Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon kullanarak fare tetkikine genetik Vivo içinde değişiklik kurucu ve indüklenebilir sistemleri

Bu yöntemin genel amacı, indüklenebilir gen veya shRNA ekspresyonu için vektör yapıları ile in vivo olarak hepatositlerin stabil transfeksiyonudur. Bu yöntem, karaciğer araştırması alanındaki temel soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Örneğin, karaciğer kanseri ve rejenerasyonundaki mekanizmaları araştırmak için uygulanabilir.

Bu tekniğin ana avantajı, CreER'in fare hepatositlerinde indüklenebilir bir transgen R shRNA ekspresyonu ile birlikte kombine ekspresyonudur in vivo hidrodinamik kuyruk veni enjeksiyonu ile elde edilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir tıp öğrencisi olan Eric Hubner olacak. Hedeflenen protein için kısa firkete RNA'sını içeren 150 nanogram giriş vektörünü 150 nanogram pTC Tet vektörü ve TE tamponu ile toplam sekiz mikrolitre hacme birleştirerek başlayın.

Daha sonra LR klonaz enzim karışımı II'yi buza aktarın ve iki dakika inkübe edin. Kuluçka sırasında iki kez girdap. Daha sonra reaksiyona iki mikrolitre LR klonaz enzim karışımı II ekleyin ve bir saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, bir mikrolitre proteinaz K çözeltisi ekleyerek reaksiyonu durdurun. Daha sonra 37 santigrat derecede on dakika inkübe edin. Ardından, standart bir ısı şoku protokolü kullanarak Stbl3 yetkin bakterileri iki mikrolitre klonlama karışımı ile dönüştürün.

Dönüşümü ampisilin içeren agar plakaları üzerine kapladıktan sonra, 24 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tek kolonileri seçin ve gece boyunca inkübasyon için küçük hacimlerde bakteri üreme ortamını aşılayın. DNA'yı izole ettikten ve Sanger dizilimi ile vektör bütünlüğünü doğruladıktan sonra, enjeksiyon için yapının maksimum ölçekli DNA hazırlıklarını hazırlayın.

Fareleri tartarak başlayın. Daha sonra mililitre endotoksin içermeyen Uyuyan Güzel vektör yapısı başına 15 mikrogram ve mililitre endotoksin içermeyen pchsB5 başına bir mikrogram içeren steril bir tuzlu su çözeltisi hazırlayın. Her fareye vücut ağırlığının% 10'u kadar bir hacim enjekte etmek için yeterli çözelti hazırlayın.

Steril 3 mililitrelik bir şırıngayı bir fare için gerekli hacimle doldurun ve 27 gauge iğne takın. Hareket için minimum alan, ancak nefes almak için yeterli alan bırakmak için uygun miktarda kağıt mendil ekledikten sonra, fareyi solunum delikleri olan uygun bir tutucuya yerleştirin. Kuyruğun hızlı hareketi veya diğer ajitasyon belirtileri gibi aşırı ısınma belirtilerini dikkatlice izlerken kızılötesi bir lamba kullanarak kuyruğu 30 ila 60 saniye ısıtın.

Ardından kuyruğu alkollü bir bezle temizleyin. İğneyi, kuyruğun tabanına yakın iki yanal kuyruk damarından birine neredeyse yatay olarak sokun. Başarılı bir şekilde yerleştirilirse, iğnenin konisine az miktarda kan geri akabilir.

Toplam hacmi sekiz ila on saniye içinde kuyruk damarına enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, fareyi hemen süzgeçten çıkarın. Enjeksiyon yarasını steril gazlı bezle en az 30 saniye veya herhangi bir kanama azalana kadar sıkıştırın.

Başarılı hidrodinamik kuyruk damarı enjeksiyonu, transfeksiyon için çok önemlidir ve özellikle enjeksiyon hızına, hacmine ve süresine bağlıdır. İntravenöz enjeksiyonu kolaylaştırmak için, farelerin enjeksiyon gününde strese girmediğinden veya susuz kalmadığından emin olun. Bir kurtarma kafesinde 30 ila 60 dakika yalnız kaldıktan sonra, fareyi orijinal kafesine geri aktarın.

Entegre olmayan vektörlerin temizlenmesini sağlamak için kuyruk veni enjeksiyonundan 10 ila 15 gün sonra Cre rekombinaz indüksiyonunu başlatın. On miligram tamoksifeni 40 mikrolitre etanol içinde çözün ve 55 santigrat derecede on dakika çalkalayarak inkübe edin. Tamoksifen çözülene kadar birkaç kez girdap.

Daha sonra 960 mikrolitre mısır yağı ekleyin ve 55 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Soğuduktan sonra, çözeltiyi 20 gauge iğne ile 1 mililitrelik bir insülin şırıngasına çekin. Ardından 27 gauge iğneye geçin.

Enjekte etmek için, önce farenin boynunu başparmağınız ve ikinci parmağınızla dikkatlice tutarak, kuyruğu elin tabanı ile dördüncü ve beşinci parmak arasına sabitleyerek fareyi tırmalayın. Daha sonra intraperitoneal olarak 0.1 mililitre solüsyonu karnın sol alt çeyreğine enjekte edin. On günden daha kısa deneyler için, aşağıdaki protokolü kullanarak içme suyu yoluyla sürekli olarak doksisiklin uygulayın.

İlk olarak, beş gram sakarozu 100 mililitre musluk suyunda ve otoklavda çözün. Daha sonra, 15 mililitrelik konik bir tüpte beş mililitre sakaroz çözeltisinde 100 miligram doksisiklin hiklat çözülür. Ardından, çözeltiyi 0,2 mikronluk bir filtreden steril olarak filtrelemek için 10 mililitrelik bir şırınga kullanın.

Daha sonra filtrelenmiş doksisiklin çözeltisini kalan 95 mililitre sükroz çözeltisine ekleyin ve çözeltiyi içme suyu yerine fareye verin. Her gün kontrol edin ve çözelti bulanıklaşırsa hemen değiştirin, çünkü bu bakteri üremesini gösterir. Bir mililitre% 4 paraformaldehit çözeltisi ile 27 gauge iğne ile 1 mililitrelik bir şırınga hazırlayın.

Medyan laparotomi yapmak ve ötenazi yapılan farenin karaciğerini ortaya çıkarmak için diseksiyon makası ve anatomik forseps kullanın. Portal veni ve inferior vena kava'yı ortaya çıkarmak için ince bağırsağı sağa doğru hareket ettirin. Hazırlanan şırınganın iğnesini inferior vena kava içine yerleştirin ve portal veni kesin.

Karaciğer dokusunu doldurmak ve otofloresan kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için yavaşça bir mililitre PFA enjekte edin. Karaciğeri çıkardıktan sonra, suyla durulayın ve kesitlemeden önce son fiksasyon için beş ila on mililitre% 4 PFA çözeltisine aktarın. İndüklenebilir bir Cre rekombinazın yapısal ekspresyonunu bir transgenin veya tercih edilen bir shRNA'nın indüklenebilir ekspresyonu ile birleştiren bir transpozon yapısının Cre raportör farelere enjeksiyonu, tamoksifen tarafından Cre rekombinaz aktivasyonundan sonra GFP raportör geninin sağlam ekspresyonunu gösterdi.

Doksisiklin tedavisinden sonra, transfekte edilmiş hepatositlerde uygun antikorlar tarafından indüklenebilir transgen ekspresyonu görüntülenebilir. İndüklenebilir shRNA ekspresyonu için, immünoboyama ile tespit edilen sitoplazmik GFP ekspresyonu, shRNA ekspresyonu için vekil bir belirteç olarak kullanılabilir. Karaciğere özgü bir promotör yapının kontrolü altında bir lusiferaz ekspresyon kasetini barındıran bir transpozon yapısı enjekte edildi.

Lusiferin enjeksiyonundan sonra, fareler hidrodinamik kuyruk veni enjeksiyonundan iki hafta sonra in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak görüntülendi. Görüntüleme, enjeksiyondan 15 gün sonra karaciğerde sağlam ve stabil lusiferaz biyolüminesansı gösterdi ve sistemin, biyolüminesans görüntüleme ile in vivo olarak transfekte edilmiş hücrelerin varlığını takip etmek için başarıyla kullanılabileceğini gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, hidrodinamik kuyruk damarı enjeksiyonları yaklaşık 15 dakika içinde gerçekleştirilebilirken, fare enjeksiyonumuzun klonlanmasından, transgen R shRNA ekspresyonunun indüksiyonundan karaciğerin hazırlanmasına kadar tüm prosedür yaklaşık üç ila dört hafta sürecektir.

Bu prosedürü denerken, plazmitlerin boyutunu ve dizi bütünlüğünü akılda tutmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, tercih ettiğiniz transgen R shRNA ile pTC Tet sistemini herhangi bir Crelux Pbase fare modeline nasıl uygulayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.