Hücre tohum için özel özel Wells ve kendinden montajlı 3D baskı kalıpları kullanarak doku yüzük imalatı
2 Nisan 2018
Bu iletişim kuralı kendi kendine monte doku yüzük değişken boyutları kullanarak özelleştirilmiş bir 3D Baskılı Plastik kalıp imalatı için bir platform açıklar. PDMS negatifleri 3D baskılı kalıp içinde tedavi; o zaman özel içinde tedavi PDMS negatif atıldı. Hücreleri nerede doku yüzük içine toplamak elde edilen özel kuyu içine numaralı seribaşı.
Bu prosedürün genel amacı, çeşitli boyutlarda kendi kendine monte edilmiş doku halkaları yapmak için kullanılan özel hücre tohumlama kalıpları oluşturmaktır. Bu yöntem, doku yapısını, gücünü ve işlevini değerlendirmek için kullanılabilecek insan hücrelerinden üç boyutlu doku halkaları oluşturmamızı sağlar. Bu tekniğin birincil avantajı, özel boyutlara sahip kendi kendine monte edilen dokular için kalıplar üretmek için basit bir yöntem olmasıdır.
Prosedüre başlamak için, istenen boyutlarda bir kalıp çizimi oluşturmak için bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanın. CAD dosyasını yüksek çözünürlüklü bir 3D yazıcıya gönderin. Kalıbı, 50 santigrat derecede stabil olan parlak bir yüzeye sahip bir plastiğe yazdırın.
Baskılı kalıbı bir fırça, deterjan ve su ile iyice yıkayın. Kalıbı damıtılmış suyla durulayın ve bir rafta kurumaya bırakın. PDMS kürleme sıcaklığında stabil olan 3D baskılı bir plastik seçmek önemlidir.
Isıtma sırasında PDMS'ye geçen kalıntılar halka oluşumunu etkileyebilir. Ardından, tek kullanımlık bir tartı teknesinde 25 gram PDMS tabanı ölçün. Sertleştirme maddesini ağırlıkça 1:10 oranında ekleyin ve baz ve sertleştirici iyice karışana kadar kuvvetlice karıştırın.
Ardından, basılı kuyucuklarla yüzün etrafında yaklaşık bir santimetre yüksekliğinde bir duvar oluşturmak için kalıbın kenarlarına laboratuvar bandı sabitleyin. Bant duvarında boşluk olmadığından emin olun. PDMS karışımını 3D baskılı kalıba dökün.
PDMS'yi bir vakum odasında 30 ila 60 dakika veya hiç kabarcık kalmayana kadar gazdan arındırın. PDMS'yi 50 santigrat derecede iki ila dört saat veya PDMS kalıptan çıkarılacak kadar katı olana kadar kürleyin. Ardından bandı çıkarın ve PDMS negatifini kalıptan dikkatlice ayırın.
Tamamen kürlendiğinden emin olmak için PDMS negatifi 60 santigrat derecede bir fırında bir saat inkübe edin. Ardından, negatifi deterjan ve suyla iyice yıkayın. Kalıbı damıtılmış suyla durulayın ve kurumaya bırakın.
Agaroz kalıbını imal etmeden önce, PDMS negatifini, bir çift künt forsepsleri ve istenen diğer aletleri otoklavlayın. İmalata başlamak için, DMEM'de en az 50 mililitre yüzde iki agaroz hazırlayın ve otoklavlayın. Halka tohumlamadan bir gün önce agaroz kuyuları hazırlayın.
Kalıbı aşırı doldurmamaya dikkat ederek dört mililitre erimiş agarozu otoklavlanmış PDMS negatifine pipetleyin. Ardından, erimiş agarozu agaroz kuyusu direkleri için boşluklara pipetleyin. Tüm hava kabarcıklarını gidermek için pipet ucunu kullanın.
Son agaroz yüzeyi düz olmalıdır. Agarozun yaklaşık 10 dakika soğumasına izin verin. Ardından, soğutulmuş agaroz kalıbını PDMS negatifinden dikkatlice ayırmak için künt forseps kullanın.
Kalıbı yüzü yukarı bakacak şekilde altı oyuklu bir plakanın bir kuyusuna yerleştirin. Agaroz kuyucuklarının tamamen suya batırılması için uygun tam kültür ortamını plakaya iyice ekleyin. Kullanmadan önce agaroz kuyularını gece boyunca 37 santigrat derecede dengeleyin.
İlk olarak, 15 santimetrelik bir kültür kabında, Sıçan Aort Düz Kas Hücrelerini yüzde 5'lik bir karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede yüzde 70 birleşme elde edilene kadar kültürleyin. İstenen agaroz kalıbı hazırlandıktan ve gece boyunca dengelendikten sonra, kültür kabını beş mililitre fosfat tamponlu tuzlu su ile iki kez durulayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, yemeğe üç mililitre yüzde 0.25 tripzin ekleyin.
37 santigrat derecede iki ila üç dakika veya hücreler tabaktan çıkana kadar inkübe edin. Tripzini üç mililitre tam kültür ortamı ile nötralize edin. Hücreleri konik bir tüpe aktarın ve iyice yeniden süspanse olana kadar hücreleri nazikçe pipetleyin.
Hücre süspansiyonunun bir aliquat'ını eşit hacimde tripan mavisi boya ile seyreltin ve hücreleri bir hemositometre ile sayın. Ardından, süspansiyonu beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve mililitre başına 10 milyon hücre konsantrasyonu elde etmek için hücreleri tam kültür ortamında yeniden süspanse edin.
Tutarlı halka oluşumunu sağlamak için en önemli adımlar, kullandığınız hücre hattı için hücre sayısını ve kültür ortamını optimize etmektir. Ardından, dengelenmiş agaroz kuyularını elde edin. Kuyucukların diplerini delmemeye dikkat ederek, tüm ortamı hem agarozun dışından hem de agaroz kuyularının içinden dikkatlice aspire edin.
Her bir oyuğa 50 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetleyin. Ortamın kuyucuklara dökülmesine izin vermeden, agaroz kuyularının dışına iki mililitre taze ortam ekleyin. Hücrelerin toplanmasına izin vermek için plakayı gece boyunca yüzde beş CO2 atmosferinde 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ardından, ortamı agarozun dışından aspire edin. Plakaya 4.5 mililitre taze ortam ekleyin, böylece agaroz kuyuları doldurulur ve tüm agaroz kalıbı tamamen suya batırılır. Doku halkaları yeterince gelişene kadar plakayı inkübe etmeye devam edin ve ortamı her gün değiştirin.
Ardından, her bir doku halkasını forseps kullanarak direğinden yavaşça kaydırın. Hemen, halkaları histoloji için sabitleyin veya halkaları fonksiyonel veya mekanik değerlendirmeler için kullanın. 3D baskı, daha esnek kalıp tasarımına izin verdi.
Direk çapları, iki, dört ve on iki milimetre çapındaki direklerin etrafında üretilen sıçan düz kas hücresi halkalarımda gösterildiği gibi kolayca değiştirildi. Doku halkaları ayrıca birincil insan SMC'lerinden insan mezenkimal kök hücrelerinden ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen SMC'lerden hazırlanmıştır. Halkalar, doku fonksiyonu ve mekanik mukavemetin değerlendirilmesi için in vitro doku modelleri olarak kullanıldı.
Bu yöntem başlangıçta vasküler dokuyu imal etmek ve modellemek için tasarlanmış olsa da, kıkırdak, iskelet kası ve kalp dokusu gibi diğer doku tiplerinin segmentlerini de imal etmek için kullanılabilir. Bu yöntem, araştırmacıların farklı boyutlarda 3D doku halkaları üretmek için özel kalıplar oluşturmaları için basit bir yol sağlar. Bu halkalar, farklı hücre tiplerinden yapılan mühendislik dokularının yapısını, mekanik özelliklerini ve işlevini değerlendirmek için kullanılabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, özel bir 3D baskılı kalıp kullanarak farklı boyutlarda kendi kendine organize olan doku halkaları oluşturmak için bir yöntem sunmaktadır. Süreç, hücre agregasyonu için kuyucuklar oluşturmak amacıyla PDMS negatiflerin üretilmesini ve agaroz dökümünü içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Doku Mühendisliği
- Hücre Kültürü
- 3B Yazdırma
Arka Plan
- Kendi kendine organize olan doku halkaları, doku yapısını ve işlevini incelemek için kullanılabilir.
- 3D baskı, özelleştirilebilir kalıp tasarımlarına olanak tanır.
- Bu teknik; vasküler ve kardiyak dokular dahil olmak üzere çeşitli doku türlerine uygulanabilir.
- Hücre sayısının ve kültür koşullarının optimize edilmesi, başarılı doku halkası oluşumu için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Belirli boyutlarda doku halkaları üretmek için basit bir yöntem geliştirmek.
- Mühendislik ürünü dokuların mekanik özelliklerini ve işlevselliğini değerlendirmek.
- Doku mühendisliğinde farklı hücre tiplerini incelemek için bir platform sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- CAD yazılımı kullanarak kalıpların tasarlanması ve stabil plastikten 3D baskılarının alınması.
- Hücre ekimi için PDMS negatiflerin ve agaroz kuyucukların oluşturulması.
- Hücrelerin agaroz kuyucuklara ekilmesi ve doku halkaları şeklinde kümelenmelerinin sağlanması.
- Oluşan doku halkalarının yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin değerlendirilmesi.
Temel Sonuçlar
- İnsan düz kas hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinden doku halkaları başarıyla oluşturulmuştur.
- Yöntem, kalıp tasarımı ve doku fabrikasyonunda esneklik göstermiştir.
- Halkalar, doku fonksiyonunun ve mekanik dayanıklılığın in vitro değerlendirmeleri için kullanılmıştır.
- Kalıplardaki post çaplarının değiştirilmesiyle farklı boyutlarda doku halkaları elde edilmiştir.
Sonuçlar
- Bu protokol, özel doku halkaları oluşturmak için basit ve etkili bir yöntem sunmaktadır.
- Doku mühendisliğindeki çeşitli uygulamalara uyarlanabilir.
- Bu teknik, mühendislik ürünü dokuların ve bunların özelliklerinin incelenmesini geliştirmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları ve Önem
Bu yöntem, biyofarma Ar-Ge ekiplerinin preklinik modelleme için özelleştirilebilir, iskeletsiz doku halkaları üretmesini sağlayarak terapötik adayların mekanistik risklerinin azaltılmasını destekler. Doku boyutları ve kompozisyonu üzerinde hassas kontrol sağlayarak, erken aşama hedef doğrulama ve analiz geliştirme iş akışlarındaki öngörü güvenilirliğini artırır. Bu yaklaşım, iskele tabanlı sistemlere olan bağımlılığı azaltarak ilaç tarama ve hastalık modelleme uygulamaları için translasyonel uygunluğu iyileştirir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Yolak işlevselliğini ve hedef etkileşimini açıklığa kavuşturan kendi kendine organize olmuş doku halkaları aracılığıyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: 3D doku bağlamlarında hedef modülasyonunu değerlendirmek için tekrarlanabilir bir sistem sağlayarak biyolojik risk azaltma sürecini destekler.
- Öngörücü Değer: Bileşiklerin doku düzeyindeki yanıtlarıyla korelasyon gösteren fonksiyonel okumalar oluşturarak portföy önceliklendirmesini geliştirir.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Bileşiklerin doku mekaniği ve fonksiyonu üzerindeki etkilerinin kantitatif değerlendirmesine uygun, standardize edilmiş, iskelesiz doku halkaları üretir.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir agaroz kuyu üretimi yoluyla analiz hazırlığına olanak tanıyarak, sonraki tarama kampanyalarındaki değişkenliği azaltır.
- Ölçeklenebilirlik: Çoklu hücre tipleri ve doku modelleri genelinde platformun yeniden kullanımını kolaylaştırarak, verimli bileşik değerlendirme kaskatlarını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Doğal doku yapısını ve mekanik özelliklerini taklit eden doku halkaları oluşturarak, keşif ve preklinik doğrulama arasındaki boşluğu doldurur.
- Hastalıkla İlgili Sistem: Primer veya kök hücre kaynaklı materyaller kullanarak vasküler, kardiyak, iskelet kası ve kıkırdak doku modellemesini destekler.
- Riskle Düzenlenmiş İlerleme: In vivo çalışmalar öncesinde go/no-go (devam/tamam) kararlarına temel oluşturacak fonksiyonel ve histolojik son noktalar sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, fonksiyonel ve mekanik fenotipleme yoluyla öncü bileşik belirlemesine bilgi sağlayan hipotez odaklı doku üretimini mümkün kılarak erken keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Ekiplerin, kontrollü bir 3D ortamda hedefe bağımlı doku oluşumunu, gücünü ve fonksiyonunu değerlendirmesine olanak tanıyarak mekanistik risklerin azaltılmasını destekler.
- Tarama: Tutarlı boyutlara sahip, analize hazır doku halkaları sağlayarak doku düzeyindeki fenotipler için güvenilir bileşik taraması yapılmasını mümkün kılar.
- Analizler: Karşılaştırmalı durum analizi için doku çapı, kasılma kuvveti ve histolojik belirteçler dahil olmak üzere nicel çıktılar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Mekanik, fonksiyonel ve histolojik değerlendirmeye uygun doku modelleri oluşturarak keşif aşamasından preklinik kullanıma kadar sürekliliği sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: 3D baskılı kalıp iş akışını, farklı projeler ve hücre tipleri genelinde çeşitli doku halkaları üretmek için yeniden kullanılabilir bir platform olarak konumlandırır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Doku-hedef etkileşimlerindeki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Özelleştirilebilir, düşük varyanslı kalıp üretimi yoluyla standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: İskele kaynaklı artefaktlar olmadan doku modellerinin hızlı iterasyonuna olanak tanıyarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Doku mühendisliği modelleri üzerinden erken fonksiyonel veriler sunarak risk ayarlı önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- CAD tasarımı, 3D baskı ve steril doku kültürü tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Parlak, ısıya dayanıklı plastik parçalar üretebilen bir 3D yazıcıya ve standart PDMS/agaroz hazırlama ekipmanlarına erişim gereklidir.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için kalıp tasarım parametrelerinin, hücre ekim yoğunluklarının ve kültür koşullarının ekipler arası standardizasyonu gereklidir.
- Yöntemin farklı hücre tiplerine veya doku hedeflerine uygulanmasında, özellikle agaroz konsantrasyonu ve post çapı ile ilgili adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Kuyu deformasyonunu önlemek için hassas agaroz kalıplamanın gerekliliği ve tutarlı halka oluşumu için kuyu başına hücre sayısının optimize edilmesinin önemi gibi pratik sınırlamaları içerir.
