Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Bu prosedürün genel amacı, beyin gelişimi sırasında, özellikle serebral korteks ve beyincikte epigenetik değişiklikleri analiz etmektir. Bu yöntem, H3K79 metilasyonu gibi histon modifikasyonlarının kortikal ve serebellar tabakalaşmanın gelişimini nasıl etkileyebileceği gibi nörobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, belirli gelişimsel zaman noktalarında farklı beyin bölgelerinde, lokusa özgü veya genom çapında histon modifikasyonlarını in vivo olarak inceleyebilmemizdir.

P5'ten P7'ye kadar olan beyinler ve MRI fareleri ile başlayın. Tüm meninksleri ve kan damarlarını çıkarın. Daha sonra çip başına üç ila beş serebellayı 15 mililitrelik tüplere aktarın.

Santrifüjlemeden önce serebelları HBSS glikozu ile yıkayın. Dokuyu toplamak için tüpleri santrifüjleyin. Son yıkamadan sonra, parçalar 0,5 ila bir küp milimetre boyutunda olana kadar bir mililitrelik pipetle iki ila üç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek serebellayı homojenize edin.

2,5 mililitre kalana kadar tüm sıvıyı yavaşça çıkarın. Daha sonra serebella içeren HBSS glikozu ile tüpe% 0.05 tripsin ekleyin. Ve dokuyu 37 santigrat derece su banyosunda 15 dakika inkübe edin.

Dokuyu her bir ila üç dakikada bir ters çevirin. İnkübasyonun ardından, beş mililitre CGNP hücre kültürü ortamı veya CGM ekleyerek sindirimi durdurun ve dokuyu daha önce olduğu gibi santrifüjleme ile toplayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve bir mililitre CGM ekleyin.

Hava kabarcıklarının oluşumunu önleyerek dokuyu bir mililitrelik pipet ucuyla ezin. Daha sonra beş mililitre CGM ekleyin ve doku kalıntılarını yerleştirmek için karışımı buz üzerinde iki dakika inkübe edin. Doku yerleştikten sonra, süpernatanı 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Daha sonra artık dokuya iki mililitre CGM ekleyin ve süpernatanı hasat etmeden ve doku kalıntılarını atmadan önce öğütme prosedürünü tekrarlayın. Her 15 mililitrelik doku tüpünden süpernatanları toplayın ve serebellar hücreleri toplamak için santrifüjleyin. Peleti 10 mililitre CGM'de yeniden süspanse edin.

Astrositler, poli-D-lizine CGNP'lerden daha hızlı ve daha güçlü yapıştığından, poli-D-lizin kaplı 6 oyuklu plakaların kuyucuklarına dört mililitreye kadar hücre süspansiyonu ekleyin ve astrositleri çıkarmak için 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Plakayı sallayın, süpernatanı 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve ardından süpernatanı daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Peletleri 10 mililitre CGM'de yeniden süspanse edin ve hücreleri bir Neubauer sayma odası ile sayın.

Dört ila altı saat sonra, yapışan CGNP'ler yuvarlak görünür ve proliferatif olur. Hücreleri CGM'de poli-L-ornitin kaplı plakalara tohumlayın ve 37 santigrat derece, %5 CO2 ve %100 bağıl nemde inkübe edin. Bir gün in vitro veya DIV1'den sonra, çoğu CGNP yuvarlaktır ve çoğalır.

Bazı CGNP'ler farklılaşmaya başlayacak ve nöronal çıkıntıların büyümesine başlayacaktır. Kültürlenmiş hücreleri sabitlemek için, CGNP içeren kuyucuklara doğrudan bir mililitreye kadar% 1 PFA ekleyin. 22 santigrat derecede beş dakikalık bir inkübasyondan sonra, 53 mikrolitre glisin ekleyin ve üç mililitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.

Hücreleri bir mililitre PBS'de hasat etmek için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücreleri 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve 1.000 g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, proteaz inhibitörü içeren 700 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve numuneleri dört santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Bu süre zarfında numuneleri her beş dakikada bir vorteksleyin. İnkübasyonun ardından, hacmin tüp başına 400 mikrolitreyi geçmemesini sağlamak için numune tüplerini bölün. Daha sonra, lyse hücrelerinin kromatinini kesmek için maksimum güçte 10 dakika boyunca sonikat yapın.

10 dakika sonra, örnekleri girdaplayın ve ardından sonikasyonu ve girdabı iki kez daha tekrarlayın. DAPI kullanarak bir faz kontrast mikroskobu veya floresan mikroskobu ile kalan çekirdekler için lizatı kontrol edin. Hücre kalıntılarını 13.000 g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyerek peletleyin.

Bittiğinde, ön temizleme adımı için süpernatanı kullanın. Numuneleri önceden temizlemek için önce numune başına 20 mikro litre konjuge olmayan manyetik boncukları buz gibi soğuk PBS Tween'de yıkayın. Manyetik bir stand yardımıyla yıkamaları çıkarın.

Daha sonra, ön temizleme için her numuneye 600 mikrolitre seyreltme tamponu ve 20 mikrolitre yıkanmış manyetik boncuk ekleyin ve bir döndürücü üzerinde dört santigrat derecede iki saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, manyetik bir stand kullanarak boncukları çıkarın. Daha sonra her bir lizatın% 5'ini giriş numunesi olarak alın ve eksi 20 santigrat derecede dondurun.

Numuneler önceden temizlenirken antikor eşleşmesi gerçekleştirilebilir. Çip başına 45 mikrolitre Protein A Manyetik Boncuk'u daha önce olduğu gibi buz gibi PBS Tween ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, boncuklara bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin.

Daha sonra 45 mikrolitre boncuk başına üç mikrogram antikor ekleyin. Antikorları boncuklara bağlamak için bir döndürücü üzerinde dört santigrat derecede iki saat inkübe edin. Kuluçka süresi geçtiğinde, yıkanmış antikora bağlı boncukları buz gibi soğuk PBS'nin bir boncuk hacminde yeniden süspanse edin.

Önceden temizlenmiş her bir ekstraktı yaklaşık 643,5 mikrolitrelik iki tüpe bölün. Aynı hacimde seyreltme tamponu ve antikora bağlı boncuklar ekleyin ve numuneleri bir döndürücü üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, boncukları buz gibi soğuk talaş tamponları ile her biri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede bir döndürücüde yıkayın, ardından TE tamponu ile beş dakikalık üç yıkama yapın.

Elüsyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 1.400 RPM'de bir saat seyreltin. Bir saat geçtikten sonra, her çip örneğine 10 mikrogram Rnase ve giriş örneklerine beş mikrogram ekleyin. Numuneleri çalkalayıcı üzerinde 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Son olarak, çip numunesi başına 100 mikrogram Proteinaz K ve giriş başına 50 mikrogram ekleyin. Gece boyunca 65 santigrat derecede 1.400 RPM'de inkübe edin. H3K79 dimetilasyon seviyeleri, üç günlük CPC kültürü ve SGC 0946 ile DOT1L inhibisyonundan sonra azalır.

Çip analizinden sonra QCPR, başlangıçta yüksek histon-3-lizin-79 metilasyon seviyelerine sahip genlerin inhibitör tedavisine en duyarlı olduğunu ortaya koydu. Daha düşük H3K79 dimetilasyon kapsamına sahip genler, metilasyon seviyelerinde önemli bir değişiklik göstermedi. Bu ısı haritası, histon-3-lizin-79 metilasyon seviyelerinin transkripsiyon başlangıç bölgesi etrafında zirve yaptığını ve transkripsiyon bitiş bölgesine doğru azaldığını göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık bir hafta içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, izole beyin hücrelerinde histon modifikasyonları üzerinde kromatin immünopresipitasyonunun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.