Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm
13 Aralık 2017
Genetik olarak kodlanmış luciferase gen ekspresyonu popüler bir non-invaziv muhabir var. Gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging otomatik bir boyuna luciferase çok çeşitli koşullar altında kollarındaki hücrelerden Boylamsal kayıt sağlar. İşte nasıl timsah sirkadiyen ritim araştırma bağlamında kullanılabilir göstermektedir.
Bu sistemin genel amacı, sürekli ortam perfüzyonu da dahil olmak üzere çok çeşitli hücre dışı koşullar altında biyolüminesan raportörlerin kolay gözlemine izin vermektir. Bu yöntem, kültürlenmiş hücrelerden ve dokulardan uzunlamasına biyolüminesansı gözlemlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mevcut sistemlerin çoğunda mümkün olmayan değişen hücre dışı ortam ve gaz koşulları altında hücrelerden kayıt yapılmasına izin vermesidir.
Burada bu tekniği sirkadiyen ritim deneyleri bağlamında göstersek de, günlerden haftalara kadar zaman ölçeklerinde biyolüminesans veya floresan kaydı gerektiren diğer sistemlere kolayca uygulanabilir. Prosedüre başlamak için, doku kültürü kapları veya plakaları üzerinde kültürlenmiş hücreleri tohumlayın. Tek tabakalar %100 birleşmeye ulaşana kadar hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin.
Deneyden hemen önce, hücresel ritimleri senkronize etmek için en az 72 saat boyunca her 12 saatte bir 32 ila 37 santigrat derece arasında geçiş yapmak için bilgisayar kontrollü bir döngü inkübatörü kullanın. Hücresel sirkadiyen salınımların hem kültürler içinde hem de kültürler arasında sağlam senkronizasyonu, deneysel tekrarlanabilirlik için çok önemlidir. Bunu, her kayıttan önce vücut ısısı ritimlerini taklit ederek hücreleri senkronize eden günlük sıcaklık döngüleri uygulayarak başarıyoruz.
Alternatif olarak, farmakolojik senkronizasyon da oldukça etkili olabilir. Daha sonra, 8.3 gram yüksek glikozlu DMEM tozunu 900 mililitre ultra saf su ile birleştirin. Tozu tamamen çözmek için çözeltiyi 30 dakika karıştırın.
Daha sonra, çözeltiye litre başına 50 mililitre 100 gram glikoz çözeltisi, 20 mililitre pH 7.6, bir molar MOPS çözeltisi ve 10 mililitre 100 kez penisilin streptomisin çözeltisi ekleyin. Karışımı 10 dakika karıştırın. Daha sonra 4,7 mililitre% 7,5 sodyum bikarbonat çözeltisi ekleyin ve karışımı beş dakika daha karıştırın.
Oda sıcaklığında pH'ı 7.6'ya ayarlamak için hidroklorik asit veya sodyum hidroksit kullanın. Bir litrelik son hacim elde etmek için çözeltiye ultra saf su ekleyin. Çözeltiyi 0.22 mikrometre steril bir filtreden steril bir şişeye süzün.
Filtrelenmiş stok ortamını dört santigrat derecede saklayın. Deneyi gerçekleştirmeden hemen önce, istenen miktarda stok ortamını% 10 serum,% iki milimolar GlutaMAX,% 2 NS21 ve bir milimolar lusiferin ile destekleyin. Elde edilen çalışma ortamını 0.22 mikrometre steril bir filtreden geçirin.
Çalışma ortamı ozmolalitesini 350 miliozole ayarlamak için beş molar bir sodyum klorür çözeltisi kullanın. Ardından, ortamı bir su banyosunda 37 santigrat dereceye ısıtın. Ardından, biyolüminesans inkübatör kamerasına odaklanmaya başlamak için su geçirimsiz ısıtmalı nötr yoğunluk filtresini sökün.
Cihaz yazılımında pozlama süresini 0,2 saniyeye ve kinetik döngü süresini 0,3 saniyeye ayarlayın. Elektron çarpma kazancının kapalı olduğunu doğrulayın, ardından kurulum penceresini kapatın ve video kaydına başlayın. Uygun numune rafındaki test öğeleri net bir şekilde odakta olana kadar kamera merceğini döndürmek için odaklama silindirini kullanın.
Ardından video kaydını durdurun. Nötr yoğunluk filtresini değiştirin ve test öğelerini çıkarın. Ardından, deney için istenen oksijen, karbondioksit ve sıcaklık seviyelerini ayarlamak için biyolüminesans inkübatörünün önündeki kontrol panelini kullanın.
Nemlendirilmiş bir deney için, inkübatörün tabanındaki su tepsisini doldurun. Hücreleri doku kültürü inkübatöründen çıkarın ve kültür ortamını önceden ısıtılmış çalışma ortamıyla değiştirin. Küçük hacimler kullanan nemlendirilmiş deneyler için, plakaları gaz geçirgen film veya bantla kapatın.
Plakaları biyolüminesan inkübatöre yerleştirin. Kuluçka makinesini kapatın ve ışığı sistemden çıkarmak için kapı kapağını sabitleyin. Ardından, cihaz yazılımında alım modunu kinetik olarak ayarlayın.
İstenen pozlama süresini ayarlayın. Birikimleri bire, kinetik seri uzunluğunu istenen alım döngüsü sayısına ve kinetik döngü süresini istenen görüntüleme aralığına ayarlayın. İstenilen seviyede 4,33 mikrosaniyelik bir vites değiştirme hızı, bir kazanç ve istenen seviyede bir EM kazancı ayarlayın.
Ardından, otomatik kaydetme dosya türünü sif veya tiff olarak ayarlayın. Otomatik kaydetme dosyasına bir ad verin ve dosya yolunu ayarlayın. Biriktirme dosya türünü sif veya tiff olarak ayarlayın.
Dosya yığınını adlandırın ve dosya yolunu ayarlayın. Kurulum penceresini kapatın ve verileri kaydetmeye başlayın. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, alınan görüntü yığınını görüntü işleme yazılımına aktarın.
Biyolüminesansın en iyi şekilde görüntülenmesi için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Ardından, ilgilenilen bölgeleri seçin ve seçilen alanlar için ortalama sinyali dışa aktarın. Daha fazla işlem için verileri analiz yazılımına kopyalayın.
Deneye başlamak için, Luer konektörleri ve 0,6 veya 0,8 milimetre kanal derinliği ile tek kanallı slaytlar üzerindeki tohum hücreleri. Hücreleri kültürleyin ve sürükleyin. Hidrojen karbonat tamponlu düşük glikozlu DMEM perfüzyon ortamını hazırlayın ve ısıtın.
Daha sonra, iç çapı bir milimetre olan beş adet iki santimetrelik silikon boru bölümünü kesin. 1,2 metre, 10 santimetre ve 30 santimetre bir milimetre iç çaplı etilen tetrafloroetilen boruyu kesin. Tüpü %70 etanol ile sterilize edin ve tüpü steril PBS ile yıkayın.
1.2 metrelik ETFE borusunu steril bir dişi Luer konektörüne ve steril bir dirsek Luer konektörüne bağlamak için sterilize edilmiş silikon boruyu kullanın. Perfüzyon ortamı şırıngasını boş bir Luer kanalı slaytına bağlamak için bu düzeneği kullanın. Ardından, hücre kültürü ortamını önceden ısıtılmış perfüzyon ortamı ile değiştirin.
20 mililitrelik steril bir şırıngayı önceden ısıtılmış perfüzyon ortamı ile doldurun. Silikon boruyu kullanarak 10 santimetrelik ETFE borusunu Luer konektörleriyle takın ve boruyu kızağa bağlayın. Üç ila beş mililitre perfüzyon ortamını borudan ve kanal kızağından yıkayın.
Ardından, 30 santimetrelik ETFE borusunu hücre içeren kanal kızağına takın. Tam perfüzyon sistemini oluşturmak için 10 santimetrelik ETFE borusunun serbest ucunu hücre kanalı sürgüsünün diğer ucuna bağlayın. Hava kabarcıklarını dışlamak için bir mililitre perfüzyon ortamını borudan ve slaytlardan yıkayın.
Perfüzyon sistemini biyolüminesans inkübatörüne taşıyın. Perfüzyon ortamıyla doldurulmuş şırıngayı, hortumun bağlantısını kesmemeye dikkat ederek bir şırınga pompasına sabitleyin. Bir mililitre perfüzyon ortamını perfüzyon sisteminden geçirmek için şırınga pompasını kullanın.
Pompadaki şırınga çapını girin ve akış hızını saatte 50 mikrolitreye ayarlayın. Deneyin başlangıcında perfüzyon sisteminde kabarcık olmaması çok önemlidir, çünkü bunlar biyolüminesans sinyalini bozabilir. Pompayı çalıştırın ve biyolüminesans inkübatör kapağını hemen kapatın.
Işığı sistemden çıkarmak için kapı kapağını sabitleyin. Statik doku kültürleri için açıklandığı gibi verileri alın ve analiz edin. Altı PER2 LUC fibroblast plakası, günlük sıcaklık döngüleri kullanılarak sürüklendi ve bir biyolüminesans inkübatörü kullanılarak görüntülendi.
Seçilen kuyulardan alınan görüntüler analiz edildi ve biyolüminesans çıktısı ölçüldü. PER2 LUC hücreleri, bir Kazein kinaz inhibitörünün PER2 LUC ekspresyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için perfüzyon koşulları altında da görüntülendi. Sonuçlar, statik koşullar altında aynı inhibitör konsantrasyonu ile muamele edilen hücrelerle karşılaştırıldı ve bu da statik koşullar altında önemli ölçüde daha fazla periyot uzaması ortaya çıkardı.
Perfüzyon koşulları altında süre uzamasının büyüklüğü in vivo olarak gözlenene yakın bulundu. Bu videoyu izledikten sonra, bir TİHGAH kullanarak hem statik hem de perfüze biyolüminesans deneylerinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu makale, gen ekspresyonunun non-invaziv izlenmesi için tasarlanmış olan ALLIGATOR adlı otomatik longitudinal lüsiferin görüntüleme sistemini sunar. Sistem, özellikle sirkadiyen ritim araştırmalarında, değişken ekstraselüler koşullar altında kültürlenmiş hücrelerden biyolüminesan kaydın yapılmasını sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoloji
- Biyolüminesans Görüntüleme
Arka Plan
- Genetik olarak kodlanmış lüsiferin, gen ekspresyonu için bir raportör görevi görür.
- Mevcut sistemler, genellikle değişken koşullar altında biyolüminesans gözlemini sınırlandırır.
- ALLIGATOR, longitudinal çalışmalara olanak tanıyarak bu sınırlamaları giderir.
- Bu teknik, özellikle sirkadiyen ritim deneyleri için yararlıdır.
Çalışmanın Amacı
- Biyolüminesan raportörlerin izlenmesinde ALLIGATOR'un yeteneklerini göstermek.
- Çeşitli koşullar altında hücresel tepkileri gözlemlemek için bir yöntem sağlamak.
- Sirkadiyen ritim araştırmalarında deneysel tekrarlanabilirliği artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Sıcaklık döngüleri kullanılarak hücre kültürü ve senkronizasyonu.
- Biyolüminesans kaydı için özel medyanın hazırlanması.
- Kontrollü koşullar için bir biyolüminesans inkübatörün kullanılması.
- Görüntü analiz yazılımı kullanılarak veri toplama ve işleme.
Ana Sonuçlar
- Hücresel sirkadiyen ritimlerin başarılı senkronizasyonu.
- Değişken ekstraselüler koşullar altında etkili biyolüminesans kaydı.
- ALLIGATOR'un farklı deneysel kurulumlar için çok yönlülüğünün gösterilmesi.
- Sirkadiyen ritimlerden başka biyolojik sistemlerde potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- ALLIGATOR, gen ekspresyonunun longitudinal çalışmaları için değerli bir araçtır.
- Sistem, hücresel davranışı uzun süreler boyunca gözlemlemek için yeteneği artırır.
- Gelecekteki uygulamalar, biyolüminesans izleme gerektiren çeşitli alanlara genişleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Longitudinal bioluminescence monitoring under physiologically relevant conditions remains a critical gap in target validation and pathway interrogation. The ALLIGATOR system addresses this by enabling high-sensitivity, high-throughput imaging across variable gas, temperature, and perfusion conditions, reducing physiological artifacts in mechanistic studies. This flexibility supports predictive confidence in early discovery by aligning in vitro observations with in vivo dynamics, particularly for circadian and dynamic signaling pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional dynamics under near-physiological extracellular conditions, improving target hypothesis testing.
- Operational Value: Supports longitudinal tracking of reporter activity without disrupting culture integrity, reducing well-to-well variability.
- Predictive Value: Enhances mechanistic de-risking by capturing temporal gene expression patterns relevant to drug target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, spatially resolved bioluminescence readouts across monolayers, enabling detection of heterogeneous responses in cell populations.
- Operational Value: Compatible with standard tissue culture plates and perfusion setups, allowing integration into existing screening workflows.
- Scalability Value: Facilitates longitudinal assay formats over days to weeks, supporting chronic dosing and adaptive response profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Alignment: Permits evaluation of luciferase reporters under conditions mimicking in vivo temperature and gas fluctuations, improving preclinical predictability.
- Pathway Continuity: Supports longitudinal assessment of clock-controlled or stress-responsive pathways across discovery to preclinical transition.
- Biomarker Readiness: Enables spatial and temporal mapping of reporter expression, aiding in biomarker trajectory modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The ALLIGATOR system fits within the discovery continuum from early target validation through lead optimization, particularly for targets with circadian or dynamic expression patterns. It enables continuous monitoring of pathway modulation, supporting go/no-go decisions based on temporal response profiles rather than endpoint snapshots.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of transcriptional regulators and signaling pathways under physiologically relevant cycling conditions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative luminescence signals suitable for compound library screening in kinetic formats.
- Analytics: Generates exportable intensity and spatial data for downstream modeling of oscillation period, amplitude, and phase.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by simulating body-temperature rhythms and media perfusion.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, adaptable platform for repeated use across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing artifacts from static, non-physiological culture conditions.
- Operational Value: Standardizes long-term bioluminescence acquisition across variable environmental parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by revealing sustained vs. transient target modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on dynamic response fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture synchronization, luciferase reporter systems, and environmental control.
- Dependent on access to a temperature- and gas-regulated bioluminescence incubator with imaging capability.
- Necessitates standardized media preparation and luciferin supplementation protocols for reproducible signal.
- Involves adaptation considerations when transitioning between static, perfused, and gas-variable experimental modes.
- Limited by the need for luciferase-expressing models and compatibility with opaque or pigmented culture vessels.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Cell Seeding and 3-(N-Morpholino)propanesulfonic Acid (MOPS)-buffered High Glucose Medium Preparation
2:52
Bioluminescent Imaging of Static Tissue Cultures
6:31
Bioluminescent Imaging of Perfused Tissue Cultures
9:19
Results: Bioluminescent Imaging of Mammalian Cells Using an ALLIGATOR
10:11
Conclusion
