Name: Hücre tohum için özel özel Wells ve kendinden montajlı 3D baskı kalıpları kullanarak doku yüzük imalatı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Keşfedin, 3D baskı kalıpları ve özel kuyular kullanarak çeşitli boyutlarda kendi kendine birleşen doku halkaları üretme yöntemini. Bu teknik, farklı hücre türlerinden mühendislik dokularının yapısını, mekanik özelliklerini ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Minnetle onu yardım için Amanda Zoë Reidinger, Ph.D., Chris Nycz ve Karen Levi, M.E., kendi giriş kalıp tasarımı için yazdırma 3D ile Dr Erica Stults (akademik araştırma ve uygulama bilim adamı, TEFE bilgi teknolojisi Hizmetleri) kabul, Kathy Suqui ve Jennifer Mann kalıp tasarımları test onların yardım için ve filme ile yaptığı yardım için Michael O'Keefe.  Bu eser tarafından NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, HAS), NIH R15 HL097332 desteklenmiştir (MWR, TAH), NSF REU EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, HAS) ve NIH R15 HL137197 (MWR, HAS).
<div></div>

1. 3D baskılı kalıp hazırlama
<ol><li>Bir CAD çizimi istenilen boyutta kalıp hazırlamak.</li>
	<li>CAD dosya yüksek çözünürlüklü bir 3D yazıcıya gönderin. Uygun plastik baskı malzeme, parlak yüzey ile seçin.</li>
	<li>Yazdırma işleminden sonra kalıp deterjan ve su ile iyice yıkayın.</li>
</ol>2. döküm PDMS negatifleri
<ol><li>PDMS temel istenilen miktarda bir denge üzerinde ölçmek. İçin bir kalıp ile 60 mm çapında ve 2 mm de mesajlar, 25 g kullanın.</li>
	<li>1:10 (w/w) kür aracısı ekleme oranı PDMS tabanına.</li>
	<li>İki bileşen iyice kombine kadar karistirin. Yetersiz karıştırma PDMS, "yapışkan" bir yüzey kaynaklanan eksik kür olarak neden olabilir.</li>
	<li>Laboratuvar bant PDMS temel katmanının üstünde basılı kuyu oluşumu etkinleştirmek için 3D baskı kalıpları sınırlarındaki bir parça yer.</li>
	<li>PDMS karışımı kalıba dökün ve kalıp de-gaz için tüm kabarcıklar serbest kadar vakum bir odaya yerleştirin.</li>
	<li>Kaldırmak için PDMS 50 ° c için 2-4 h veya yeterli katılaşmış kadar tedavi.</li>
	<li>Laboratuvar bandı çıkarın ve dikkatle PDMS negatif ayıklayın.</li>
	<li>O kalıp tam tedavi emin olmak için (sonra 3D baskılı kalıp kaldırılması) ek bir 1 h için 60 ° C'de PDMS kuluçkaya.</li>
	<li>Herhangi bir kalıntı kaldırmak için PDMS deterjan ve su ile iyice yıkayın. Yetersiz yıkama zavallı halka oluşumunda PDMS negatif ilk kullanan için neden olabilir.</li>
</ol>3. özel Wells imalatı
<ol><li>Özel wells hücreleri tohum önce 1 gün hazırlayın.</li>
	<li>%2 (w/v) özel çözüm DMEM ve otoklav olun.</li>
	<li>İçine negatif bir autoclaved PDMS damlalıklı 4 mL erimiş özel. O zaman damlalıklı özel doğrudan PDMS yazı olarak negatif. Kabarcıklar inhomogeneities iyi boyutlarda neden gibi herhangi bir hava kabarcıkları damlalıklı bahşiş ile çıkarın.</li>
	<li>Not: kalıpları bantlayın değil; Böylece özel wells düzeye PDMS kaldırılması ve 6-şey kültür tabak içine yerleştirme özel üst yüzeyi düz, olması gerekir. Artık özel tekrar, her ne kadar birden çok kez re-autoclaved ve kullanılmış olabilir.</li>
	<li>Özel soğur sonra (4 mL özel; yaklaşık 10 dakikadır büyük kalıpları artık bu soğutma kez gerekebilir), dikkatle özel wells künt forseps kullanarak PDMS negatifleri ayırmak ve aktarım 6-şey plaka bir kuyunun içine.</li>
	<li>Tam kültür ortamında özel wells daldırın ve gecede kullanmadan bir 37 ° C kuluçka makinesi önce içinde equilibrate.</li>
</ol>4. tohum doku Yüzükler
<ol><li>Kültür sıçan aort düz kas hücreleri21 (RaSMCs) % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1'i içeren DMEM L-glutamine, %1 non-gerekli amino asitler, % 1 sodyum pyruvate ve % 1 penisilin-streptomisin % 70 izdiham ulaşana kadar. Not: Hücreleri % 5 CO2 ve 37 ° C'de 15 cm doku kültürü plakaları kültürlü.</li>
	<li>Sonra kalıplar equilibrated (Bölüm 3), RaSMCs tohum için hazırlamak.</li>
	<li>Tabak tabak fosfat tamponlu tuz (PBS) başına 5 mL ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>3 mL % 0.25 tripsin başına 15 cm Petri kabına ekleyin. Tabakları 37 ° C kuluçka makinesi 2-3 dakika, ya da hücreleri tabağını kaldırdı kadar gider.</li>
	<li>Tripsin tam kültür orta eşit bir hacmi (plaka başına 3 mL) ile nötralize. İyice kümeleri kadar kırmak için hücreleri resuspend.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 11: trypan mavi boya ile bir aliquot sulandırmak ve bir hemasitometre içeren hücreleri saymak.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 200 x g hücreleri cips de 5 min için toplam hacmi santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>ML başına 10 milyon hücre bir konsantrasyon hücreleri resuspend; Bu 50 µL başına 500.000 hücre sonuçlanır. Not: Farklı hücre tipleri farklı hücre konsantrasyonları gerektirebilir.</li>
	<li>Tüm özel kalıp ortamından Aspire edin. Tüm Orta bireysel kuyulardan kaldırmak için ancak kuyu dipleri delmek değil dikkatli olun.</li>
	<li>Damlalıklı 50 µL süspansiyon her kuyuya.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde taze orta özel kalıp dış çevresindeki 2 mL ekleyin. Özel kuyu orta taşma bırakmamaya dikkat et. Tabak gecede kuluçka (yaklaşık 16 h) yerleştirin.</li>
	<li>Gecede kuluçka sonra ortamından kalıpları dışında Aspire edin ve kalıpları ve yüzük tamamen batık 4.5 mL taze orta 6-şey plaka her şey için ekleyin. Değişim orta günlük.</li>
</ol>

<ol><li>L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+biological+tissue-engineered+human+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A completely biological tissue-engineered human blood vessel.</a> FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).</li>
<li>Adebayo, O., Hookway, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+smooth+muscle+cell+tissue+rings+exhibit+greater+tensile+strength+than+cell-seeded+fibrin+or+collagen+gel+rings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembled smooth muscle cell tissue rings exhibit greater tensile strength than cell-seeded fibrin or collagen gel rings.</a> J Biomed Mater Res A. 101 (2), 428-437 (2013).</li>
<li>Hayashi, K., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+stem+cell+aggregates+with+gelatin+microspheres+to+enhance+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Preparation of stem cell aggregates with gelatin microspheres to enhance biological functions.</a> Acta Biomater. 7 (7), 2797-2803 (2011).</li>
<li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering%3A+self-assembly+of+microtissue+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J Biotechnol. 148 (1), 46-55 (2010).</li>
<li>McAllister, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+haemodialysis+access+with+an+autologous+tissue-engineered+vascular+graft%3A+a+multicentre+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study.</a> Lancet. 373, 1440-1446 (2009).</li>
<li>Svoronos, A. A., Tejavibulya, N., Schell, J. Y., Shenoy, V. B., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-mold+design+controls+the+3D+morphological+evolution+of+self-assembling+multicellular+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Micro-mold design controls the 3D morphological evolution of self-assembling multicellular microtissues.</a> Tissue Eng Part A. 20 (7-8), 1134-1144 (2014).</li>
<li>Gwyther, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).</li>
<li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002(2011).</li>
<li>Laterreur, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+direct+burst+pressure+and+the+ring+tensile+test+methods+for+mechanical+characterization+of+tissue-engineered+vascular+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterization of tissue-engineered vascular substitutes.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 34, 253-263 (2014).</li>
<li>L'Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue-engineered+blood+vessels+for+adult+arterial+revascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.</a> Nat Med. 12 (3), 361-365 (2006).</li>
<li>Dash, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Engineered+Vascular+Rings+from+Human+iPSC-Derived+Smooth+Muscle+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tissue-Engineered Vascular Rings from Human iPSC-Derived Smooth Muscle Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (1), 19-28 (2016).</li>
<li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+tissue-engineered+vascular+media%3A+a+new+model+for+pharmacological+studies+of+contractile+responses%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses.</a> FASEB J. 15, 515-524 (2001).</li>
<li>Dikina, A. D., Strobel, H. A., Lai, B. P., Rolle, M. W., Alsberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+cartilaginous+tubes+for+tracheal+tissue+replacement+via+self-assembly+and+fusion+of+human+mesenchymal+stem+cell+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered cartilaginous tubes for tracheal tissue replacement via self-assembly and fusion of human mesenchymal stem cell constructs.</a> Biomaterials. 52, 452-462 (2015).</li>
<li>Twal, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellularized+microcarriers+as+adhesive+building+blocks+for+fabrication+of+tubular+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cellularized microcarriers as adhesive building blocks for fabrication of tubular tissue constructs.</a> Ann Biomed Eng. 42 (7), 1470-1481 (2014).</li>
<li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+facilitated+scaffold-free+tissue+unit+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">3D printing facilitated scaffold-free tissue unit fabrication.</a> Biofabrication. 6 (2), 1-11 (2014).</li>
<li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods%2C+tori%2C+and+honeycombs%3A+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> The FASEB Journal. 21 (14), 4005-4012 (2007).</li>
<li>Gwyther, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cellular+self-assembly+to+fabricate+cell-derived+tissue+rings+for+biomechanical+analysis+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering.</a> J Vis Exp. (57), e3366(2011).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+of+functional+biomaterials+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">3D printing of functional biomaterials for tissue engineering.</a> Curr Opin Biotechnol. 40, 103-112 (2016).</li>
<li>Jakab, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+by+self-assembly+and+bio-printing+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 022001(2010).</li>
<li>Lemire, J. M., Potter-Perigo, S., Hall, K. L., Wight, T. N., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Rat+Aortic+Smooth+Muscle+Cells+Differ+in+Versican%2FPG-M+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Rat Aortic Smooth Muscle Cells Differ in Versican/PG-M Expression.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (6), 821-829 (1996).</li>
<li>Strobel, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+self-assembly+with+microsphere+incorporation+for+growth+factor+delivery+within+engineered+vascular+tissue+rings%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cellular self-assembly with microsphere incorporation for growth factor delivery within engineered vascular tissue rings.</a> Tissue Eng Part A. 23 (3-4), 143-155 (2017).</li>
<li>Strobel, H. A., Calamari, E. L., Beliveau, A., Jain, A., Rolle, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+characterization+of+electrospun+polycaprolactone+and+gelatin+composite+cuffs+for+tissue+engineered+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22JBMR+Part+B%22%5BJournal%5D)">Fabrication and characterization of electrospun polycaprolactone and gelatin composite cuffs for tissue engineered blood vessels.</a> JBMR Part B. , In Press (2017).</li>
<li>Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+self-assembly+of+complex+cellular+aggregates+on+micromolded+nonadhesive+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Tissue Eng. 13 (8), 2087-2094 (2007).</li>
<li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Engineered+Vascular+Tissue+Generated+by+Cellular+Self-Assembly%22">Engineered Vascular Tissue Generated by Cellular Self-Assembly</a>. , Worcester Polytechnic Institute. (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada 3D baskı kullanarak kolayca özelleştirilmiş boyutları ile kendi kendine monte doku yüzük hızlı imalatı için çok yönlü bir yöntem sunulmuştur. Bizim yöntem Svoronos ve arkiçinde bildirilen benzer. 6 , nerede 3D baskılı petek ve köpek kemiği şeklinde Mum kalıpları kullanılmıştır PDMS negatifleri oyuncular için. Ancak, kalıpları birkaç benzersiz tasarım özellikleri içerecek şekilde değiştirilmiş. Bir çentik (şekil 4A(1)) her halka etiketli ve ayrı ayrı takip izin vermek için kalıp yönünü sağlar. Merkez delik (şekil 4A(2)) kuyu içine orta Difüzyon artırmaya yardımcı olur. En düşük CAD dosya numaralarını doğrudan kalıp yazdırılır; Bu nedenle, PDMS negatifleri her sürüm numarasıyla etiketlenmiştir ve çapı (şekil 4A3) sonrası. İyi tekneler (Resim 3(2), 45 °) ve orta delik (şekil 3(3), 5 °) üstündeki konik Dış duvarları (şekil 3(1), 5 °), 3D baskı kalıpları PDMS negatifleri kaldırmak kolaylaştırır , ve özel wells PDMS negatifleri kaldırmak daha kolay (şekil 4A(2), A(4)).
Bu sistem çok yönlülük çap ve hücre tipleri, birincil insan düz kas hücreleri (SMCs)18,22, sıçan aort SMCs7 de dahil olmak üzere çeşitli kendi kendine monte halka şeklinde dokuların imalatı tarafından göstermiştir , 23, insan Mezenkimal Kök hücre (hMSCs)13ve SMCs elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs)11 (Tablo 1). Devam eden çalışmalarda, biz ek hücre tipleri endotel hücreleri gibi halkalarından oluşumu değerlendirilmesi ve kıkırdak halkalar trakeal yerine potansiyel uygulamalar için farklı boyutlarda eritme. Tamamen hücre kaynaklı yapıları ek olarak, biz de yüzük dahil çapraz bağlı jelatin mikroküreler13,22ile imal etmek bu sistemi kullandık. Mikroküreler sırasında doku halkalar içinde kendinden montajlı ek mekanik güç sağlamak için eklenebilir veya teslim büyüme faktörleri13,22için yerelleştirilmiş.
Doku yüzük imalatı, cep numarası duruma getirilmesi farklı hücre türleri için gerekli olabilir. En düşük hücre sayıları farklı olabilir boyutu ve türü hücre dayalı. Örneğin, iPSCs türetilmiş hSMCs 600.000 hücreler/yüzük11, tohumlari, hMSCs ve birincil hSMCs 400.000 hücre/yüzük13,22ve aortik SMCs 500.000 hücreler/yüzük18, seribaşı sıçan tohumlari. Yalak boyutları da halka oluşumu ve hücre halka oluşumu24için gerekli en az sayıda etkileyebilir. İnsan hücreleri ve 3D baskı kalıpları ile çalışmaları için 2 mm yalak genişliğini kullanıldı. Özgün polikarbonat kalıpları 3.75 mm, 2 mm hücre yüzük18oluşturmak üzere 750.000 hSMCs gereken bir çukur genişliği vardı. Azaltılmış yalak genişliği ile 46 artışla, halka25başına 400.000 hücre hücreleri halka oluşumu için gerekli azaltmak başardık. Yüzük seribaşı hücre miktarları Tablo 1' de özetlenmiştir.
Bir 3D basılı malzeme seçerken, birçok faktör dikkate alınması gerekir. Çünkü PDMS genellikle 60 ° C'de tedavi, 3D basılı malzeme yeterince yüksek olması gerekir sıcaklık PDMS kür sırasında zarar görmemesi için erime. Bu çalışmada kullanılan malzeme erime sıcaklığı (özel bir malzeme Malzemeleri tablogörmek) mevcut değildir. Ancak, 1 h için 60 ° C'de pişmiş zaman biz malzeme bir koku üretmeye başladı görülmektedir. Böylece, Kavurma sıcaklığı 50 ° c daha düşük ve 3D basılı malzeme zarar vermeden PDMS fırında için kür süresini artırmak karar verdi. Zaman kür olarak ayarlamalar kalıpları formu daha büyük PDMS negatifler için değiştirdiyseniz gerekli olabilir. 3D baskı kalıpları PDMS kaldırılması sonra 60 ° C'de ek bir kuruma süresi son PDMS negatif 3D baskılı kalıp maruz sıcaklık sınırlama yapışkan, kalan üzerinden engeller. Bazı malzemeler PDMS kür inhibe Not, bu yüzden seçilen malzeme PDMS ile uyumlu olduğundan emin olun. Son olarak, kalıp malzeme toksisite de dikkate alınmalıdır. 3D baskılı kalıp hücreleri ile doğrudan temas olmayacak olsa da, bazı kalıntı kalıp üzerinden PDMS kavurma işlemi sırasında negatif transfer mümkündür. Çok ayrıntılı yıkama deterjan ile herhangi bir kalıntı PDMS negatif kaldırmak için yeterli olduğunu ortaya koymuştur. Ancak, biz daha önce yetersiz yıkama birkaç negatif PDMS kullanımları liderliğindeki zavallı halka oluşumu için ilk özel Wells için görülmektedir. Diğer 3D basılı malzemelerden PDMS dökme kullanımı deterjan kalıp artıkları, herhangi bir potansiyel leachates de dahil olmak üzere kaldırmak için yeterli olduğunu doğrulamak için ek bir araştırma gerektirir. Periyodik test de mümkün geçer (hatta 50 ° C) Isıtma zaman içinde kalıp zarar ve artar kalıntı tekrarlanan kullanımdan sonra neden tekrar olarak gerekli olabilir. Bugüne kadar biz tek bir 3D baskılı kalıp başarıyla doku halkaları oluşturmak için kullanılan 30'dan fazla PDMS negatifleri üretmek için kullandık.
Genel olarak, 3D yazdırma polikarbonat işleme daha daha fazla çok yönlülük özel Kalıpları imalatı için sağlar. Takım ile mümkün olduğundan daha yüksek bir çözünürlük sağlar ve kalıp tasarımı araçları kullanılabilir boyutları ile sınırlı değildir. Bu daha fazla özelleştirme için sağlar ve bu sivrilen gibi özellikleri ek işleme ile mümkün olmayabilir. Bu sistem diğer şekilleri de, kendi kendine monte dokularda Yüzükler6,17ek olarak imalatı için uygulanabilir. Yüzük imalat yöntemi kullanarak, hücre tipleri ve boyutları trakeal doku Mühendisliği13, mühendislik kan damarlarının7ve modelleme vasküler hastalıklar11potansiyel uygulamalar için çeşitli doku halkalarından geliştirdik.

Hücresel kendinden montajlı mühendislik doku kan damarları imalatı için yaklaşımlar bir iskele tabanlı yaklaşımlara alternatiftir. Kendi kendine montajı, iskele ücretsiz doku daha fazla hücre yoğunluğu, Gelişmiş matris ifade ve güç ve İskele tabanlı dokular1,2,3' e,4 karşılaştırıldığında geliştirilmiş biyolojik fonksiyonu olabilir . Ancak, belirli boyut ve şekillerde eksojen iskele desteğiyle kullanmanıza gerek kalmadan 3D doku oluşturan bir meydan kalır. Bu işlem zaman alıcı ve emek yoğun5olmasına rağmen bazı yöntemler birlikte kalın yapıları oluşturmak için hücre yaprak katmanları sigorta. Alternatif olarak, hücre yapışkan olmayan kalıplara seribaşı olabilir ve izin pulcuklarının, yüzük ve diğer doku şekiller6,7,8içine toplamak için.
Kendi kendine monte doku yüzük gerektiren daha az sayıda hücre ve kısa kültür süreleri ve daha büyük daha az reaktifler borulu dokular, mühendislik ama hala mekanik test, histolojik olarak incelenmesi veya contractility ve diğer fonksiyonel test7 için kullanılan , 9 , 10 , 11. fabrikasyon hızla ve kolayca test çünkü doku yüzük kültür parametreleri çok sayıda eleme için idealdir ve potansiyel hastalık modelleri11 olarak kullanmak için veya uyuşturucu12eleme için araçlar. Ayrıca, kan damarları veya Trakea7,13gibi daha karmaşık doku yapılarına yüzük erimiş ve yüzük pulcuklarının14,15gibi diğer şekiller daha tamamen sigorta.
Özel yaygın Biyouyumluluk, geçirgenliği ve hücre içi yapışkanlı özellikleri kendi kendine monte doku imalatı için bir kalıp malzemesi olarak kullanılır. Örneğin, Norotte ve ark. özel kalıp kalıp şekli ve gerekli özel ekipman15üzerinde sınırlı denetim etkin extruded çubuklar gelen fabrikasyon. Tan ve ark. aljinat damlacıkları birimleri çeşitli şekiller (Piramit, Meydanı)16özel hidrojel kalıpları imal bina olarak yatırılır. Ancak, aljinat pulcuklarının (300 µm) geniş çaplı özellikleri düşük çözünürlük ile sonuçlandı. Düşük çözünürlüklü hücre toplama tutarlılık olumsuz etkileyebilir düzensiz kalıp yüzeyler neden olabilir. Alternatif olarak, özel polimer negatifleri pürüzsüz özellikleri ve belirli boyutlara6,7,17ile yapışkan olmayan kalıpları oluşturmak için içine çevirebilirsiniz.
Biz daha önce özel Anüler özel hücre tohum kuyulardan çentikli polikarbonat kalıp7,18PDMS negatif rol imalatı için bir sistem bildirdi. Özel PDMS negatif içine dökülür ve7,18ayarlamak için izin. Hücreleri sonra iskele ücretsiz doku yüzük 24 h7,18az nerede onlar kendi kendine monte forma toplanan, özel kuyu seribaşı. PDMS negatif autoclavable vardır, birçok kez yeniden kullanılabilir ve yumuşak ve esnek, katılaşmış özel wells kaldırmak kolaylaştırır. Ne zaman bu sistem başlangıçta Gwyther vd. rapor edildi 7, PDMS negatifleri üzerinden döküm edildi öğütülmüş polikarbonat kalıpları (şekil 1A). Özel döküm sonra hücre tohumlama wells tek tek kesip ve bir 12-şey plaka7,18kuyu yerleştirilir. Öyle ki bir tek özel kalıp 5 yüzük üretir ve bireysel wells kesmek için ihtiyacını ortadan kaldırarak ve PDMS ve özel her halka (şekil 1B) üretmek için gereken miktarını azaltarak 6-şey plaka, kuyuda uygun tasarımı daha yakın zamanda güncellenmiştir. Çukur genişliği tohum küçük bir hücre numaralı seribaşı hücreleri halka oluşumu ulaşmak için gereken sayısını azaltmak için kullanıldı. Bu değişikliklere rağmen çözünürlük ve özelleştirme kalıp kullanılabilir standart frezeler boyutları için sınırlı ve micromilling çok pahalı olabilir. Ayrıca, sayısal kontrol (CNC) bilgisayar işleme zaman alıcı olabilir ve zaman ayırmak için ihtiyaç nedeniyle hantal ağır özel donanımları, bilgisayar destekli tasarım (dönüştürmek için ek bilgisayar destekli üretim (CAM) yazılım kullanılan CAD) dosyasına bir programlanabilir araç yolu ve işleme sırasında polikarbonat bölümünün güvenilir fikstür.
Bu da çalışmanın, 3D baskı CNC İşleme alternatif olarak kullanımı inceledi. 3D baskı için iskele malzemeleri imalatı mühendislik özel implantlar ve hücre ve doku pulcuklarının15,19,20doğrudan baskı için yaygın olarak kullanılır. Bir yüksek çözünürlüklü 3D printerlere harcama maddeler kullandık ve özel 3D ile pürüzsüz bir katı bir kalıp yazdırmak için bize etkin malzeme baskı, parlak yüzey kalitesi ( Tablo malzemelerigörmek). Bizim teknik PDMS negatifleri ve özel wells döküm için kullanılan son derece özelleştirilebilir, yüksek çözünürlüklü plastik kalıp imalatı için izin verir. Tasarım yineleme şekil 1' de özetlenmiştir. Kalıp tasarımı daha fazla 3D baskı kalıpları üzerinden her iki PDMS negatifleri ve PDMS negatifleri özel kuyulardan kaldırılmasını kolaylaştırmak için konik Dış duvarları ve merkezi delik kapsayacak şekilde kalıp 3D yazdırılan sürümünde değişiklik yapıldı. Bu konik özellikler işlemleri işleme standardı ile elde edilemez. Kalıp alt kuyu dibinden Uzaklik kalın özel mesaj özel iyi kaldırma sırasında kırılma riskini azaltmak için belgili tanımlık posta aşağıda temel sonuçlanan bu yinelemedeki yükseltilmiştir. Kalıp ve halka üretim yordamı şematik Şekil 2' de gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50040</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>VeroWhite</td><td>StrataSys</td><td>RGD835</td><td></td></tr><tr><td>3D yazıcı</td><td>StrataSys</td><td>Objet 260 Connex</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000069</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Kalem-strep</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>WKY 3M-22 sıçan aort düz kas hücreleri</td><td>T. Wight tarafından sağlanmıştır [ref 21]</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre tohum için özel özel wells ve kendinden montajlı 3d baskı kalıpları kullanarak doku yüzük imalatı

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Mühendislik doku klinik olarak doku onarım ve yedek için kullanılmakta olan ve uyuşturucu taraması ve insan hastalık modelleme araçları olarak geliştirilmektedir. Kendi kendine monte doku iskele tabanlı doku Mühendisliği, Gelişmiş matris ifade, güç ve işlevi gibi avantajlar sunuyor. Ancak, 3D doku hücreleri veya destekleyici bir iskele içinde tohum olmadan imalatı için kullanılabilir birkaç yöntem vardır. Daha önce yapışkan olmayan özel kuyu hücreleri tohum tarafından kendi kendine monte doku yüzük imalatı için bir sistem geliştirdi. Bir polydimethylsiloxane (PDMS) negatif önce işlenmiş polikarbonat kalıp içinde atama, ve sonra özel wells tohum halka şeklinde hücre oluşturmak için PDMS içinde negatif genellikle. Ancak, bu yaklaşım çok yönlülük araçları polikarbonat kalıp işleme için kullanılabilir çözünürlük sınırlı. Burada, 3D baskılı plastik işlenmiş polikarbonat alternatif olarak PDMS negatifleri imalatı için kullanılabileceğini göstermektedir. 3D baskılı kalıp ve gözden geçirilmiş kalıp tasarım kullanmak basit, ucuz üretmek ve önemli ölçüde daha az özel ve PDMS de tohum hücre başına gerektirir. Elde edilen özel wells özelleştirilmiş çapı farklı hücre tipleri çeşitli kendi kendine monte doku halkaları oluşturmak için kullanılabileceğini göstermiştir. Yüzük daha sonra mekanik, işlevsel ve histolojik analizler için veya daha büyük ve karmaşık borulu doku imalatı için kullanılabilir.

Bu sistem için basit, hücrenin hücre kendinden montajlı halka şeklinde 3D sağlayan wells tohum özel özelleştirilmiş imalat doku Mühendisliği sağlar. 3D baskı nerede boyutları kullanılabilir aracı boyutları tarafından kısıtlı olan polikarbonat, işleme daha kalıp tasarım daha iyi çözünürlük ve daha fazla esneklik sağlar. 3D yüksek çözünürlüklü bir yazıcıda, duvarları 0.254 mm ince yazdırılabilir ve yalak boyutları yazıcı (15,2 µm çözünürlük bu çalışmalar için) çözünürlüğün sadece sınırlıdır. Bu tekneler daha küçük genişliklerde oluşturmak mümkün değil genellikle, CNC endmills daha az 0,3 mm ticari olarak mevcut değildir. Mikro-freze daha küçük özellikler üretebilir, ekipman gerekli, ancak prohibitively pahalı veya erişilemeyen birçok Biyomedikal Araştırma Laboratuvarları için olabilir. Ayrıca yalak boyutları ve eğrilik frezeler ucu şekli ile sınırlıdır. Ayrıca, özellikleri gibi açılı veya konik duvarlar mümkün olmayan ve küçük özellikler işleme işlemi sırasında bozabilir.
CAD çizimleri, 3D baskı kalıpları ve özelleştirilebilir boyutları PDMS negatif üretmek için kolayca değiştirilebilir. Şekil 3 önceki tasarım yinelemelere göre bizim geçerli 2 mm yazı 3D baskı kalıpları, boyutları açıklar. Ucuz bir işlemdir; 2 mm, 5-ring 3D baskılı kalıp maliyeti 3D yazıcı 44.67 USD ve her bölümü birden fazla PDMS negatif oluşturmak için kullanılabilir. Bugüne kadar biz tek bir 3D baskılı kalıp 30'dan fazla PDMS negatifleri oluşturduk. Her olumsuz PDMS 0,11 USD 25 g g (PDMS negatif 2,75 YTL) ücret gerektirir. Her PDMS negatif deterjan ile autoclaved, temizlenmesi ve kullanım sıklığını bağlı olarak birkaç yıl kadar yeniden kullanılır. İçin özgün tasarım18karşılaştırıldığında, kompakt 3D baskılı kalıp önemli ölçüde daha az PDMS ve özel başına 2 mm doku halka (şekil 1E) kullanır.
Hücreleri numaralı seribaşı dengelenmiş özel Wells toplama formu doku halkalara az 24 h yüzük boyutları özel wells boyutları üzerinde bağlıdır. Burada, kendi kendine monte sıçan düz kas hücre yüzük Wells ile 2, 4 veya 12 mm çap Mesaj (şekil 4) sahte olduğu gösterilmiştir. Yüzük bu çalışmada sadece 3 gün boyunca kültürlü, daha önce hSMC yüzük ilâ 2 hafta22kültürlü ve 3 hafta13için hMSC-kıkırdak halkalar. 3D vitro modelleri doku kantitatif değerlendirmesi için insan dokuların11 ve mekanik mukavemeti13,22işlev ve ayrıca modüler yapı birimleri olarak hizmet olabilir daha önce bildirildiği gibi yüzük işlev görebilir tüp şeklindeki doku yapıları7,13oluşturmak. Tohumlama koşulları hücre ve doku halkalar bu hücre tipleri tasarlanmış işlevsel özniteliklerini Tablo 1' de özetlenmiştir.
<img alt="Polimer kalıp imalatı, A-D diyagramları, 15/5 kuyulu formatlar, PDMS/agaroz kullanım tablosu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1: polikarbonat kalıp tasarımları. Başlangıçta, 15-şey kalıpları polikarbonat(a)işlenmiş. Sonraki sürümleri daha kompakt tasarım (B), bir tek polikarbonat kalıp ve 6-şey plaka bir kuyu içinde uyacak şekilde tasarlanmış 5 kuyu ile özel. Burada, 3D baskılı plastik işlenmiş Polikarbonat (C) daha fazla özelleştirilebilir alternatif olarak kullanmak için bu tasarımı değiştirildi. (D) ilk fabrikasyon özel wells (solda)18 mevcut kompakt tasarım için (sağda), karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az özel gerektirir ve does değil istemek Wells manuel ayırma tasarım gösterilmiştir. Miktarda PDMS ve her tasarım yineleme için gerekli özel (E) gösterilir. 2 mm çapında Merkezi mesajlar vardır. Kalıp(a)6 cm x 12 cm, (B) 5 cm çapında ve (C) 6 cm çapında olduğunu. Ölçek çubuğu (D) = 3 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Agaroz kuyusu imalatı ve kendinden montajlı halka işlem şeması; Doku halkası oluşumuna 3D kalıp." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Şekil 2: kendi kendine monte doku yüzük imalatı. Bir 3D baskılı kalıp sonra özel wells(a)döküm için kullanılan negatif bir PDMS döküm için kullanılır. Hücreleri sonra nerede daha az 24 h formu doku halkalara (B) toplamak, doğrudan özel kuyu içine numaralı seribaşı. (B) kesik çizgiler iyi anahat göster. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Polikarbonat kalıp tasarım şeması; farklı formatlar için teknik özellikler tablosuyla birlikte AF etiketli boyutlar." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Şekil 3: kesit görünümü 3D baskılı kalıp CAD çizim. Çukur genişliği(a), yalak yüksekliği (B), Merkezi delik (C), toplam çapı (D), dış dudak (E) ve dış duvar yüksekliği (F) için boyutları gösterilir. Dış duvarlar (1), wells (2) ve merkezi delik (3) üst bölümü (1 ve 3, 45 ° 2 için 5 ° açıyla) PDMS negatif kaldırma kolaylığı geliştirmek için konik. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="3D baskılı kalıp CAD modelleri, PDMS negatif döküm, mikroakışkanlar için agaroz kuyusu proses diyagramı." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Şekil 4: CAD çizimleri ile ilgili PDMS negatifleri ve kendi kendine monte SMC halkalar ve 2 (A), 4 (B) ile 12 (C) mm çapları sonrası. (A)(1) gösterir yönlendirmesini sağlamak için bir çentik, perfüzyon artırmak için merkezi bir delik gösterir (2), (3) doğrudan PDMS negatifleri izlerini, bir dosya numarası ve (4) gösterir dış duvar, hangi PDMS negatif kaldırma kolaylığı için konik. Ölçek çubukları özel Wells 1 cm. = <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hücre tipi</td>
			<td>Yüzük seribaşı hücreleri</td>
			<td>Halka Çapı</td>
			<td>Kültür süresi</td>
			<td>Fonksiyonel analiz gerçekleştirilen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sıçan SMC</td>
			<td>0.5, 1 veya 3 x 106
</td>
			<td>2, 4 veya 12 mm</td>
			<td>3 gün</td>
			<td>Geçerli çalışma; N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>
SMC IPSC türetilmiş 11
</td>
			<td>0,6 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>17 gün</td>
			<td>Contractility test, uniaxial çekme testi, histolojik analizi</td>
		</tr>
<tr>
<td>
İnsan SMC 22
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>2, 7 veya 14 gün</td>
			<td>Uniaxial çekme testi, histolojik analizi</td>
		</tr>
<tr>
<td>
İnsan MSC 14
</td>
			<td>0,4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>21 gün</td>
			<td>Uniaxial çekme testi, histolojik analizi, yüzük füzyon ve test, farklılaşma kıkırdak doku içine tüp sıkıştırma</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: hücre sayıları yüzük fabrikasyon farklı hücre türleri için gerekli.

Bu iletişim kuralı kendi kendine monte doku yüzük değişken boyutları kullanarak özelleştirilmiş bir 3D Baskılı Plastik kalıp imalatı için bir platform açıklar. PDMS negatifleri 3D baskılı kalıp içinde tedavi; o zaman özel içinde tedavi PDMS negatif atıldı. Hücreleri nerede doku yüzük içine toplamak elde edilen özel kuyu içine numaralı seribaşı.

Hücre tohum için özel özel Wells ve kendinden montajlı 3D baskı kalıpları kullanarak doku yüzük imalatı

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli boyutlarda kendi kendine monte edilmiş doku halkaları yapmak için kullanılan özel hücre tohumlama kalıpları oluşturmaktır. Bu yöntem, doku yapısını, gücünü ve işlevini değerlendirmek için kullanılabilecek insan hücrelerinden üç boyutlu doku halkaları oluşturmamızı sağlar. Bu tekniğin birincil avantajı, özel boyutlara sahip kendi kendine monte edilen dokular için kalıplar üretmek için basit bir yöntem olmasıdır.Prosedüre başlamak için, istenen boyutlarda bir kalıp çizimi oluşturmak için bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanın. CAD dosyasını yüksek çözünürlüklü bir 3D yazıcıya gönderin. Kalıbı, 50 santigrat derecede stabil olan parlak bir yüzeye sahip bir plastiğe yazdırın.Baskılı kalıbı bir fırça, deterjan ve su ile iyice yıkayın. Kalıbı damıtılmış suyla durulayın ve bir rafta kurumaya bırakın. PDMS kürleme sıcaklığında stabil olan 3D baskılı bir plastik seçmek önemlidir.Isıtma sırasında PDMS'ye geçen kalıntılar halka oluşumunu etkileyebilir. Ardından, tek kullanımlık bir tartı teknesinde 25 gram PDMS tabanı ölçün. Sertleştirme maddesini ağırlıkça 1:10 oranında ekleyin ve baz ve sertleştirici iyice karışana kadar kuvvetlice karıştırın.Ardından, basılı kuyucuklarla yüzün etrafında yaklaşık bir santimetre yüksekliğinde bir duvar oluşturmak için kalıbın kenarlarına laboratuvar bandı sabitleyin. Bant duvarında boşluk olmadığından emin olun. PDMS karışımını 3D baskılı kalıba dökün.PDMS'yi bir vakum odasında 30 ila 60 dakika veya hiç kabarcık kalmayana kadar gazdan arındırın. PDMS'yi 50 santigrat derecede iki ila dört saat veya PDMS kalıptan çıkarılacak kadar katı olana kadar kürleyin. Ardından bandı çıkarın ve PDMS negatifini kalıptan dikkatlice ayırın.Tamamen kürlendiğinden emin olmak için PDMS negatifi 60 santigrat derecede bir fırında bir saat inkübe edin. Ardından, negatifi deterjan ve suyla iyice yıkayın. Kalıbı damıtılmış suyla durulayın ve kurumaya bırakın.Agaroz kalıbını imal etmeden önce, PDMS negatifini, bir çift künt forsepsleri ve istenen diğer aletleri otoklavlayın. İmalata başlamak için, DMEM'de en az 50 mililitre yüzde iki agaroz hazırlayın ve otoklavlayın. Halka tohumlamadan bir gün önce agaroz kuyuları hazırlayın.Kalıbı aşırı doldurmamaya dikkat ederek dört mililitre erimiş agarozu otoklavlanmış PDMS negatifine pipetleyin. Ardından, erimiş agarozu agaroz kuyusu direkleri için boşluklara pipetleyin. Tüm hava kabarcıklarını gidermek için pipet ucunu kullanın.Son agaroz yüzeyi düz olmalıdır. Agarozun yaklaşık 10 dakika soğumasına izin verin. Ardından, soğutulmuş agaroz kalıbını PDMS negatifinden dikkatlice ayırmak için künt forseps kullanın.Kalıbı yüzü yukarı bakacak şekilde altı oyuklu bir plakanın bir kuyusuna yerleştirin. Agaroz kuyucuklarının tamamen suya batırılması için uygun tam kültür ortamını plakaya iyice ekleyin. Kullanmadan önce agaroz kuyularını gece boyunca 37 santigrat derecede dengeleyin.İlk olarak, 15 santimetrelik bir kültür kabında, Sıçan Aort Düz Kas Hücrelerini yüzde 5'lik bir karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede yüzde 70 birleşme elde edilene kadar kültürleyin. İstenen agaroz kalıbı hazırlandıktan ve gece boyunca dengelendikten sonra, kültür kabını beş mililitre fosfat tamponlu tuzlu su ile iki kez durulayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, yemeğe üç mililitre yüzde 0.25 tripzin ekleyin.37 santigrat derecede iki ila üç dakika veya hücreler tabaktan çıkana kadar inkübe edin. Tripzini üç mililitre tam kültür ortamı ile nötralize edin. Hücreleri konik bir tüpe aktarın ve iyice yeniden süspanse olana kadar hücreleri nazikçe pipetleyin.Hücre süspansiyonunun bir aliquat'ını eşit hacimde tripan mavisi boya ile seyreltin ve hücreleri bir hemositometre ile sayın. Ardından, süspansiyonu beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve mililitre başına 10 milyon hücre konsantrasyonu elde etmek için hücreleri tam kültür ortamında yeniden süspanse edin.Tutarlı halka oluşumunu sağlamak için en önemli adımlar, kullandığınız hücre hattı için hücre sayısını ve kültür ortamını optimize etmektir. Ardından, dengelenmiş agaroz kuyularını elde edin. Kuyucukların diplerini delmemeye dikkat ederek, tüm ortamı hem agarozun dışından hem de agaroz kuyularının içinden dikkatlice aspire edin.Her bir oyuğa 50 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetleyin. Ortamın kuyucuklara dökülmesine izin vermeden, agaroz kuyularının dışına iki mililitre taze ortam ekleyin. Hücrelerin toplanmasına izin vermek için plakayı gece boyunca yüzde beş CO2 atmosferinde 37 santigrat derecede inkübe edin.Ardından, ortamı agarozun dışından aspire edin. Plakaya 4.5 mililitre taze ortam ekleyin, böylece agaroz kuyuları doldurulur ve tüm agaroz kalıbı tamamen suya batırılır. Doku halkaları yeterince gelişene kadar plakayı inkübe etmeye devam edin ve ortamı her gün değiştirin.Ardından, her bir doku halkasını forseps kullanarak direğinden yavaşça kaydırın. Hemen, halkaları histoloji için sabitleyin veya halkaları fonksiyonel veya mekanik değerlendirmeler için kullanın. 3D baskı, daha esnek kalıp tasarımına izin verdi.Direk çapları, iki, dört ve on iki milimetre çapındaki direklerin etrafında üretilen sıçan düz kas hücresi halkalarımda gösterildiği gibi kolayca değiştirildi. Doku halkaları ayrıca birincil insan SMC'lerinden insan mezenkimal kök hücrelerinden ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen SMC'lerden hazırlanmıştır. Halkalar, doku fonksiyonu ve mekanik mukavemetin değerlendirilmesi için in vitro doku modelleri olarak kullanıldı.Bu yöntem başlangıçta vasküler dokuyu imal etmek ve modellemek için tasarlanmış olsa da, kıkırdak, iskelet kası ve kalp dokusu gibi diğer doku tiplerinin segmentlerini de imal etmek için kullanılabilir. Bu yöntem, araştırmacıların farklı boyutlarda 3D doku halkaları üretmek için özel kalıplar oluşturmaları için basit bir yol sağlar. Bu halkalar, farklı hücre tiplerinden yapılan mühendislik dokularının yapısını, mekanik özelliklerini ve işlevini değerlendirmek için kullanılabilir.

fabrication-custom-agarose-wells-for-cell-seeding-tissue-ring-self

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu makalede, hücresel öz-montaj hücre kökenli doku halkaları oluşturmak için çok yönlü bir yöntem özetlemektedir. Düz kas hücreleri içine numaralı seribaşı halka şeklinde agaroz kuyuları agrega ve 7 gün içinde sağlam bir üç boyutlu (3D) dokular oluşturmak için sözleşme. Milimetre ölçekli doku halkaları mekanik test için elverişli ve doku montaj için yapı taşları olarak hizmet.

Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Bir bioprinter bir kurban kalıp dayalı desenli hidrojeller oluşturmak için kullanıldı. Poloksamer kalıp ikinci bir hidrojel ile dolduruldu ve daha sonra üçüncü bir hidrojel ile doldurulmuş boşluklar bırakarak elüt edilmiştir. Bu yöntem Biyopolimerlerin karmaşık mimarileri oluşturmak için hızlı sağım ve poloksamerin iyi baskı kullanır.

Desenli ve Yaratılış 3D Hücre Kültürü için iki bileşenli Hidrojeller için Thermoresponsive Ters Kalıpları Baskı

Heterojen hücre popülasyonlarına sahip yük taşıyan dokuların mühendisliği ve analizi hala bir zorluktur. Burada, tek bir yapı içinde çeşitli hücre popülasyonlarının birlikte kültürü için bir platform olarak iki katmanlı aljinat hidrojel diskler oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz.

Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform

Ölçeklenebilir mühendislik kan damarları klinik uygulanabilirliğini artıracaktır. Kolayca büyükçe 3D baskılı kılavuzları kullanarak, damar düz kas halkaları oluşturulan ve bir damar grefti oluşturan, boru şeklinde bir forma yığılmış. Greftler sadece 3D baskılı kılavuz boyutunu değiştirerek insan koroner arter boyutları aralığını karşılamak için büyüklükte olabilir.

3D Baskılı Kılavuzları ve Halka İstifleme Yöntemiyle Engineered Vasküler Greft ölçeklendirme

Burada biz hidrojel tabanlı karmaşık geometriler mühendislik kurcalayarak üretmek için kullanılan özel polydimethylsiloxane kalıpları imalatı için hızlı, facile ve düşük maliyetli bir yöntem mevcut. Ayrıca bu tekniği kullanılarak üretilen mühendislik kalp dokuları üzerinde yürütülen mekanik ve histolojik değerlendirme sonuçları açıklanmıştır.

Özel doku kültürü kalıpları lazer kazınmış ustalardan mühendislik

Protokol, standart bir floresan mikroskobunda oksijenasyonlarının ve hücre ölümlerinin çok parametrik analizini kullanarak biyobaskı için yüksek verimli sferoid üretimini tanımlar. Bu yaklaşım, sferoidlerin yaşayabilirliğini kontrol etmek ve 3D doku, tümör mikroçevresi ve başarılı (mikro) doku biyofabrikasyonunun modellenmesinde önemli olan standardizasyonu gerçekleştirmek için uygulanabilir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Mevcut protokol, 3D baskılı damga benzeri bir cihaz kullanarak uygun maliyetli bir şekilde büyük ölçekte doku sferoidleri üretmek için bir tekniği açıklamaktadır.

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Bu yazıda, organoidlerin yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak kültürlenebildiği ve gözlemlenebildiğimm2 başına yüzlerce mikro konteynere sahip yeni bir kültür substratı türü için bir üretim protokolü sunulmaktadır. Hücre tohumlama ve immün boyama protokolleri de detaylandırılmıştır.

Organoidlerin kültürü ve 3D görüntülenmesi için yüksek verimli bir platform

Bu çalışma, agaroz kalıplarında mikro kuyular oluşturmak için damga tabanlı bir sistem kullanarak 3D hücre yapıları oluşturmak için uygun maliyetli ve verimli bir metodoloji sunmaktadır. Sistem, tek tip sferoidlerin/organoidlerin oluşumunu teşvik eder, böylece hücre etkileşimlerini iyileştirir. Bu yaklaşım deneysel değişkenliği azaltır ve ilaç testi ve doku mühendisliğindeki uygulamaları destekler.

Yeni Bir Damga Cihazı Kullanılarak İki Boyutlu Hücre Kültürlerinden Üç Boyutlu Sferoidlerin/Organoidlerin Üretilmesi

İn vitro gametogenezi tamamlayan yeni bir iskelesiz agaroz kalıbında yumurtalık foliküllerini kültürleme yöntemlerini açıklıyoruz.

İskelesiz Fare Yumurtalık Folikül Kültürü için Özelleştirilebilir Agaroz Kalıplarının Üretimi ve Kullanımı

Keşfedin, 3D baskı kalıpları ve özel kuyular kullanarak çeşitli boyutlarda kendi kendine birleşen doku halkaları üretme yöntemini. Bu teknik, farklı hücre türlerinden mühendislik dokularının yapısını, mekanik özelliklerini ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılır.

Hücre tohum için özel özel Wells ve kendinden montajlı 3D baskı kalıpları kullanarak doku yüzük imalatı

Daha fazla video keşfet