Name: Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Öğrenin, ALLIGATOR sistemiyle biyolüminesans görüntüleme yöntemini kullanarak sirkadiyen ritim araştırmalarında gen ifadesini uzunlamasına izleme tekniğini. Bu yöntem, hücre davranışlarını invaziv olmayan şekilde gözlemlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cairn araştırma özellikle Mark Henson, Jeremy Graham ve Joao Correia bu sistemi geliştirmek için bizimle çalışmak için teşekkür etmek istiyorum. Biz de David Welsh ve bayram Reddy Peter Laskey (eski adı, Hamamatsu) yanı sıra tasarım aşaması sırasında değerli tartışma için kritik onun girişi el yazması için bir demo kamera ve David Wong kredi düzenlenmesi için teşekkür ederim.

<ol><li>Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+and+light-induced+expression+of+luciferase+in+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+and+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa.</a> Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).</li>
<li>Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Circadian+Phenotype+Based+on+Firefly+Luciferase+Expression+in+Transgenic+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants.</a> Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).</li>
<li>Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Firefly+Luciferase+Activity+Assays+to+Monitor+Circadian+Molecular+Rhythms+In+Vivo+and+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Circadian+Rhythms%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro.</a> Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).</li>
<li>Yoo, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li>
<li>Buhr, D. E., Yoo, S. -H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+as+a+universal+resetting+cue+for+mammalian+circadian+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators.</a> Science. 330 (6002), 379-385 (2010).</li>
<li>Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythms+of+mammalian+body+temperature+can+sustain+peripheral+circadian+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks.</a> Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).</li>
<li>Balsalobre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+of+circadian+time+in+peripheral+tissues+by+glucocorticoid+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling.</a> Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).</li>
<li>Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+elicit+circadian+gene+expression+in+cultured+Rat-1+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol.+CB%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts.</a> Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).</li>
<li>Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circadian+mechanisms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+by+transgenesis+and+biolistic+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection.</a> Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres,, Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NS21%3A+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li>
<li>Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+Characterization+of+Firefly+Luciferase+as+a+Reporter+of+Circadian+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Rhythms%22%5BJournal%5D)">In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells.</a> J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).</li>
<li>Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+disrupted+circadian+behavior+through+inhibition+of+casein+kinase+1+%28+CK1+%29+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes.</a> Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).</li>
<li>Khabirova, E., Chen, K. -F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flyglow%3A+Single-fly+observations+of+simultaneous+molecular+and+behavioural+circadian+oscillations+in+controls+and+an+Alzheimer%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model.</a> Sci. Rep. 6, 33759(2016).</li>
</ol>

Hiçbir çıkar çatışması adlı biri yok.

Burada açıklanan memeli hücre kültürü, derin ve statik koşullarda her ikisi de iletişim kuralıdır. Ancak, timsah kolayca diğer sistemleri modellemek için adapte edilebilir. Gerçekten, o zaten aynı anda hareket, uyku ve sürekli karanlık15altında. tutulan Drosophila melanogaster periferik gen ifade ritimler izlemek için mükemmel bir platform sağlamaktadır gösterilmiştir Ayrıca uygulamaya bağlı olarak, burada açıklanan dışındaki kamera türleri uygun olabileceğini kaydetti. Biz uygun filtreleriyle, geçerli ayarı değiştirilmiş bir sürümü prensipte Floresans miktar için kullanılan olabileceğini öngörmektedir.
Özellikle yüksek Uzaysal çözünürlük görüntüleme memeli dilim organotypic PER2::LUC ifadede kronolojik zamanmekansal organizasyon gibi gerekli olduğu için timsah uygun olmayabilir uygulamalar yalnızca bunlar suprachiasmatic çekirdeği, ya da diğer küçük dokusu dilimlerin.
Timsah şimdiye kadar geleneksel kayıt teknikleri tarafından kolayca ulaşılabilir olmamıştır gerçekleştirilecek birçok deney sağlar. Bioluminescence ölçümü için geçerli yöntemleri ile karşılaştırıldığında, timsah her iki tip hücre kültür çanak veya kullanılabilir slayt, dış ortam koşulları, duyarlılık ve processivity düzeyde esneklik sağlar.
Bu özellikle ilgili bir anda ne zaman standart 2D hücre kültür modelleri 3D organoid ve akış kültür sistemleri doğru uzak dur. Bu nedenle, timsah bioluminescence hangi birçok gün ve hafta çok çeşitli koşullar altında üzerinde ölçülebilir uyarlanabilir bir yöntem sağlayacaktır tahmin edilmektedir.

Luciferases gazetecilere gen ekspresyonu ve protein etkinliği olarak kullanımı moleküler ve hücre biyolojisi araştırmalarında popüler bir teknik haline gelmiştir. Bu ateş böceği luciferase sentezi ve katalitik inactivation Kinetik nerede üzerinden yaklaşık 24 s sirkadiyen döngüsü meydana gen ekspresyonu boyuna değişimler raporlama için özellikle uygundur sirkadiyen alanında geçerlidir. Bu nedenle, luciferase Mantarlar, bitkiler, sinekler ve memeliler1,2,3,4da dahil geniş bir aralığında sirkadiyen muhabir olarak istihdam edilmektedir.
Sirkadiyen gen ifade vitromiktarının, bir photomultiplier tüp (PMT) yaygın olarak kollarındaki sinyal kaydetmek için kullanılır. Devresel_ödeme tabanlı ölçümleri esneklik ancak, genellikle önceden belirlenmiş bir tabak ya da çanak boyutu sınırlı sınırlı olabilir. Ayrıca luciferase ifadede mekansal varyasyon gösteren örnekleri Imaging bilgi kaybına yol açabilir bir Devresel ödeme kullanarak izlenen örnekleri kayma herhangi bir bilgi toplamak mümkün değildir. Ayrıca, devresel_ödeme ve ilişkili elektronik oksijen Standart hücre kültür kuluçka ortamına maruz kaldığında arıza eğilimli olduğundan, boyuna luciferase kayıt PMTs kullanarak her zaman sigara nemlendirilmelidir İnkübatörler içinde gerçekleştirilir. Sonuç olarak, hücre kültürü yemekleri gerekir kapalı hava-buharlaşma yoluyla nem kaybını önlemek için sıkı ve kültür medya bu nedenle 3 - ile tamponlanmış olmalıdır (N- morpholino) propanesulfonic asit (paspas) veya 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic asit (HEPES), in vivo fonksiyonları ve memeli doku kültüründe rutin olarak kullanılan sistem tampon CO2/bicarbonate yerine.
Bu sınırlamalar bir sonucu olarak PMTs tarafından bioluminescence ölçümü genellikle sıkı kısıtlamalar altında hücreler deneyler sırasında korunur koşulları üzerine yerleştirir. Bu sorunların üstesinden gelmek için ve aynı zamanda olası deneysel koşullar aralığı artırmak için biz bir su soğutulmuş elektron-çarparak eklenmesi tarafından uyarlanmış bir standart CO2/n2 170 L doku kültürü kuluçka makinesi kullanın Anti-sis optik ve dijital kontrol sıcaklık ve gaz düzeyleri ile şarj kuplajlı cihaz (EMCCD) kamera. Bu bir otomatik boyuna Luciferase gaz görüntüleme ve Temperature-Optimized kaydedici ya da timsah dönüşmüş bulunuyor. Kollarındaki görüntüleme, standart doku kültürü plakaların yüksek üretilen iş görüntüleme için her ikisi de önemli ölçüde artan esneklik için timsah sağlar (6 x 96 - veya 384-da kadar tabaklar aynı anda) ve standart dışı doku kültürü sistemleri, için de böyle derin hücreler olarak mikrosıvısal aygıt içinde büyüdü. Bu araç aynı zamanda oksijen koşullar altında ve değişken kontrolünü hem CO2 O2 kısmi basınç ve sıcaklık ile gerçekleşmesi için görüntüleme için sağlar.
İletişim kuralı aşağıdaki memeli hücre ve doku kültürü sistemleri (bundan böyle 'bioluminescence kuluçka' adlandırılır) bir timsah kullanarak kollarındaki kayıt için bir yöntemi açıklar. Bu, ancak, sistem kollarındaki görüntüleme ve aynı zamanda, bazı değişiklik, Floresan, diğer biyolojik sistemleri ve bağlamlarda bir dizi Imaging ile uygun olması gerekmektedir.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FetalClone III Serum</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30109.03</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Thermofisher</td><td>21103049</td><td>bazal</td></tr><tr><td>ortam Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Glutatyon</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td></td><td>Sigma I1882</td><td></td></tr><tr><td>Süperoksit Dismutaz</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>Holo-transferrin</td><td>Calbiochem</td><td>616424</td><td></td></tr><tr><td>T3 (triiyodo-L-tironin</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>L-Karnitin</td><td>Sigma</td><td>C7518</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamin</td><td>Sigma</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>D (+) - Galaktoz</td><td>Sigma</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Putresin</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Selenit</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Kortikosteron</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>Linoleik Asit</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Linolenik Asit</td><td>Sigma</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>Lipoik Asit</td><td>Sigma</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Retinol Asetat</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>Retinol, tüm trans</td><td>Sigma</td><td>95144</td><td></td></tr><tr><td>D, L-alfa-Tokoferol</td><td>Sigma</td><td>95240</td><td></td></tr><tr><td>D, L-alfa-Tokoferol asetat</td><td>Sigma</td><td>T3001</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Çözeltisi Sigma</td><td>S8761-100ML</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy 170R inkübatör&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>CO17301001</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Biosynth</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>D -(+)-Glikoz çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM tozu</td><td>Sigma</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>PHG0007</td><td></td></tr><tr><td>1 mm ID silikon boru ve nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>19-4692-01</td><td></td></tr><tr><td>Dirsek luer konektörü</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Erkek luer bağlantı parçaları</td><td>Ibidi</td><td>10826</td><td></td></tr><tr><td>Dişi luer bağlantı parçaları</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-slide luer I 0.6</td><td>Ibidi</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>BD plastipak 20ml şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1mm ID ETFE boru GE</td><td>Healthcare</td><td>18-1142-38</td><td></td></tr><tr><td>PF670462</td><td>Sigma</td><td>SML0795</td><td></td></tr><tr><td>B27 Takviyesi (50x)</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra EMCCD kamera</td><td>Andor</td><td>iXon 888</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7.0</td><td>Graphpad Yazılımı</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Deltafaz İzotermal Ped</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Isıtmalı nötr yoğunluk filtresi&nbsp;</td><td>Cairn Research</td><td>Özel ürün</td><td></td></tr><tr><td>Osmomat 030</td><td>Gonotech</td><td>Durdurulan</td><td></td></tr><tr><td>300 mOsmol/kg kalibrasyon standardı</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0020</td><td></td></tr><tr><td>Ölçüm kabı</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0010</td><td></td></tr><tr><td>Odaklama silindiri</td><td>Cairn Research</td><td>Özel ürün</td><td></td></tr><tr><td>NE-1600 programlanabilir şırınga pompası</td><td>Pompa Sistemleri inc. </td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis Yazılımı</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna luciferase gaz ve sıcaklık optimize kaydedici (timsah) imaging kullanarak esnek ölçüm

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase tabanlı gazetecilere hücresel gen ifadesinin boyuna her ikisi için yaygın kullanılmayan ve biyolojik aktivitesini son nokta deneyleri. Sirkadiyen ritim araştırmada, örneğin, saat gen füzyon ile ateş böceği luciferase neden için sağlam ritimler birçok gün içinde kalıcı hücresel bioluminescence içinde olmaktadır. Teknik sınırlamalar photomultiplier tüp (PMT) ile ilişkili veya geleneksel mikroskobu tabanlı yöntemler bioluminescence miktar için genellikle hücre ve dokuların sırasında oldukça fizyolojik koşullarda muhafaza edilmesi talep var. kayıt, duyarlılık ve işlem hacmi arasında bir denge ile. Burada, uzun vadeli bioluminescence görüntüleme yüksek hassasiyet ve hangi kültür koşullar, değişken gaz ve nem kontrolü de dahil olmak üzere geniş bir dizi çekmek ve bu birçok kabul eden işlem hacmi ile farklı sağlar bir arıtma önceki yöntemlerden raporu doku kültürü tabak ve yemekler. Bu otomatik boyuna luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) ayrıca Imaging mekansal varyasyon gözlem luciferase ifadede hücre monolayer veya kolayca geleneksel tarafından gözlenen cant doku üzerinden sağlar yöntemleri. Biz nasıl timsah varolan yöntemleri ile karşılaştırıldığında luciferase aktivite tespiti için büyük ölçüde artan esneklik sağlar vurgulayın.

Bu makalede bir timsah (bioluminescence kuluçka) kullanarak memeli hücrelerinin kollarındaki görüntüleme için bir protokol özetlenmektedir. Bu teknik görüntüleme kollarındaki sistemleri zaman için fiziksel kurulum ve ekstraselüler koşullara esneklik sağlar. Basit statik doku kültürü (şekil 1, ek Video 1) ve derin hücre kültürü (Şekil 2, ek Video 2) yöntemleri açıklanan, ama birçok diğer kurulumları bu sistemi kullanarak yansıma. Tüm veri Bölüm 7'de açıklanan yöntemleri kullanarak sayısal.
Şekil 1A PER2::LUC fibroblastlar4içeren 6 x 96-şey plakalar kayıt bioluminescence video gösterilmektedir. Bunlar bu deneme için gerekli değildi olarak en dıştaki wells hücreleri içermez. Hücreleri farklı sıcaklık sürüklenme, mademki 12 h 37 ° C 72 h veya converse (37 ° c 32 ° c 72 h 12 h ardından 12 h), ardından 32 ° C'de 12 h her iki sıcaklık döngüsünü geçmesi kayıt için sürekli 37 ° C'de tutulan önce geçmiştir. 60 dk Etkilenmeler her saat çekildi. Bu koşullar iki şekil 1Badımında sayısal.
Şekil 2A derin doku kültürü için bir sistemi kurulumunun şematik gösterir. Bu boru ile bağlı iki kanal slayt oluşur. Medya hücreler arasında bir enjektör pompası tarafından tahrik edilmektedir. Bu slaytları ilk gaz geçirgen kabarcık tuzak (arabellek slayt) olarak işlem görür ve ikinci ile hiçbir hücre içerir bioluminescence kaydedilir hücreleri içeren. Bu sistem video kaydı bir temsilcisi şekil 2Biçinde gösterilir. 15 dk Etkilenmeler her 15 dakikada çekildi. Burada, hücreleri standart perfüzyon koşullar altında veya kazein kinaz inhibitörü daha önce sirkadiyen süresini uzatmak ve kültürlü saat gen ifade ritimler genliğini azaltmak için gösterilmiştir PF670462 huzurunda korunur memeli hücre14. PER2::LUC ifade etkisi şekil 2C içinde (üst panel) uyuşturucu şekil 2C içinde (alt paneli), gösterilen standart statik hücre kültür koşullar altında aynı konsantrasyonu ile dönemin miktar ile tedavi hücrelere karşı gösterilen şekil 2Bolarak gösterilir. Bu net PF670462 ile tedavi PER2::LUC ifadesi altında her iki koşul kümesinden birini etkiler bu. Hücreleri periosteum koşulları Haritayı dönem yaklaşık 3 h (3 ±0.9 h) uzatma altında PF670462 ile tedavi ederken, ancak, hücreleri statik koşullarda ilaç ile tedavi daha fazla dönem için bir süre uzatma gösterir &gt; 48 saat. Bu damped kosinüs tarafından Bölüm 7'de açıklandığı gibi uygun olabilir (ekstra toplamı, kareler F test karşı düz bir çizgi, p &lt; 0.0001). İlginçtir, dönem perfüzyon altında uzatma büyüklüğü Bu vivo içinde14gözlenen çok daha yakın.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg"> 
Şekil 1: veri örneği. (A)örnek bioluminescence ölümsüzleştirdi PER2::LUC 6 x 96 dan video görüntüsünü de bioluminescence kuluçka makinesine tabaklar. Kuyu sayısal için tamamlayıcı Video 1sarı vurgulu olarak gösterilmiştir. (B) miktar bioluminescence A. üzerinden İki setleri 3 hücre entrained Anti-PER2 protein ifade aşamalarını üretmek için birbirleriyle phasic sıcaklık döngüsü (12 saat 32 ° C'de; 12 saat 37 ° C'de) kullanarak (n = 6 ± SEM demek). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg"> 
Resim 2: CK1δ inhibitörleri ile perfüzyon. (A)şeması perfüzyon sistemi. (B) örnek PER2::LUC kayıt bioluminescence anlık görüntü altında perfüzyon hücreleri. Miktar bir örnek alan Sarı renkle vurgulanır. PER2::LUC perfüzyon altında ve statik koşullarda ve 3 µM CK1 inhibitörü PF670462 olmadan fibroblast biyolüminesans (C) miktar (n = 3, ± SEM demek). Bioluminescence için minimum ve maksimum değerleri normalleştirilmiş. (D) analiz dönemi (Two-way ANOVA, Holm-Sidak'ın birden fazla karşılaştırma testi).<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bileşen</td>
			<td>Son orta konsantrasyonu (mikron)</td>
			<td>Hisse senedi (mg/mL)</td>
			<td>400 mL NS21 için</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sığır albümin</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katalaz</td>
			<td>0,01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutatyon</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>İnsülin</td>
			<td>0,6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Süperoksit Dismutaz</td>
			<td>0.077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrin</td>
			<td>0.062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (triiodo-L-thyronine)</td>
			<td>0.0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-karnitin</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etanolamin</td>
			<td>16</td>
			<td>Sıvı (1 g/ml)</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+)-galaktoz</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodyum selenit</td>
			<td>0.083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>0.058</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleik asit</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolenik asit</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipoik asit</td>
			<td>0,2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>0,02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0,04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol asetat</td>
			<td>0,2</td>
			<td>20</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol, tüm trans</td>
			<td>0,3</td>
			<td>10</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alfa-tokoferol</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0. 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alfa-tokoferol asetat</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: NS21 hazırlık.
Ek Video 1: örnek video bioluminescence iyi plakalar üzerinden. Örnek video anlık görüntüsünü bioluminescence 6 x 96 iyi plakaları bioluminescence kuluçka ölümsüzleştirdi PER2::LUC üzerinden. Sayısal için kuyu Sarı renkle vurgulanır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek Video 2: PER2::LUC kayıt bioluminescence örnek video görüntüsünü hücreleri perfüzyon altında. Miktar bir örnek alan Sarı renkle vurgulanır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Genetik olarak kodlanmış luciferase gen ekspresyonu popüler bir non-invaziv muhabir var. Gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging otomatik bir boyuna luciferase çok çeşitli koşullar altında kollarındaki hücrelerden Boylamsal kayıt sağlar. İşte nasıl timsah sirkadiyen ritim araştırma bağlamında kullanılabilir göstermektedir.

Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Bu sistemin genel amacı, sürekli ortam perfüzyonu da dahil olmak üzere çok çeşitli hücre dışı koşullar altında biyolüminesan raportörlerin kolay gözlemine izin vermektir. Bu yöntem, kültürlenmiş hücrelerden ve dokulardan uzunlamasına biyolüminesansı gözlemlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mevcut sistemlerin çoğunda mümkün olmayan değişen hücre dışı ortam ve gaz koşulları altında hücrelerden kayıt yapılmasına izin vermesidir.Burada bu tekniği sirkadiyen ritim deneyleri bağlamında göstersek de, günlerden haftalara kadar zaman ölçeklerinde biyolüminesans veya floresan kaydı gerektiren diğer sistemlere kolayca uygulanabilir. Prosedüre başlamak için, doku kültürü kapları veya plakaları üzerinde kültürlenmiş hücreleri tohumlayın. Tek tabakalar %100 birleşmeye ulaşana kadar hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin.Deneyden hemen önce, hücresel ritimleri senkronize etmek için en az 72 saat boyunca her 12 saatte bir 32 ila 37 santigrat derece arasında geçiş yapmak için bilgisayar kontrollü bir döngü inkübatörü kullanın. Hücresel sirkadiyen salınımların hem kültürler içinde hem de kültürler arasında sağlam senkronizasyonu, deneysel tekrarlanabilirlik için çok önemlidir. Bunu, her kayıttan önce vücut ısısı ritimlerini taklit ederek hücreleri senkronize eden günlük sıcaklık döngüleri uygulayarak başarıyoruz.Alternatif olarak, farmakolojik senkronizasyon da oldukça etkili olabilir. Daha sonra, 8.3 gram yüksek glikozlu DMEM tozunu 900 mililitre ultra saf su ile birleştirin. Tozu tamamen çözmek için çözeltiyi 30 dakika karıştırın.Daha sonra, çözeltiye litre başına 50 mililitre 100 gram glikoz çözeltisi, 20 mililitre pH 7.6, bir molar MOPS çözeltisi ve 10 mililitre 100 kez penisilin streptomisin çözeltisi ekleyin. Karışımı 10 dakika karıştırın. Daha sonra 4,7 mililitre% 7,5 sodyum bikarbonat çözeltisi ekleyin ve karışımı beş dakika daha karıştırın.Oda sıcaklığında pH'ı 7.6'ya ayarlamak için hidroklorik asit veya sodyum hidroksit kullanın. Bir litrelik son hacim elde etmek için çözeltiye ultra saf su ekleyin. Çözeltiyi 0.22 mikrometre steril bir filtreden steril bir şişeye süzün.Filtrelenmiş stok ortamını dört santigrat derecede saklayın. Deneyi gerçekleştirmeden hemen önce, istenen miktarda stok ortamını% 10 serum,% iki milimolar GlutaMAX,% 2 NS21 ve bir milimolar lusiferin ile destekleyin. Elde edilen çalışma ortamını 0.22 mikrometre steril bir filtreden geçirin.Çalışma ortamı ozmolalitesini 350 miliozole ayarlamak için beş molar bir sodyum klorür çözeltisi kullanın. Ardından, ortamı bir su banyosunda 37 santigrat dereceye ısıtın. Ardından, biyolüminesans inkübatör kamerasına odaklanmaya başlamak için su geçirimsiz ısıtmalı nötr yoğunluk filtresini sökün.Cihaz yazılımında pozlama süresini 0,2 saniyeye ve kinetik döngü süresini 0,3 saniyeye ayarlayın. Elektron çarpma kazancının kapalı olduğunu doğrulayın, ardından kurulum penceresini kapatın ve video kaydına başlayın. Uygun numune rafındaki test öğeleri net bir şekilde odakta olana kadar kamera merceğini döndürmek için odaklama silindirini kullanın.Ardından video kaydını durdurun. Nötr yoğunluk filtresini değiştirin ve test öğelerini çıkarın. Ardından, deney için istenen oksijen, karbondioksit ve sıcaklık seviyelerini ayarlamak için biyolüminesans inkübatörünün önündeki kontrol panelini kullanın.Nemlendirilmiş bir deney için, inkübatörün tabanındaki su tepsisini doldurun. Hücreleri doku kültürü inkübatöründen çıkarın ve kültür ortamını önceden ısıtılmış çalışma ortamıyla değiştirin. Küçük hacimler kullanan nemlendirilmiş deneyler için, plakaları gaz geçirgen film veya bantla kapatın.Plakaları biyolüminesan inkübatöre yerleştirin. Kuluçka makinesini kapatın ve ışığı sistemden çıkarmak için kapı kapağını sabitleyin. Ardından, cihaz yazılımında alım modunu kinetik olarak ayarlayın.İstenen pozlama süresini ayarlayın. Birikimleri bire, kinetik seri uzunluğunu istenen alım döngüsü sayısına ve kinetik döngü süresini istenen görüntüleme aralığına ayarlayın. İstenilen seviyede 4,33 mikrosaniyelik bir vites değiştirme hızı, bir kazanç ve istenen seviyede bir EM kazancı ayarlayın.Ardından, otomatik kaydetme dosya türünü sif veya tiff olarak ayarlayın. Otomatik kaydetme dosyasına bir ad verin ve dosya yolunu ayarlayın. Biriktirme dosya türünü sif veya tiff olarak ayarlayın.Dosya yığınını adlandırın ve dosya yolunu ayarlayın. Kurulum penceresini kapatın ve verileri kaydetmeye başlayın. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, alınan görüntü yığınını görüntü işleme yazılımına aktarın.Biyolüminesansın en iyi şekilde görüntülenmesi için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Ardından, ilgilenilen bölgeleri seçin ve seçilen alanlar için ortalama sinyali dışa aktarın. Daha fazla işlem için verileri analiz yazılımına kopyalayın.Deneye başlamak için, Luer konektörleri ve 0,6 veya 0,8 milimetre kanal derinliği ile tek kanallı slaytlar üzerindeki tohum hücreleri. Hücreleri kültürleyin ve sürükleyin. Hidrojen karbonat tamponlu düşük glikozlu DMEM perfüzyon ortamını hazırlayın ve ısıtın.Daha sonra, iç çapı bir milimetre olan beş adet iki santimetrelik silikon boru bölümünü kesin. 1,2 metre, 10 santimetre ve 30 santimetre bir milimetre iç çaplı etilen tetrafloroetilen boruyu kesin. Tüpü %70 etanol ile sterilize edin ve tüpü steril PBS ile yıkayın.1.2 metrelik ETFE borusunu steril bir dişi Luer konektörüne ve steril bir dirsek Luer konektörüne bağlamak için sterilize edilmiş silikon boruyu kullanın. Perfüzyon ortamı şırıngasını boş bir Luer kanalı slaytına bağlamak için bu düzeneği kullanın. Ardından, hücre kültürü ortamını önceden ısıtılmış perfüzyon ortamı ile değiştirin.20 mililitrelik steril bir şırıngayı önceden ısıtılmış perfüzyon ortamı ile doldurun. Silikon boruyu kullanarak 10 santimetrelik ETFE borusunu Luer konektörleriyle takın ve boruyu kızağa bağlayın. Üç ila beş mililitre perfüzyon ortamını borudan ve kanal kızağından yıkayın.Ardından, 30 santimetrelik ETFE borusunu hücre içeren kanal kızağına takın. Tam perfüzyon sistemini oluşturmak için 10 santimetrelik ETFE borusunun serbest ucunu hücre kanalı sürgüsünün diğer ucuna bağlayın. Hava kabarcıklarını dışlamak için bir mililitre perfüzyon ortamını borudan ve slaytlardan yıkayın.Perfüzyon sistemini biyolüminesans inkübatörüne taşıyın. Perfüzyon ortamıyla doldurulmuş şırıngayı, hortumun bağlantısını kesmemeye dikkat ederek bir şırınga pompasına sabitleyin. Bir mililitre perfüzyon ortamını perfüzyon sisteminden geçirmek için şırınga pompasını kullanın.Pompadaki şırınga çapını girin ve akış hızını saatte 50 mikrolitreye ayarlayın. Deneyin başlangıcında perfüzyon sisteminde kabarcık olmaması çok önemlidir, çünkü bunlar biyolüminesans sinyalini bozabilir. Pompayı çalıştırın ve biyolüminesans inkübatör kapağını hemen kapatın.Işığı sistemden çıkarmak için kapı kapağını sabitleyin. Statik doku kültürleri için açıklandığı gibi verileri alın ve analiz edin. Altı PER2 LUC fibroblast plakası, günlük sıcaklık döngüleri kullanılarak sürüklendi ve bir biyolüminesans inkübatörü kullanılarak görüntülendi.Seçilen kuyulardan alınan görüntüler analiz edildi ve biyolüminesans çıktısı ölçüldü. PER2 LUC hücreleri, bir Kazein kinaz inhibitörünün PER2 LUC ekspresyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için perfüzyon koşulları altında da görüntülendi. Sonuçlar, statik koşullar altında aynı inhibitör konsantrasyonu ile muamele edilen hücrelerle karşılaştırıldı ve bu da statik koşullar altında önemli ölçüde daha fazla periyot uzaması ortaya çıkardı.Perfüzyon koşulları altında süre uzamasının büyüklüğü in vivo olarak gözlenene yakın bulundu. Bu videoyu izledikten sonra, bir TİHGAH kullanarak hem statik hem de perfüze biyolüminesans deneylerinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

flexible-measurement-bioluminescent-reporters-using-an-automated

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, Promega Çift GloTM Lusiferaz Testi Sistemi kullanılarak bir lusiferaz tabanlı muhabiri gen yaklaşımı ile fagositoz indüklenen gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.

Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

Yaşayan hayvanların bakteriyel enfeksiyonlar biyoparlaklık görüntüleme yöntemleri açıklanmıştır. Patojenler, canlı hayvanlarda enfeksiyon optik tüm vücut görüntüleme sağlayan lusiferaz ifade etmek için modifiye edilmiştir. Hayvan modelleri lusiferaz ifade patojenler ile enfekte olan ve hastalık ortaya çıkan ders biyoparlaklık görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak görüntülenebilmekte.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Bu yazıda onların büyüme ve metastaz sırasında metastatik meme kanseri hücrelerinde ifade böceği ve Renilla lusiferaz enzimler hem bioluminescent reaksiyonları, inşa görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler...

Vivo Çift Yüzey Bioluminescent Imaging&#39;de

Sirkadiyen saatler tek tek hücrelerin içinde fonksiyon, yani, bu hücre-özerktir. Burada, non-invaziv, lusiferaz tabanlı gerçek zamanlı biyolüminesans teknolojisini kullanarak cep özerk saat modelleri üretme yöntemleri açıklanmaktadır. Muhabir hücreleri sirkadiyen biyoloji eğitimi için uysal, fonksiyonel model sistemleri sağlıyoruz.

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Video, lusiferaz etiketli proteinleri ölçmek için kullanılan lusiferaz testini göstermektedir. Tahlil, ilgilenilen bir protein ile konjuge edilen küçük parçaya bağlanan büyük bir parçadan oluşan tasarlanmış bir lusiferaz enzimi kullanır. Bağlı alt birimler, substratın varlığında ışıldayan bir sinyal yayan aktif bir enzim oluşturur. Bu sinyal daha sonra bir luminometre kullanılarak ölçülür.

Lusiferaz Testi: Tasarlanmış Nanolusiferaz Sistem Tabanlı Biyomuhabirler Kullanarak Lüminesan Sinyalleri Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Test

Bakteriyel biyolüminesans gen kasetinin ifade eden memeli hücreleri...

Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre

Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Kollarındaki bakteri gibi çekirdek algılama mekanizmaları, çeşitli aracılığıyla ışık üretim düzenler. Bu roman yöntemi bioluminescence in situ incelenmesi ve hücre yoğunluğu için ışık emisyon korelasyon sağlar. Bir yapay kollarındaki Escherichia coli sistemi sağlar lux operons, Lux proteinler ve onların Interplay karakterizasyonu.

Situ Ölçüm ve korelasyon hücre yoğunluğu ve kollarındaki bakterilerin ışık emisyon

Nöral kök/progenitor hücreleri, hücresel olayların farklı sonuçlarına yol açan Çentik sinyal bileşenlerinin çeşitli ifade dinamiklerini sergilerler. Bu tür dinamik ifade, gen ekspresyonlarında hızlı değişimlerin görselleştirilmesini sağlayan son derece hassas biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak statik analizle değil, gerçek zamanlı izleme ile ortaya çıkabilir.

Murin Nörogenezi Sırasında Çentik Sinyal Dinamiğinin Gerçek Zamanlı Biyolüminesans Görüntülemesi

Çoğu organizmada bulunan sirkadiyen ritimler, biyolojik süreçlerin zamansal organizasyonunu düzenler. 3D organoidler son zamanlarda fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, organoidlerde sirkadiyen ritimleri gözlemlemek için biyolüminesan raportörlerin kullanımını açıklar ve çok hücreli sistemlerde sirkadiyen ritimlerin in vitro olarak araştırılmasını sağlar.

Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi

Öğrenin, ALLIGATOR sistemiyle biyolüminesans görüntüleme yöntemini kullanarak sirkadiyen ritim araştırmalarında gen ifadesini uzunlamasına izleme tekniğini. Bu yöntem, hücre davranışlarını invaziv olmayan şekilde gözlemlemeyi sağlar.

Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm (Video) | JoVE Journal

Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm

Daha fazla video keşfet