracını kullanın. Protein bozunması, F(x)'in verilen zaman noktasındaki çiçeklenme yoğunluğu, a"başlangıç yoğunluğu ve b"bozunma hızı olduğu bir üstel değeri takip eder. Uyumdan bozunma hızı b "değerlerini elde ettikten sonra, yarı ömür, ikinin logaritmasını b'ye bölerek hesaplanabilir" Bu film, bir doksisiklin kullanılamaz opt four SNAP-tag füzyon hücre hattında SNAP boya floresansının bozunmasını gösterir.Gözlenen çiçeklenme sinyali, kullanılan hücre hattına, ilgili proteinin ekspresyon seviyesine ve kullanılan boyanın özelliklerine bağlı olacaktır. Protein bozunması deneyleri için yeterli bir SNAP boya konsantrasyonu kullanmak önemlidir. Konsantrasyon, zaman atlamasının başlangıcında parlak bir çiçeklenme sinyali verecek kadar yüksek olmalıdır.Bununla birlikte, çok yüksek boya konsantrasyonlarının kullanılması, yıkamadan sonra bile ortamda artık boya kalmasına neden olabilir. Serbest boya daha sonra film boyunca yeni üretilen SNAP-tag moleküllerine bağlanabilir ve bu da bozunma eğrisini bozar. Bu nedenle, farklı seyreltmeleri test ederek SNAP boya konsantrasyonunu optimize etmek çok önemlidir.Bu şekil, bir doksisiklin kullanılamaz hücre hattı üzerinde test edilen bir floresan SNAP boyasının sekiz farklı konsantrasyonu için bozunma eğrilerini göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme için üreticinin talimatlarına göre üç mikromolarlık bir başlangıç boya konsantrasyonu seçildi ve 1.4 nanomolar konsantrasyona ulaşana kadar bir ila üç arasında bir seri seyreltme gerçekleştirildi. En yüksek iki konsantrasyon için sinyal azalmazken, gözlenen bozulma daha düşük konsantrasyonlar için üstel bir eğri izler.Bu örnekte, 12 nanomolar'lık optimal bir konsantrasyon seçilmiştir, çünkü bu konsantrasyon yıkamadan sonra ortamda minimum miktarda kalıntı boya kalmasını sağlar, ancak çiçeklenme sinyali hala net bir bozunma eğrisi gözlemlemek için yeterince parlaktır. Açıklanan protokol, SNAP etiketine kaynaşmış herhangi bir protein için hücreden hücreye değişkenliğin ve yarı ömrün bir tahminini sağlar. Bu şekil, tek hücre bozunmalarını ve üç farklı doksisiklin kullanılamaz SNAP-tag füzyon hücre hattı için popülasyon ortalamasını göstermektedir.Nanog "ve Oct4" oldukça kısa ömürlüdür ve ortalama yarı ömürleri 2.9 ve 4.8 saattir. Oysa Srsf11" daha uzun ömürlüdür ve ortalama 25.3 saatlik bir yarı ömre sahiptir. Kutu grafikleri, üç protein için yarı ömürlerin dağılımını gösterir.Floresan zaman atlamalı mikroskopi ile birlikte bir SNAP etiketinin kullanılmasının, ilgilenilen herhangi bir proteinin yarı ömrünün belirlenmesine izin verdiğini gösterdik. Tek hücre bozunması ölçümleri, bir hücre popülasyonundaki yarı ömürlerin heterojenliği için bir tahmin sağlar, bu da protein yarı ömürlerini belirlemek için diğer yöntemler kullanılırken ihmal edilir. Protein bozunmasını izlemek için bir SNAP etiketi kullanırken en önemli adımlardan biri, yıkamadan sonra ortamda veya hücrelerde artık bağlanmamış boya kalmamasını sağlamaktır.Aksi takdirde, deney sırasında daha sonra yeni üretilen SNAP-tag moleküllerine bağlanabilir ve böylece bozunma eğrisini tehlikeye atabilir. Bu, bir yandan açıklanan tüm yıkama adımlarının dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesiyle elde edilir. Öte yandan, SNAP boya konsantrasyonu, iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmeye izin veren bir aralıkta iken mümkün olduğunca düşük tutulmalıdır.SNAP boya konsantrasyonu, hücre hattına ve kullanılan boya türüne göre her deney için test edilmeli ve optimize edilmelidir. SNAP etiketinin bazı durumlarda aday proteinlerin yarı ömrünü değiştirmesi mümkün olsa da, aday proteinler testinin belirlenen yarı ömürleri yakından eşleşen yayınlanmış değerlere bağlı olduğundan, bu tür etkiler için hiçbir kanıt görmüyoruz. SNAP etiketinin protein bozunması üzerindeki etkisini daha da dışlamak için, bir seçenek, sikloheksimid ile protein sentezini bloke etmek ve yerli proteini tanıyan bir antikor kullanarak farklı zaman noktalarında tuvalet lekeleri yapmak olabilir.Ve SNAP-tag aday proteininin bozunmasını etiketlenmemiş yerli versiyonla doğrudan karşılaştırmak.

single-cell-quantification-protein-degradation-rates-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz invadopodia aracılı matriks yıkımı görselleştirmek için floresan jelatin kaplı mikroskop lamelleri üretmek için prototip yöntem açıklanmaktadır. Mevcut yazılımını kullanarak hesaplama teknikleri karışık bir popülasyon içindeki ve bütün mikroskobik alanı kapsayan çok hücreli grupları için tek hücreler ile matris proteolizin sonuç seviyeleri ölçülmesi için sunulmuştur.

Tek ve Çok hücreli Bağlamlarda Invadopodia aracılı Ekstrasellüler Matriks Proteoliz Kantitatif Ölçümü

Bu videoda, transfekte edilmiş memeli hücrelerinin çekirdeğinde eksprese edilen floresan etiketli yanlış katlanmış lusiferaz mutant proteinin bozunma kinetiğini incelemek için in vitro floresan bazlı bir mikroplaka testi açıklanmaktadır. Test, yanlış katlanmış proteinin proteazom aracılı bozunmasını değerlendirmek için floresan mutant proteini eksprese eden hücrelerin bir translasyon inhibitörü ve bir proteazom inhibitörü ile işlenmesini içerir.

Floresan Mikroplaka Bazlı Sikloheksimid Takip Testi: Floresan Nükleer Yanlış Katlanmış Proteinlerin Bozunma Kinetiğini İzlemek İçin Bir Teknik

Akış sitometrisi ve mikroskopiye dayanan iki yardımcı yöntem mayada bir MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan gen ekspresyonunun dinamiklerinin tek hücre düzeyinde miktarının, ki olanak sunulmaktadır.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

Burada, ubikitin-proteazom sistemi tarafından nispi proteoliz oranını ölçmek için sağlam bir biyolojik testi açıklıyoruz. Tahlil okuması, temel bir metabolik belirteçle kaynaşmış bir bozunma sinyali içeren bir raportör proteinin hücresel seviyelerine bağlı olan sıvı kültürdeki maya büyüme hızıdır.

Protein Parçalanabilirliklerinin Sistematik Analizi muhabiri tabanlı Büyüme Deneyi

Hücre ve dokularda protein seviyeleri, çoğu zaman sıkı bir şekilde protein üretimi ve temizlenmesi dengesi ile düzenlenir. Fotoçevrim (FDAP) sonra floresans Bozunma kullanan proteinlerin temizlenme kinetiği deneysel in vivo olarak ölçülebilir.

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Bu rapor, western blot veya floresan bazlı tahlillerle yanlış katlanmış proteinlerin bozunma oranlarını ölçmek için protokolleri açıklar. Yöntemler, diğer yanlış katlanmış proteinlerin analizine ve yüksek verimli taramaya uygulanabilir.

Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Protein katabolizmindeki biyolojik ritimleri otofaji ve fare karaciğerinde proteozom yoluyla ölçme protokolümüzü tanımlıyoruz.

Otophagic ve Proteasomal Akı'da Diurnal Ritimlerin Ölçülmesi

Mikropatterned diziler kullanılarak tek hücrelerden floresan muhabir zaman kurslarının alınması için bir yöntem sunuyoruz. Protokolde, tek hücreli dizilerin hazırlanması, canlı hücre tarama zaman atlamalı mikroskopinin kurulumu ve çalışması ve otomatik önseçim, görsel kontrol ve yapıştırma alanı başına hücre entegre floresan zaman kurslarının izlenmesi için açık kaynaklı bir görüntü analiz aracı açıklanmaktadır.

Tek Hücreli Dizilerin Canlı Hücre Görüntülemesi (LISCA) - Hücresel Kinetiği Ölçmek için Çok Yönlü Bir Teknik

Bu protokol, yaşlanan ve bölünmeyen hücrelerin darbeli SILAC, hedefsiz kütle spektrometrisi analizi ve protein yarı ömürlerinin kolaylaştırılmış bir hesaplaması ile metabolik etiketlenmesi için iş akışını açıklar.

Metabolik Etiketleme ve Kütle Spektrometrisi ile Yaşlanan ve Bölünmeyen Kültürlü Hücrelerde Protein Devir Hızlarının Ölçülmesi

Öğrenin tek hücreli protein yarı ömrü ölçümü için SNAP-tag ve floresans mikroskobu kullanımını. Bu yöntem hücre popülasyonlarındaki protein yıkımı heterojenliğini analiz eder.

Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Daha fazla video keşfet