Floresan, sindirim böceklerde sıvı alımını yeteneklerini belirlemek için manyetik nano tanecikleri

Bu prosedürün genel amacı, floresan manyetik nanopartiküller ile karıştırılmış bir sakaroz çözeltisi kullanarak sıvı ile beslenen böceklerde beslenmenin fizyolojik parametrelerini değerlendirmektir. Bu yöntem, böcek ağız parçalarının yapısı, işlevi, ilişkileri ve böcek besleme mekanizmaları gibi entomoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, böceklerin havuz veya sıvı film olarak bulunan sıvıları alıp alamayacaklarını belirlememize izin

Bu gösteride mavi şişe sinekleri kullanılmaktadır çünkü sıvı alım yetenekleri ve ağız kısmı morfolojisi iyi belgelenmiştir. Karasinekler, lahana kelebekleri ve diğer sıvı beslenen böcekler kullanılabilir. Sinek pupası elde edin ve bunları günde 18 saat ışık alan ve 23 santigrat derecede bir çevre odasına yerleştirin.

Yetişkinler pupalarından çıktıktan sonra, deneyden önce onları beslemeyin. Deneysel gıda için, mililitre başına 0.5 miligram nanopartikül ile yüzde 20 sükroz çözeltisi hazırlayın. Ardından, bir manipülatör, bir kelepçe ve bir besleme aşamasından oluşan bir besleme istasyonu hazırlayın.

Besleme aşamasında, yiyeceği içbükey bir slaytla tutun. Ayrıca, içbükey sürgünü kaplamak için çeşitli naylon ağ filtreleri ve farklı gözenek boyutlarında membran filtreleri hazırlayın. Böceğin vücutlarını, bacaklarını ve kanatlarını katlanmış bir kağıt mendile sararak başlayın.

Sadece baş ve ağız kısımlarını açıkta bırakın. Bunu yaparken, kanatlarını birbirine sıkıştırarak böceği güvende tutun. Şimdi, kağıt mendile sarılmış kanatları iki mikroskop lamı arasına sabitleyin.

Ardından iki sürgüyü kelepçeleyin ve kelepçeyi bir manipülatöre sabitleyin. Ardından, manipülatörü kullanarak böceği besleme aşamasının üzerine sabitleyin. Daha sonra, içbükey sürgünün ortasına 30 mikrolitre besleme çözeltisi bırakın ve çözeltiyi gözenekli bir filtre kağıdı parçasıyla örtün.

Damlacık, gözenekleri dolduran filtre kağıdı boyunca yayılacaktır. Daha sonra, böceği, ağız kısımlarının distal bölgeleri ıslanan filtre kağıdı ile temas edebilecek şekilde, slaydın sadece düz kısmına ulaşılabilecek ve böcek içbükey bölgeden beslenemeyecek şekilde konumlandırın. Şimdi, ağız kısımlarını filtre kağıdına uzatmak için bir böcek iğnesi kullanın ve böceğin 45 saniye boyunca beslenmesine izin verin.

Böceğin beslenmeye ilgi göstermesi durumunda, ağız parçalarını doldurmak için filtre kağıdına tutun, pimi kullanarak 45 saniye boyunca. Bu besleme protokolünü tamamlar. Diseksiyon için, böceğin vücudunu kaplayacak kadar PBS'ye sahip 50 mililitrelik bir saat camı yükleyin.

Bunu, mikroskoptaki tüm diseksiyon araçlarıyla birlikte ayarlayın. Şimdi, böceği kanatlarını kapalı tutarak kağıt mendilden çıkarın. Ardından, yaylı mikro diseksiyon makası kullanarak başı, bacakları ve kanatları çıkarın ve göğüs kafesi ve karnı PBS'ye yerleştirin.

Bağırsağı incelemek için önce distal karın kütikülünü tutun ve kütikülü arka uçtan toraksa kadar yan taraf boyunca ön yönde kesin. Sadece kütikülün kesilmesine ve sindirim kanalının zarar görmemesine özellikle dikkat edin. Ardından, karın kütikülünü, yağ gövdesini ve diğer yapıları, saat camında sadece göğüs kafesi ve sindirim kanalı kalana kadar böcek iğnelerinin yardımıyla çıkarın.

Şimdi, mahsulü tanımlayın. Göğüs kafesi ve karnın birleştiği yere yakın bir yerde bulunan çuval benzeri bir yapıdır. Gerekirse, mahsulü ortaya çıkarmak için göğüs kafesine ek kesiler yapın.

Ardından, kalan göğüs kafesini kesin ve sadece sindirim kanalını ve mahsulü bırakın. Yutulan nanopartiküllerin varlığını test etmek için, mahsulü görüntüleme için bir örtü fişine aktarmak için ince noktalı bir diseksiyon forseps kullanarak başlayın. Mahsulün yırtılmasını önlemek için dikkatli olun.

Kırpmayı, CY20 kanalını veya faz kontrastını kullanarak 3 kat büyütmede ters çevrilmiş bir konfokal mikroskopta hemen görüntüleyin. Yutulan nanopartikülleri tanımlamak için, mahsulden yaklaşık 10 milimetre uzakta bir manyetik karıştırma çubuğu sallayın. Her ileri geri hareketin yaklaşık bir saniye sürmesini sağlayın.

Mıknatısı sallarken, neredeyse şeffaf mahsulün içindeki nanopartikül hareketini taramak için çalışma aşamasını yavaşça hareket ettirin. Nanopartiküller mahsulde mevcutsa, manyetik karıştırma çubuğu ile birlikte dalgalanacaklardır. Gözenekli bir yüzeyden çözelti ile beslenen bir böcek, sıvıyı gözeneklerde tutan kılcal basıncın üstesinden gelmek için plato kararsızlığı yoluyla stabil bir sıvı köprüsü oluşturmalıdır.

Bir böceğin beslenme kanalının boyutunun, beslenebilecekleri en küçük gözenek boyutunu belirleyeceği tahmin edilmektedir. Böcekler, nanopartiküllerin yutulup yutulmadığını değerlendirmek için diseke edildikten sonra, gıda kanalı kanalının boyutunu ölçmek için ağız kısımları görüntülendi. Sinekler için psödotrakeanın çapı ve oral açıklık ölçüldü.

Yutulan nanopartiküllerin analizi, distal ağız kısmı kanal boyutu ile bir böceğin beslenebileceği en küçük gözenek boyutu arasında yakın bir ilişki olduğunu göstermektedir. Bu ilişki proksimal ağız kısımları ile görülmez. Sonuç olarak, dipteranlar için sıvı alımı ilk olarak oral açıklıktan ziyade psödotrakeada meydana gelir ve kılcal hareketin beslenmede önemli bir rolü olmalıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, böceklere bir nanopartikül çözeltisinin nasıl besleneceğini, mahsullerini izole etmek için onları nasıl inceleyeceğinizi ve ardından mahsulü nanopartiküller için nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamalısınız. Bu işlemi denerken diseksiyonlar sırasında dikkatli olmak önemlidir. Mahsul yırtılırsa, sıvı içeriğini ve nanopartikülleri dökerek numunenizi mahvedebilir.