Algılama ve kaldırma nükleaz kirlenme rekombinant prototip köpüklü virüs Integrase saflaştırılması sırasında

Bu protokolün genel amacı, protein saflaştırma sırasında kontamine nükleaz aktivitesini belirlemek ve ortadan kaldırmaktır. Bu yöntem; biyokimya, yapı ve entegrasyon dinamiği gibi retroviroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, saflaştırma sırasında ilgilenilen rekombinant bir proteinden kontamine DNA nükleaz aktivitesinin tanımlanmasına ve uzaklaştırılmasına olanak tanımasıdır.

Prototip köpüklü virüs integrazı eksprese eden bir E.coli peletinin buz üzerinde çözülmesiyle başlayın. Tüp buz üzerindeyken, 0,5 inç çapında bir biyoboynuz ve 0,125 inç çapında konik bir mikro uçla donatılmış bir sonikatör kullanarak %30 amplitude ile 30 saniye boyunca sonikasyon uygulayın. Sonikasyonun ardından, hücre örneğini soğuk bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de 60 dakika boyunca 120,000 ×g hızında santrifüjleyin.

Santrifüj işleminin ardından belirgin bir pelet oluşmalı ve süpernatan sarı renkli olabilir. Süpernatanı soğuk bir 50-mililitrelik konik tüpe aktarın. Ardından, 110-milimetre uzunluğunda ve beş-milimetre çapındaki FPLC kolonunu 1,5 mililitre nikel yüklü reçine ile hazırlayın.

İlk olarak, kolonu FPLC cihazına bağlayın ve tampon çözeltiyi uygulayın. Cihaz, iletkenlik ve 280 nanometredeki UV absorbansına ilişkin gerçek zamanlı verileri toplamalıdır. İletkenlik ve UV okumaları stabilize olmalıdır.

Gerekirse, okumalar stabil hale gelene kadar kolondan tampon akıtmaya devam edin. Bir superloop kullanarak protein örneğini, 0,15 milliliters per minute akış hızında ve 0,5 megapascal maksimum basınç limitinde kolona yükleyin. Superloop'u AKTA FPLC'ye bağlayın.

Kolonu yıkadıktan ve proteinleri elüe ettikten sonra; başlangıç akış (flowthrough), yıkama ve pik 280 nanometre absorbans fraksiyonlarından 15 µL'lik alikotlar alın ve her örneğe 15 µL 2X SDS-PAGE örnek tamponu ekleyin. Örnekleri üç dakika boyunca kaynatın. Her örnekten 10 µL'yi, dört µL önceden boyanmış protein standartlarıyla birlikte %10 SDS-PAGE jellerine yükleyin.

Hemen hemen saf prototip köpüklü virüs integraz içerdiği görülen fraksiyonları belirlemek için jeli görsel olarak inceleyin. Bu fraksiyonları birleştirin ve pipetleme sırasında hacmi not edin. Bu hacim genellikle 8 ila 10 mililitredir.

Bir spektrofotometre kullanarak, birleştirilmiş fraksiyonların 280 nanometredeki UV absorbansını ölçün ve toplam prototip köpüklü virüs integraz proteini miktarını hesaplayın. Tipik verim, indüklenmiş kültür litresi başına yaklaşık 10 miligramdır. Hekzahistidin etiketini kaldırmak için, prototip köpüklü virüs integrazı 10-millimolar DTT ve 0.1-millimolar EDTA nihai konsantrasyonu ile takviye edin.

Ardından, miligram başına 15 µg insan rhinovirüs 3C proteazı şeklinde prototip köpüklü virüs integrazı ekleyin ve 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Prototip köpüklü virüs integrazının heparin afinite kromatografisi fraksiyonlamasını gerçekleştirmek için, 1,5 hacim Tampon C ekleyerek örneğin sodyum klorür konsantrasyonunu 200 mM'ye düşürün. Ardından, seyreltilmiş prototip köpüklü virüs integraz örneğini, maksimum 1 MPa basınç sınırı ile 0,5 mL/dakika akış hızında heparin Sepharose kolonuna yükleyin. Kolonu yıkadıktan ve gradyan ile final yıkama örneklerini topladıktan sonra; yükleme, akış yolu, yıkama ve fraksiyonları %8 SDS-PAGE ile analiz edin.

Ardından, jeli Coomassie blue ile boyayarak fraksiyonları değerlendirin. Prototip köpüklü virüs integrazı ve kontamine nükleaz, heparin Sepharose kromatografisine karşı farklı afinitelere sahiptir. Nükleaz analizinde kullanmak üzere, neredeyse saf prototip köpüklü virüs integrazı içerdiği görülen heparin Sepharose fraksiyonlarını belirleyin.

Nükleaz analizine başlamak için, 3 µL heparin fraksiyonu, 50 ng 3 kb süper kıvrımlı plazmit DNA ve reaksiyon tamponunu 15 µL son hacme gelecek şekilde birleştirin. 37 °C'de 90 dakika inkübe edin. Reaksiyonu 1 mg/mL Proteinaz K ve %0.5 SDS ile durdurun ve 37 °C'de bir saat inkübe edin.

Ardından, nükleaz deneyi reaksiyonlarına 3,5 µL 6X yükleme boyası ekleyin ve tüm hacmi %1'lik agaroz jele yükleyin. Jeli, oda sıcaklığında 100 volt değerinde bir saat boyunca veya boya cephesi jelin sonuna ulaşana kadar çalıştırın. Elektroforez tamamlandığında, jelin floresan tarayıcı görüntüsü; lineer DNA'nın 3 kb boyutunda, süper kıvrımlı DNA'nın daha hızlı hareket ederek yaklaşık 2 kb civarında ve gevşemiş halkasal DNA'nın ise daha yavaş hareket ederek 3,5 kb'ye yakın bir noktada ilerlediğini göstermelidir.

Görüntü analiz yazılımı kullanarak, her şeritteki süper kıvrımlı, lineer ve gevşek halka plazmitlerin piksel hacmini hesaplayın. Bu üç DNA formunun piksel hacimleri toplamını toplam DNA değeri olarak belirleyin ve bunu lineer ve gevşek halkaların yüzdesini hesaplamak için kullanın. Kontamine nükleaz içeren fraksiyonlar, negatif kontrole kıyasla daha yüksek yüzde oranında lineer ve gevşek halkalar sergiler.

Kontamine nükleaz aktivitesi göstermeyen heparin Sepharose fraksiyonlarını birleştirin ve 10 milimetrelik, altı ila sekiz kilodalton moleküler ağırlık kesme sınırına sahip diyaliz tüplerine aktarın. Bir litre diyaliz çözeltisine karşı, dört °C'de gece boyunca diyaliz yapın. Ertesi gün, nükleaz içermeyen prototip köpüklü virüs integraz örneğini diyaliz tüplerinden geri kazanarak alın.

280 nanometrede absorbansı ölçün ve nihai protein konsantrasyonunu hesaplayın. Proteini alikotlayın ve sıvı azot içerisinde hızla dondurun. Ardından alikotları minus 80 degrees Celsius'ta saklayın.

Nükleaz analizi, bu videoda özetlendiği şekilde gerçekleştirilmiştir. Negatif kontroller, protein içermeyen plazmit DNA'yı ve nükleazdan arındırılmış olduğu bilinen vahşi tip prototip köpüklü virüs integrazının önceki bir saflaştırmasını içerir. Kontamine nükleaz aktivitesi için pozitif kontrol ise, kontamine nükleaz içerdiği bilinen katalitik olarak inaktif prototip köpüklü virüs integrazının önceki bir saflaştırmasıdır.

Bu prosedürü takiben, enzim kinetiği ve dinamikleri gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla biyokimyasal analizler veya tek molekül görüntüleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, rekombinant bir proteindeki kontamine nükleaz aktivitesinin nasıl belirleneceği ve giderileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.