Hızlı algılama nörogelişimsel fenotipleri insan sinir habercisi hücrelerdeki (NPCs)

Bu protokolün genel amacı, insan nöral öncü hücrelerinin erken beyin gelişim süreçlerini hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde karakterize etmek ve bu süreçlerin düzenlenmesinde önemli hücre dışı faktörlerin etkilerini tanımlamaktır. Bu yöntem, nöropsikiyatri ve nörogelişimsel bozukluklar alanlarında, etkilenen tüm bireylerin aynı hücresel anormalliğe sahip olup olmadığı veya alternatif olarak, her biri bir kişinin spesifik işlev bozukluğunu gösterip göstermediği gibi önemli soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Protokolümüzün ana avantajı, hızlı, yüksek oranda tekrarlanabilir ve uygulanmasının kolay olmasıdır.

Bu yöntem nörogelişimsel bozukluklar hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilse de, Alzheimer ve depresyon gibi nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik bozuklukları incelemek için de kullanılabilir. Bu yöntemlerden bazılarının görsel gösterimi gereklidir, çünkü bazı teknikler hücreleri bir tabaktan diğerine taşımayı içerir veya en iyi görsel gösteri yoluyla iletilen morfolojik analizler gerektirir. İnsan nöral öncü hücrelerini kaldırmak için, ortamı aspire edin ve hücreleri bir kez 1X fosfat tamponlu salin ile yıkayın.

Fosfat tamponlu salini aspire edin ve nöral öncü hücrelerle birlikte bir kuyuya 500 mikrolitre 1X hücre ayırma solüsyonu ekleyin. Ardından, plakayı 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri yıkamak ve çıkarmak için oda sıcaklığında tutulan 500 mikrolitre fosfat tamponlu salin eklemek için bir P1000 pipeti kullanın.

Daha sonra, fosfat tamponlu salin içindeki hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. İyiliği bir mililitre fosfat tamponlu tuzlu su ile tekrar yıkayın ve yıkamayı tüpe aktarın. Daha sonra, peleti oluşturmak için hücreleri beş dakika boyunca 300 G'de döndürün.

Ardından, süpernatanı atın ve peleti bir ila beş mililitre önceden ısıtılmış DMEM F12 ortamında yeniden süspanse edin. 24 oyuklu bir plakada üçlü kuyucuklarda 100.000 hücre plakası. 46 saat sonra, kültür ortamına tritiye timidin ekleyin ve iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, ortamı çıkardıktan sonra, 300 mikrolitre önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri ayırmak ve DNA'yı serbest bırakmak için 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Ardından, hücre hasat makinesini çevirin ve pompayı çalıştırın. Hücre hasat makinesine bir filtre kağıdı yerleştirin.

Hücre hasat makinesinin tüplerini boş bir tepside toplamaya devam edin. Ardından, filtre kağıdını ıslatmak için ön yıkamaya basın. Toplama tüplerini numune kuyucuklarına yerleştirin ve başlayın.

Filtre kağıdını kurutmak için sıcak bir ışık kaynağı kullanın ve ilgili şişeleri tepsiye yerleştirin. Şişelere kağıt çatlakları delin ve ardından her şişeye iki mililitre sıvı sintilasyon kokteyli ekleyin. Aktif DNA sentezini yansıtan her numunenin dakika başına sayımını elde etmek için makineyi çalıştırmadan önce şişeleri sintilasyon sayacında bir saat inkübe edin.

35 milimetrelik bir kültür kabında 500.000 hücre tohumlayın. Ardından, hücreleri eşit şekilde dağıtmak için tabağı her yöne çalkalayın. Daha sonra, hücreleri 46 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, kültüre mililitre başına beş milimolar EdU iki mikrolitre ekleyin ve iki saat inkübe edin. Ardından, hücreleri ayırın ve peletleyin. Hücre peletine, büyüme faktörleri veya ilaçlar olsun veya olmasın, üç mililitre% 30 genleşme ortamı ekleyin.

Önceden kaplanmış tabakların üzerine bir mililitre hücre süspansiyonu koyun ve plakayı iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kültürdeki nöral öncü hücre sayısını incelemek için, iki gün sonra mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve hazırlayın. Daha sonra, ortamı kuyudan aspire edin ve 200 mikrolitre 1X hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Hücre ayrılmasından sonra, her oyuğa 300 mikrolitre 1X fosfat tamponlu salin ekleyin. Hücre çözeltisini birkaç kez pipetlemek için bir P1000 pipeti kullanın ve hücreleri plakadan ayırın. Daha sonra, hücre çözeltisini hazırlanan 1.5 mililitrelik tüpe aktarın ve tüpü iki ila üç kez ters çevirin.

Bir pipet kullanarak, tüpün yarısına kadar 50 mikrolitre hücre çekin ve 0,5 mililitrelik bir tüpte tripan mavisi çözeltisine ekleyin. Ardından, bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Nörosferi oluşturmak için, herhangi bir kaplama substratı olmadan 35 milimetrelik bir tabağa bir mililitre %100 genleşme ortamı pipetleyin.

Daha sonra, bu plakaların her birine bir milyon nöral öncü hücre ekleyin ve plakayı 48 ila 96 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Plakayı nörosfer göçüne hazırlamak için, ECM taklitçi jel alikotlarını altı mililitre% 30 genleşme ortamında çözün. Altı oyuklu bir plakanın tek bir oyuğuna% 30 genleşme ortamı ile bir mililitre ECM mimik jeli ekleyin.

Ardından, plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Nörosferleri kaplamak için, ortamdaki hücreleri 35 milimetrelik çanaktan toplamak için bir pipet kullanın ve bunları konik bir tüpe aktarın. Ardından, nörosferleri peletlemek için tüpü 100 G'de döndürün.

Ardından, peleti bir ila üç mililitre önceden ısıtılmış %30 genleşme ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, 200 mikrolitre yeniden süspanse edilmiş nöroküreleri,% 30 genleşme ortamı ile ECM taklit jeli içeren altı oyuklu plakaya pipetleyin ve plakayı sallayın. Ardından, plakayı 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

ECM taklit jeli %30 genleşme ortamı ile aspire edin ve ardından hücreleri %4 paraformaldehit kullanarak 30 dakika sabitleyin. Nörosferleri analiz etmek için 10X büyütmede faz kontrast ayarlarını kullanarak görüntüler yakalayın. Nörosferlerin ortalama göçünü ölçmek için NIH ImageJ yazılımını kullanın.

ImageJ'de, nörosferin dış konturunu izlemek için serbest çizgi aracını kullanın. Ardından, izleme alanını hesaplamak için ölçü işlevini kullanın ve kürenin iç hücre kütlesini izleyin. Ortalama göçü ölçmek için iç hücre kütlesini toplam nörosfer alanından çıkarın.

İmmünositokimyasal boyama, üçüncü pasajda nöral öncü hücrelerde hücre iskeleti proteinlerinin ve SOX2, PAX6 ve nestin gibi transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu incelemek için yapıldı. Daha sonra, nörit taşıyan hücreleri tanımlamak için faz kontrast görüntüleri yakalandı. Görüntüden, iki hücre gövdesine eşit veya daha uzun süreçlere sahip hücreler nörit taşıyan olarak kabul edilirken, iki hücre gövdesinden daha kısa süreçlere sahip hücreler nörit taşıyan olarak kabul edilmez.

Nörosfer oluşumunu doğrulamak için, 72 saatlik zaman noktasında toplanan nörosferlerin 80 mikrometre ile 120 mikrometre arasında olduğunu ve bu nedenle göç tahlili için kullanılabileceğini gösteren faz kontrast görüntüleri yakalandı. Proliferatif kapasiteyi tanımlamak için, nöral öncü hücreler kontrol veya fibroblast büyüme faktörü koşullarında büyütüldü ve EdU varlığı için boyandı. Faz kontrastlı floresan görüntüler, fibroblast büyüme faktörü ile tedavi edilen hücrelerin, EdU boyama ile gösterildiği gibi S-fazına giren hücrelerin daha yüksek bir oranına sahip olduğunu göstermektedir.

Daha sonra, nörit büyümesini kontrol etmek için, hücreler kontrol koşullarında test edildi ve PACAP ile karşılaştırıldı. Faz kontrast görüntüleri yakalandı ve PACAP tedavisi altında nöritli hücre sayısında bir artış olduğunu gösterdi. Daha sonra, nörosfer göçünü anlamak için hücreler PACAP nöropeptitleri ile tedavi edildi.

Elde edilen faz kontrast görüntüleri, kontrole kıyasla artmış nörosfer göçünü göstermektedir. Protokolümüz, her biri farklı süreler gerektiren birçok teknik ve test içerir. Ustalık üzerine, ortalama tahlilin kurulması iki ila üç saat ve analiz edilmesi 30 dakika ila üç saat sürebilir.

Bu prosedürleri gerçekleştirirken, yüksek kaliteli nöral öncü hücreler kullandığınızdan ve bu hücrelerin nörosfer tahlili hariç her koşulda tamamen ayrıştığından ve düzgün bir şekilde dağıldığından emin olmanız çok önemlidir. Bu prosedürleri takiben, altta yatan mekanizmaları karakterize etmek için Western blotlama, QRT-PCR, transkriptomik, proteomik ve metabolomik dahil olmak üzere diğer analizler yapılabilir. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.