Genom kapsamındaki bir tanımlama ve ifade Meta-Analizi ATL E3 Ubikuitin ligaz gen ailesinin asma için kapsamlı iş akışı
22 Aralık 2017
Bu makalede tanımlama ve asma Arabidopsis Tóxicos Levadura içinde (ATL) E3 Ubikuitin ligazlar aile için uygulanan bir gen aile karakterizasyonu için yordam açıklanır.
Bu prosedürün genel amacı, bitkilerdeki bir gen ailesinin, gen yapısının tanımı, ilgili protein motifleri, kromozomal konum, gen duplikasyonları ve ekspresyon modelleri dahil olmak üzere küresel bir yaklaşımla kapsamlı bir karakterizasyonu elde etmektir. Bu yöntem, aile üyelerinin dünya genomik tanımlaması ve transkriptomisi gibi ailelerdeki bitkilerin sınıflandırılmasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve bunu gen ekspresyon analizi yoluyla sağlar. Tüm prosedürün ana avantajı, tam bir gen ailesi karakterizasyonu elde etmek için deneysel adımların kapsamlı bir listesini sağlamaktır.
Bu işlem, genetik verilerin mevcut olduğu herhangi bir bitki türünün herhangi bir gen ailesi için uygulanabilir. Ayrıca, bu yaklaşım, fonksiyonel çalışmalar için ilginç adayları belirlemek için değerli bilgiler sağlar. Tüm prosedürü göstermek laboratuvarımdan Pietro Ariani olacak.
Blast web sayfasını açın ve protein blast bölümüne tıklayın. Sorgu dizisini girin alanına, diğer aile üyelerini tanımlamak için prob olarak kullanılacak proteinin amino asit dizisini girin. Aileyi karakterize eden tüm önemli özelliklere sahip bir protein kullanın.
Ardından, alanda arama kümesini seçin, referans protein veri tabanını ve ilgilenilen organizmayı seçin. Şimdi, saha programı seçiminde PSI-BLAST algoritmasını seçin. İstenirse, maksimum hedef dizisi ve puanlama matrisi gibi gelişmiş parametreleri ayarlamak için algoritma parametrelerine tıklayın.
E değeri, bu arama için 005'ten 001'e düşürülen eşiktir. Analizi çalıştırmak için BLAST düğmesine tıklayın. Sorguya göreli eşleşmeleri görüntüleyen tüm dizilerden, aileye ait olmadığı açık olan girişlerin seçimini kaldırın.
Bunu, PSI-BLAST için seç sütunundaki onay işaretine tıklayarak yapın. Ardından, git düğmesine tıklayarak ikinci bir PSI-BLAST yinelemesi çalıştırın. Yeni tanımlanan dizilerin tümü sarı renkle vurgulanacaktır.
Yine, aileye ait olmayan isabetlerin seçimini kaldırın. Algoritma herhangi bir ilgili giriş bulamayana veya yakınsamaya ulaşana kadar bu işleme devam edin. Tüm yanlış pozitifler ayıklandıktan sonra, amino asidik dizileri FASTA formatlı bir dosyada toplayın ve dosyayı biyo-informatik yazılım paketine yükleyin.
Ardından, listedeki tüm içe aktarılan dizileri seçin ve araç çubuğundaki hizala/birleştir düğmesine tıklayın. Ardından çift yönlü çoklu hizalamaya tıklayın ve MUSCLE hizalama ve Tamam'ı seçin. Hizalama şimdi varsayılanlar kullanılarak yapılacaktır. Şimdi hizalamanın dizi logosunu görselleştirin ve yanlış pozitifleri aramak için genleri görsel olarak inceleyin.
Protein fiziksel parametrelerinin ve alanlarının, kromozomal dağılımın, duplikasyonların ve ekzon intron organizasyonunun daha fazla analizi metin protokolünde açıklanmaktadır. Daha sonra, yüksek kaliteli bir filogenetik ağacın inşası ve bir aile terminolojisinin tanımlanması yoluyla ATL ailesi üyeleri arasındaki ilişkileri analiz edin. İlk olarak, referans için UmoProt veritabanından bir üzüm asma geni isimlendirmesi için referans olarak gerekli olan Arap benimseme systeliana ATL dizilerini alın.
Ardından, filogenetik analiz için üzüm asmasının tüm nükleotid dizilerini ve Arabidopsis gen ailesi üyelerini içeren bir FASTA dosyası oluşturun. Şimdi filogeni Fransa ana sayfasına göz atın ve filogeni analizi işlem hattını seçin. Çoğu durumda tek bir tıklama uygundur, ancak gerekirse, gelişmiş seçenekleri kullanarak belirli gelişmiş ayarları seçmek veya hatta alakart seçenekleri kullanarak tamamen özelleştirilmiş bir analiz yapmak mümkündür.
Ardından, analiz için bir ad girin ve FASTA dosyasını yükleyin. Ardından analizi çalıştırmak için gönder'e tıklayın. Bu yordam bir hata iletisiyle sonuçlanırsa, filogeni paketi işlem hattının her adımını ayrı ayrı tamamlayın.
İlk olarak, MUSCLE yazılımı ana sayfasına gidin ve FASTA dosyasını yükleyin. Çıktı formatı olarak Pearson FATA'yı seçin ve gönderin. Ardından, dosyayı FASTA formatında indirin ve kötü hizalanmış konumları ortadan kaldırın.
G-blok sunucu aracını açın, hizalama FASTA dosyasını yükleyin, dizi türü olarak DNA'yı seçin ve analize en uygun sıkılığı seçin. Bir üzüm asması ATL gen ailesi hizalaması için, yüksek dizi sapması nedeniyle daha az katı seçim için önerilen üç seçeneğin tümünü seçin. Ardından analizi çalıştırmak için blokları al'a tıklayın.
Sonuçları kaydetmek için, çıktı sayfasının altındaki ortaya çıkan hizalamaya tıklayın ve yeni bir FASTA dosyası oluşturun. G-blokları, bir DNA'nın farklı bölgelerindeki zayıf hizalanmış konumu veya prodding hizalamasını ortadan kaldırır, böylece filogenetik bir analiz için daha uygun hale gelir. Bu adımda, sütunların sıkılığı için emperyal parametre seçimi, bunların üçünün sorumluluğu olduğundan emin olmak için çok önemlidir.
Ağacı tamamlamak için Phylogeny France ana sayfasına dönüyoruz. Orada, alakart boru hattını seçin ve aşağıdaki seçeneklerin seçimini kaldırın: çoklu hizalama ve hizalama iyileştirme. Ardından, iş akışı oluştur'a tıklayın, G blokları küratörlüğünde FASTA dosyasını yükleyin, önyükleme prosedürünü seçin ve varsayılan parametreleri ve ayarları kullanın.
Son olarak, analizi çalıştırmak için gönder'i tıklayın. Bu, adım adım işlemi tamamlar. Artık filojenik ağaç yapıldığına göre, yetersiz desteklenen dalları %70'in altında önyükleme değerleriyle çökertinArdından, daha fazla analiz için nihai sonuçları Newick formatında indirin.
Metin protokolü, filogeniye dayalı olarak bir gen adı atama talimatları sağlar. Bu protokol için, bir gen ekspresyon kitaplığından alınan arma normalleştirilmiş ifade değerlerinin dokunulmuş, çizgili, metin biçiminde bir dosyası oluşturun. Her aile geni için değerleri aynı desen satırları altında düzenleyin.
Ardından, çok deneyli görüntüleyici yazılımı kullanarak hiyerarşik iki kümeli analizi gerçekleştirin. İlk olarak, çalışan veri matrisini yükleyin ve metin dosyasını seçin. Tek renkli diziyi seçin ve otomatik bir açıklama sağlanmadığında onay işaretini yükleme ek açıklamasından kaldırın.
İfade tablosu önizlemesinin sol üst köşedeki ifade değerini seçin ve yükle düğmesine tıklayın. Ardından, Log2 dönüşümü ve gen/satır normalleştirmesi uygulayarak verileri ayarlayın. Ardından uygun ölçek sınırını ayarlayın.
Şimdi hiyerarşik kümelemeyi hesaplayın. Sipariş optimizasyonu alanında, gen yaprağı sırasını optimize et ve numune yaprağı sırasını optimize et'i seçin. Ardından, bağlantı yöntemi seçim alanında ortalama bağlantı kümelemesi'ni seçin ve mesafe matrisi seçimi alanında Pearson korelasyonu'nu seçin.
Ardından analizi çalıştırmak için Tamam'a tıklayın. Sonuçları pencerenin sol panelinde görüntüleyin ve dosya menüsünde görüntüyü kaydet'e tıklayarak ısı haritasını dışa aktarın. Bir BLAST-P araştırmasına göre, arabidopsis thaliana ATL2'ye en benzer gen, üzüm asma genomundaki ATL aile üyelerini araştırmak için kullanıldı.
PSI BLAST analizi, gen ailesindeki varsayılan genlerin bir listesini sağlayan birkaç döngüden sonra birleşti. Her aday için kanonik halka H2 alanının varlığı, MUSCLE hizalamasının görsel incelemesi ile değerlendirildi. Bu, aramayı 96 üzüm asma genine daralttı.
Bir isimlendirme için tanımlanan genlerin filogenetik analizi, bunları arabidopsis ATL gen ailesi ile karşılaştırarak kullanıldı. 96 üzüm asması ATL'sinden 13'ü, arabidopsis ATL gen ortoloğu olarak spesifik bir tanımlayıcı aldı. Tanımlanan genlerin hiyerarşik iki kümeli bir analiz kullanılarak üzüm asması küresel gen ekspresyon atlasına haritalanması, 96'nın tümünün en az bir dokuda eksprese edildiğini ve beş ekspresyon kümesinin tanımlanabileceğini gösterdi.
Biyotik streslere yanıt olarak bu genlerin ekspresyonunu incelemek için de benzer bir yaklaşım uygulandı. ATL gen ailesinin, en az iki durumda önemli bir modülasyon gösteren 62 gen ile patojen enfeksiyonuna yanıt olarak doğrudan katılımı vardı. Bu videoyu izledikten sonra, bir gen ailesini karakterize etmek için kullanılan yazılımlarla nasıl başa çıkılacağını iyi anlamış olmalısınız.
Bu prosedürü denerken, belirli bir gen ailesinin özelliklerini ve tüm genom ailesi üyesinin tanımlanması için kullanılan ilgili probu dikkatlice tanımlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, gen aileleri isimlendirmesi için gerekli olan türler dışındaki türlere dayalı ek filogenetik ağaçlar yaparak gen ailesi evrimini ve P30 fonksiyonunu araştırmak mümkündür.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, üzüm bitkisinde bir gen ailesinin tanımlanması ve karakterizasyonu için bir prosedürü açıklar, özellikle Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 ubikuitin ligazlarına odaklanır. Yöntem, gen yapısı, protein motifleri, kromozomal konum, gen çoğaltmaları ve ekspresyon paternleri hakkında kapsamlı bir anlayış sağlamayı amaçlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki Genetiği
- Gen Karakterizasyonu
- Ubiquitin Ligazları
Arka Plan
- Gen ailelerini anlamak, bitki sınıflandırması için çok önemlidir.
- Gen ekspresyon analizi, aile üyelerinin tanımlanmasına yardımcı olur.
- Karakterizasyon, daha fazla çalışma için işlevsel adayları ortaya çıkarabilir.
- Bu yöntem, mevcut genetik verilere sahip herhangi bir bitki türü için uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Bir gen ailesinin kapsamlı karakterizasyonunu gerçekleştirmek.
- Gen yapısını ve ilişkili protein motiflerini tanımlamak.
- Gen çoğaltmaları ve ekspresyon paternlerini analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Gen aile üyelerinin global genomik tanımlanması.
- Gen ekspresyon profili için transkriptomik analiz.
- Genel aile karakterizasyonu için deneysel adımlar.
- Prosedürün çeşitli bitki türlerine uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Kapsamlı deneysel adımların listesi sağlanmıştır.
- Fonksiyonel çalışmalar için ilginç adayların tanımlanması.
- Bitkilerde gen aile sınıflandırmasına ilişkin görüşler.
- Prosedürün Pietro Ariani tarafından gösterimi.
Sonuçlar
- Prosedür, gen aile karakterizasyonu için sistematik bir yaklaşım sunar.
- Bitki genetiği ve evrimini anlamamızı artırır.
- Bitki biyolojisi alanındaki gelecekteki araştırmalar için değerlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Genome-wide identification and meta-analysis of gene families, such as ATL E3 ubiquitin ligases in grapevine, enable systematic target validation and mechanistic de-risking in plant biotechnology pipelines. This workflow supports predictive confidence in functional genomics, informing candidate prioritization for trait engineering and stress adaptation studies. The approach is broadly applicable to any plant species with genomic data, enhancing portfolio decision-making in agricultural R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive cataloging of gene family members for hypothesis-driven target selection.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene structure, duplication, and conserved motifs.
- Facilitates functional annotation and prioritization of candidates for downstream validation.
Screening & Assay Development
- Provides standardized gene family datasets for assay development and screening workflows.
- Enables reproducible identification of expression patterns across tissues and conditions.
- Supports scalable analysis of gene function and response to biotic stressors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression clusters with phenotypic outcomes relevant to stress adaptation.
- Enables continuity from discovery genomics to trait validation in preclinical plant models.
- Supports risk-adjusted advancement of gene candidates for functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical trait validation in plant biotechnology pipelines.
- Discovery Biology: Supports genome-wide hypothesis testing and gene family classification for target validation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression profiles for candidate triage.
- Analytics: Provides hierarchical clustering and phylogenetic outputs to compare gene family members.
- Translational Research: Links gene expression modulation to stress response phenotypes in plants.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable informatics workflow adaptable to any plant gene family with available genomic data.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function and target selection.
- Operational Value: Standardizes gene family characterization and expression analysis across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for candidate advancement and resource allocation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene targets for trait engineering and stress adaptation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bioinformatics, phylogenetics, and gene expression analysis.
- Depends on access to genomic databases, alignment tools, and clustering software.
- Necessitates standardized data processing and annotation protocols across teams.
- Adaptable to diverse plant species and gene families with available sequence data.
- Stringency in alignment and clustering parameters is critical for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:04
Identifying Putative Gene Family Members, Making Alignments, and Sequence Logos
3:33
Phylogenetic Analysis and Nomenclature
6:51
Tissue Expression Meta-analysis
8:27
Results: Identified ATL Gene Family Members in the Grapevine Genome
9:52
Conclusion
