Name: Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Keşfedin kromatin immunoprecipitation yöntemiyle H3K79me2 epigenetik modifikasyonlarını analiz etmeyi. Bu teknik, embriyonik ve postnatal beyin dokusundan izole edilen sinir progenitör hücrelerinde histon modifikasyonlarını incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Henriette Bertemes laboratuar CGN ekimi protokolde kurmak için yardım ettiğin için teşekkür ederim. Bu yöntem kağıt DFG tarafından finanse edilen CRC992 tıbbi epigenetik tarafından TV için fon tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Freiburg Galaxy takım destek kabul: Pavankumar Videm, Björn Grüning ve Prof. Dr. Rolf Backofen, Biyoinformatik, Freiburg Üniversitesi, Almanya ortak araştırma merkezi 992 tıbbi epigenetik tarafından (DFG grant SFB 992/1 2012) finanse ve Alman Federal Bakanlığı Eğitim ve araştırma (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).

<ol><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).</li>
<li>Kandel, E. R., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience%3A+breaking+down+scientific+barriers+to+the+study+of+brain+and+mind%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind.</a> Science. 290, 1113-1120 (2000).</li>
<li>Götz, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+development%3A+the+art+of+generating+cell+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Cortical development: the art of generating cell diversity.</a> Dev. Camb. Engl. 132, 3327(2005).</li>
<li>Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+neural+precursor+cell+fate+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of neural precursor cell fate during development.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).</li>
<li>Davis, A. A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-renewing+multipotential+stem+cell+in+embryonic+rat+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex.</a> Nature. 372, 263-266 (1994).</li>
<li>Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+controlling+cortical+gliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).</li>
<li>McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+dependence+of+laminar+determination+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex.</a> Science. 254, 282-285 (1991).</li>
<li>Desai, A. R., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+restriction+in+fate+potential+by+neural+progenitors+during+cerebral+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development.</a> Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).</li>
<li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellum%3A+history%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li>
<li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).</li>
<li>Azevedo, F. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equal+numbers+of+neuronal+and+nonneuronal+cells+make+the+human+brain+an+isometrically+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain.</a> J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li>
<li>Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+by+histone+methylation%3A+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).</li>
<li>Sanders, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+histone+H4+lysine+20+controls+recruitment+of+Crb2+to+sites+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage.</a> Cell. 119, 603-614 (2004).</li>
<li>Martin, C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functions+of+histone+lysine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The diverse functions of histone lysine methylation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).</li>
<li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation%3A+a+dynamic+mark+in+health%2C+disease+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).</li>
<li>Ng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methylation+within+the+globular+domain+of+histone+H3+by+Dot1+is+important+for+telomeric+silencing+and+Sir+protein+association%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association.</a> Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).</li>
<li>Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+types+and+sites+of+histone+modifications+emerge+as+players+in+the+transcriptional+regulation+contest%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest.</a> FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).</li>
<li>Roidl, D., Hacker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+during+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Histone methylation during neural development.</a> Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).</li>
<li>Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tale+beyond+the+tail%3A+histone+core+domain+modifications+and+the+regulation+of+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).</li>
<li>van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dot1p+Modulates+Silencing+in+Yeast+by+Methylation+of+the+Nucleosome+Core%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core.</a> Cell. 109, 745-756 (2002).</li>
<li>Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+H3K79+methyltransferase+Dot1L+is+essential+for+mammalian+development+and+heterochromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure.</a> PLoS Genet. 4, e1000190(2008).</li>
<li>Woo Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RE-IIBP+Methylates+H3K79+and+Induces+MEIS1-mediated+Apoptosis+via+H2BK120+Ubiquitination+by+RNF20%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20.</a> Sci. Rep. 5, 12485(2015).</li>
<li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. , (2016).</li>
<li>Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+H3K79+methyltransferase+Dot1L+is+essential+for+mammalian+development+and+heterochromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure.</a> PLoS Genet. 4, e1000190(2008).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+mammalian+erythropoiesis+requires+the+Dot1L+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase.</a> Blood. 116, 4483-4491 (2010).</li>
<li>Cattaneo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOT1L-mediated+H3K79me2+modification+critically+regulates+gene+expression+during+cardiomyocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation.</a> Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li>
<li>Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Af9%2FMllt3+interferes+with+Tbr1+expression+through+epigenetic+modification+of+histone+H3K79+during+development+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).</li>
<li>Roidl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOT1L+Activity+Promotes+Proliferation+and+Protects+Cortical+Neural+Stem+Cells+from+Activation+of+ATF4-DDIT3-Mediated+ER+Stress+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dayt.+Ohio%22%5BJournal%5D)">DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9, R137(2008).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).</li>
<li>Roidl, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoidl%2C+D+%22Histone+modifications+during+cerebral+cortex+development%22">Histone modifications during cerebral cortex development</a>. , (2015).</li>
<li>Turner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP+with+Native+Chromatin%3A+Advantages+and+Problems+Relative+to+Methods+Using+Cross-Linked+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Mapping+Protein%2FDNA+Interactions+by+Cross-Linking%22%5BJournal%5D)">ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material.</a> Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).</li>
<li>Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cortical+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirmek

Histon değişiklikler, transkripsiyon faktörleri, Histon Kodu okuyucular, yazarlar veya silgi genomik doluluk algılamaya Kromatin immunoprecipitation gerçekleştirmek için iki ana yolu vardır. Bir sindirilmiş, nükleaz için immunoprecipitation, yerel Kromatin kullanarak yerel çip yöntem ve diğer içinde oluşturarlar ve diğer DNA bağlı proteinler kovalent DNA'yı bağlı olduğu İngiltere'de yılın sabit, yamultulmuş Kromatin kullanarak sunulan yöntemdir 39. yerli küçük parça ile yüksek antikor algılama ora...

Beynin duyusal, motor ve Bilişsel işlevler son derece karmaşık ve fiziksel ve çevresel değişikliklere duyarlı. Beyin üç genel parçalar hind-, orta-ve ön, hangi derin bağlı oluşur. Ön içinde telencephalon dorsal telencephalon (DT) ve ventral telencephalon (VT) bölünmüş olabilir. DT farelerin, E11.5 ve E18.5 arasında bir "Inside-out" şekilde1' de kurulan altı kortikal Katmanlar oluşur. VT ganglionic efendiler gelişmede, daha sonra Bazal gangliyon2,3formu içerir. Çeşitli hücre tiplerinin nöronlar, astrocytes veya oligodendrocytes4, gibi memeli merkez sinir sisteminde temporo-kayma şekilde5' te geliştirmek sınıflandırılabilir. İlk olarak, nöral progenitör hücre (NPCs) nöronlar, interneurons VT ve projeksiyon nöronların farklı türde DT ve daha sonra üzerine gliyal hücreler (örneğin, astrocytes6) ortaya çıkmasına. Sırasında kortikal gelişim, en yüzeysel Katmanı (katman ben), hangi Cajal Retzius hücreleri içeren ilk oluşturulur. O zaman, E12.5 ve E14.5 arasında NPCs derin nöronal katmanları (VI, V) iken üst katmanı (IV-II) nöronlar7,814.5 ve 16.5, ataları vermek yükselişi arasında oluşturmak. Nöronal kimlik farklı morphogen kaynaklı temporo-kayma transkripsiyon program tarafından ve ayrıca epigenetik programları2tarafından belirtilir.
Motor koordinasyon içinde karıştığı, beyincik, arka beyin içinde yer alan ve E10 ve kabaca P20 arasında fare9' geliştirir. Serebellar korteksin ve serebellar çekirdeği10içerir. Yetişkin serebellar korteksin üç kat, en dıştaki moleküler katmanı, Purkinje hücre katmanı ve taneli nöronlar10içeren en içteki taneli katman oluşur. Serebellar granül hücre en küçük nöronlar vardır ve tüm omurgalı beyin11nöronlarda yaklaşık % 80'i temsil eder. Onlar üzerinden dış germinal bölgede bulunan öncüleri geliştirmek ve onların hedef12Purkinje hücre katmanı üzerinden göç. Telencephalon, beyincik geliştirilmesi birkaç önemli morfojenlerdeki tarafından düzenlenmiştir gibi hangi-si olmak belirli zaman ve uzay bağımlı görev ve başlatmak transkripsiyon programlar10tanımlı.
Kortikal ve serebellar katmanları gelişimi belirli morfojenlerdeki transkripsiyon ifadesi tarafından ve böylece, DNA'ın Kromatin devlet tarafından kontrol edilir. Basitleştirilmiş bir görünümde, Kromatin Birleşik transcriptionally etkin olarak euchromatin ve heterochromatin transcriptionally sessiz bölgeleri olarak ayrılabilir. Kromatin temel birim olarak nucleosome her çekirdek Histon H2A, H2B, H3 ve H4, DNA13147 baz çifti tarafından çevrili iki kopyasını içerir. Histon metilasyonu, asetilasyon, fosforilasyon, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, Deaminasyon ve prolin isomerization14,15tarafından son derece post-translationally değiştirilir. Histon lizin metilasyonu transkripsiyon, çoğaltma, Rekombinasyon16, DNA hasarı yanıt17ve genomik sürecinden18denetler en istikrarlı Histon değişiklik olarak kabul edilir. Lysines mono-, di- veya üç metillenmiş19 olması ve sadece erişilebilir Histon kuyrukları üzerinde aynı zamanda Histon20küresel etki alanı içinde görünür. H3K4 ve H3K36 belirli methylations euchromatin ile ilişkili, belirli methylations H3K9, H3K27 veya H4K20-esas olarak bulundu heterochromatic bölgelerde, her ne kadar tüm artıkları Histon kuyruk14içinde, yer alan 19,21. H3K79 metilasyonu Histon küresel etki alanı içinde yer alan ve transkripsiyon etkinlik, ama aynı zamanda transcriptionally etkisiz genomik bölgeleri22ile ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Maya, buzağı timus, tavuk ve insan23gözlenmiştir beri değişiklik örümceklerle korunmuş. H3K79 mono, di ve trimethylation (H3K79me1, me2, me3), Histon methyltransferases DOT1L24,25 ve26nükleer SET etki alanını içeren Protein 2 (Nsd2) tarafından katalize. DOT1L nükleer silahların yayılmasına karşı DNA tamiri ve27REPROGRAMING hücresel karıştığı. Dot1l kaybı farelerde çevresinde gelişimsel sahne E10.528,29doğum öncesi bir ölüme yol açar. Kalp Geliştirme sırasında ve myocardiocyte ayrımında DOT1L gen ifade Yönetmeliği30için esastır. Merkezi sinir sistemi DOT1L işlevi Nöral tüp geliştirme31' karıştığı, Tbr1bastırmak ilgilenmektedir-ön geliştirme32sırasında ifade ve ER-stres yönetmelikte çalışmayabilir Yanıt genler33. İçerik bağımlı etkinleştirme veya özellikle merkezi sinir sistemi gelişimi gibi vivo içinde durumlar ile H3K79me, bastırmak eylem için kısmen32anladım sadece tarihidir. H3K79 metilasyonu Histon 3 küresel etki alanında bulunduğundan, bu sterically daha az esnek Histon kuyrukları23değişiklikler ile karşılaştırıldığında erişilemez. H3K79 metilasyonu işlevini anlamak için güvenilir ve tekrarlanabilir analiz yöntemleri konumu ve genomik çevre belirlemek için gereklidir. Bu yöntemleri yazıda, biz izolasyon yöntemleri farklı sinirsel ataları (korteks için TBM'ler) ve CGNPs için beyincik, etkili DOT1L inhibitörü tedavisi ve bir çip yöntem H3K79 metilasyonu yolu ile qPCR ya da sıralama farklı zamanda analiz etmek için mevcut Puan kortikal ve serebellar geliştirme sırasında. Protokol ve olanakların genel bakış için bkz: şekil 1.

<table><tbody><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Antikor <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> İmmünoblot seyreltme 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Antikor <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> İmmünoblot seyreltme 1:3000</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Diagenode</td><td>pAb-051-050</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Antikor <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> ChIP antikoru</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Abcam</td><td>ab-051-050</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Antikor <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> İmmünoblot seyreltme 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-tavşan-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15410206</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Antikor <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> ChIP Ctrl antikoru</td></tr><tr><td>Anti-Tubulin alfa</td><td>Abcam</td><td>ab108629</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Antikor <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> İmmünoblot seyreltme 1:3000</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin (1 mg / ml)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>Kategori: Hücre kültürü Kısaltma/Yorum: CCM</td></tr><tr><td>B27 Eki için (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Kategori: Hücre kültürü Kısaltma/Yorum: CCM</td></tr><tr><td>Biyoanalizörü</td><td>Agilent teknolojileri</td><td>için G2940CA</td><td>Kategori: ChIP Kısaltma/Yorum: Kesilmiş kromatinin analizi için</td></tr><tr><td>Bioruptor NextGen</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Kategori: ChIP Kısaltma/Yorum: Ultrasonicator</td></tr><tr><td>Borik asit pH 8.4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Hücre kültürü <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> CPC kültürü için</td></tr><tr><td>CFX Connect RT PCR Tespit Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> ChIP Analizi <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> qPCR</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td> için algılama sistemi <td>11320-033</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Hücre kültürü <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> CGM</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10001D</td> için<td><güçlü>Kategori:</güçlü> ChIP <güçlü>kısaltma/Yorum:</güçlü> Manyetik boncuklar, ChIP</td></tr><tr><td>EPZ-5676</td><td>Selleckchem</td><td>S7062</td> <td>için<güçlü>Kategori:</güçlü> DOT1L inhibisyonu <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> Hücre kültüründe DOT1L inhibisyonu için</td></tr><tr><td>Etilendiamin tetraasetik asit</td><td>SERVA</td><td>39760.01</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> ChIP <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> EDTA</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu %10 (h/h)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Kategori: Hücre kültürü Kısaltma/Yorum: CPC izolasyonu ve CGM</td></tr><tr><td>Glucose için</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>Kategori: Hücre kültürü Kısaltma/Yorum: CGNP izolasyonu için</td></tr><tr><td>Glutatyon (1.25 mg / ml)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Hücre kültürü <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> CCM</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Carl Roth</td><td>3187</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> ChIP <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> Hücre fiksasyonu için</td></tr><tr><td>GoTaq mastermix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Kategori: ChIP Analizi Kısaltma/Yorum: qPCR Hank' için DNA polimeraz ana karışımı</td></tr><tr><td> s Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14025-100</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Hücre kültürü <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> HBSS</td></tr><tr><td>L-glutamin (200 mM)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030081</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Hücre kültürü <güçlü>kısaltma/Yorum:</güçlü> CCM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>içinL2020</td><td>Kategori: Hücre kültürü Kısaltma/Yorum:</td></tr><tr><td>Lityum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td>Kategori: ChIP Kısaltma/Yorum: LiCl</td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17502048</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Hücre kültürü <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> CGM</td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher</td><td>3300</td> için<td><güçlü>Kategori:</güçlü> ChIP <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> DNA miktar tayini için Florospektrometre</td></tr><tr><td>NEB Sonraki Ultra DNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645S</td> <td>içinKategori: ChIP Analizi Kısaltma/Yorum: Kütüphane hazırlama kiti</td></tr><tr>Illumina <td>NEB E7335</td> <td>için NEBNext Multipleks Oligos</td><td></td><td>Kategori: ChIP Analiz Kısaltma/Yorum: Kütüphane hazırlığı için oligolar</td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Hücre kültürü <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> CCM</td></tr><tr><td>NP-40 Alternatifi</td><td>için Calbiochem</td><td>492016</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> ChIP <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> ChIP tamponu</td></tr><tr><td>için Paraformaldehit</td><td>Carl Roth</td><td>335</td><td>Kategori: ChIP Kısaltma/Yorum: PFA, hücre fiksasyonu için</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin-Neomisin %1 (h/h)</td><td>Life Technologies</td><td>15640055</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Hücre kültürü <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> PSN, CCM ve CGM için</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu</td><td>su Life Technologies</td><td>10010023</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Hücre kültürü <güçlü>kısaltma/Yorum:</güçlü> PBS, TBM izolasyonu için</td></tr><tr><td>PicoGreen Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11496</td><td>Kategori:</güçlü> ChIP Analizi <güçlü>kısaltma/Yorum:</güçlü> DNA miktar tayini için boyanın görselleştirilmesi</td></tr><tr><td>Poli-D-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Hücre kültürü <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> CGNP izolasyonu için</td></tr><tr><td>Poli-L-ornitin hidrobromür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Hücre kültürü <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> TBM kültürü için</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9640G</td><td>Kategori: Cell culture Kısaltma/Yorum: KCl, CGM Proteaz</td></tr><tr><td>inhibitörü</td><td>Roche</td> için <td>4693159001</td><td>Kategori: ChIP Kısaltma/Yorum: ChIP</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td> <td>içinKategori: ChIP Kısaltma/Yorum: for ChIP</td></tr><tr><td>Qiagen MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Category: ChIP Kısaltma/Yorum: DNA saflaştırma kiti</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Kategori: ChIP Kısaltma/Yorum: ChIP</td></tr><tr><td>SGC0946</td><td>Selleckchem</td><td>S7079</td> için<td>Kategori:</güçlü> DOT1L inhibisyonu Kısaltma/Yorum: Hücre kültüründe DOT1L inhibisyonu için</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Carl Roth</td><td>8551.1</td><td>Kategori:</güçlü> ChIP <güçlü>Kısaltma/Yorum: Elution tamponu için</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> ChIP <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> NaCl, ChIP tamponu için</td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> ChIP <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> ChIP Sodyum için</td></tr><tr><td> dodesilsülfat</td><td>Carl Roth</td><td>183</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> ChIP <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> SDS, ChIP için</td></tr><tr><td>Sonic kirpi (SHH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP6004</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Hücre kültürü <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> CGNP izolasyonu için</td></tr><tr><td>Süperoksit dismutaz (1mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7571</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> Hücre kültürü <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> CCM</td></tr><tr><td>için Tris(hidroksimetil)aminometan</td><td>Carl Roth</td><td>9090</td><td><güçlü>Kategori:</güçlü> ChIP <güçlü>Kısaltma/Yorum:</güçlü> TRIS, ChIP tamponu için</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>X100</td><td>Kategori: ChIP Kısaltma/Yorum: ChIP tamponu için</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA %0,05 (w/v)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59417C</td><td>Kategori: Hücre kültürü Kısaltma/Yorum: CPC izolasyonu için</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Carl Roth</td><td>28320</td><td>Kategori: ChIP Kısaltma/Yorum: Boncuk hazırlama için</td></tr><tr><td>Diğer Lab cihazları: Neubauer sayma odası, İnkübatör, Döndürücü, Çalkalayıcı, Diseksiyon seti, Su banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCM: Kortikal hücre ortamı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CGM: CGNP hücre kültürü ortamı</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yalıtım ve sinirsel ataları kromatin-immunoprecipitation histon 3 lizin 79 dimethylation mark tarafından takip tarımı

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Beyin gelişimi temporo-kayma bir şekilde morfojenlerdeki ve farklı transkripsiyon programları gradyanlar tarafından kontrol edilir karmaşık bir süreçtir. Ayrıca, gibi Histon metilasyonu, epigenetik Kromatin değişiklikler kurulması ve belirli hücre kaderi bu işlemde sürdürmek için önemli bir role sahiptir. Histon metilasyonu büyük çoğunluğu Histon değiştiriciler, silgi ve Histon okuyucu proteinlerin erişilebilen esnek Histon kuyruk üzerinde oluşur. Buna ek olarak, H3K79 metilasyonu Histon 3 küresel etki alanında bulunan ve farklı gelişim işlevlerinde karıştığı. H3K79 metilasyonu örümceklerle korunmuş ve türlerin geniş bir Homo sapiens Saccharomyces cerevisiaeiçin bulunabilir. Farklı hücre popülasyonlarının sinirsel ataları da dahil içinde değişiklik oluşur. Histon 3 küresel etki alanında H3K79 metilasyonu konumunu değerlendirmek zorlaştırır. Burada, biz izole etmek için yöntemler mevcut ve embriyonik kortikal beyin dokusu (E11.5-E14.5) veya serebellar taneli nöron ataları (CGNPs) Doğum sonrası doku (P5-P7) ve verimli bir şekilde immunoprecipitate (TBM) kültür kortikal progenitör hücre Kantitatif PCR (qPCR) ve genom çapındaki sıralama için H3K79me2.

Nöral progenitör yalıtım, ekimi, H3K79me2 ChIP ve çipi analiz yöntemleri genel düzeni: H3K79me2 çip kortikal progenitör hücre embriyonik beyin gelişimi sırasında farklı zaman noktalarda veya serebellar taneli nöron ataları, postnatal aşamalarında gerçekleştirmek için bir akış şeması şekil 1 gösterir. Bir ilk adım olarak beyin izole olmak zorunda ve telencephalon (E11.5-E14.5 arası) veya beyincik (P5-P7) alınması gerekir. DT ve VT. bölerek tel...

Biz yalıtmak ve nöral progenitör hücreler embriyonik ve postnatal beyin dokusundan Kromatin immunoprecipitation (ChIP) Histon 3 lizin 79 dimethylation (H3K79me2) - içinde yer alan bir Histon işareti için kültür için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem mevcut Histon 3 küresel etki alanı.

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Bu prosedürün genel amacı, beyin gelişimi sırasında, özellikle serebral korteks ve beyincikte epigenetik değişiklikleri analiz etmektir. Bu yöntem, H3K79 metilasyonu gibi histon modifikasyonlarının kortikal ve serebellar tabakalaşmanın gelişimini nasıl etkileyebileceği gibi nörobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, belirli gelişimsel zaman noktalarında farklı beyin bölgelerinde, lokusa özgü veya genom çapında histon modifikasyonlarını in vivo olarak inceleyebilmemizdir.P5'ten P7'ye kadar olan beyinler ve MRI fareleri ile başlayın. Tüm meninksleri ve kan damarlarını çıkarın. Daha sonra çip başına üç ila beş serebellayı 15 mililitrelik tüplere aktarın.Santrifüjlemeden önce serebelları HBSS glikozu ile yıkayın. Dokuyu toplamak için tüpleri santrifüjleyin. Son yıkamadan sonra, parçalar 0,5 ila bir küp milimetre boyutunda olana kadar bir mililitrelik pipetle iki ila üç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek serebellayı homojenize edin.2,5 mililitre kalana kadar tüm sıvıyı yavaşça çıkarın. Daha sonra serebella içeren HBSS glikozu ile tüpe% 0.05 tripsin ekleyin. Ve dokuyu 37 santigrat derece su banyosunda 15 dakika inkübe edin.Dokuyu her bir ila üç dakikada bir ters çevirin. İnkübasyonun ardından, beş mililitre CGNP hücre kültürü ortamı veya CGM ekleyerek sindirimi durdurun ve dokuyu daha önce olduğu gibi santrifüjleme ile toplayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve bir mililitre CGM ekleyin.Hava kabarcıklarının oluşumunu önleyerek dokuyu bir mililitrelik pipet ucuyla ezin. Daha sonra beş mililitre CGM ekleyin ve doku kalıntılarını yerleştirmek için karışımı buz üzerinde iki dakika inkübe edin. Doku yerleştikten sonra, süpernatanı 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.Daha sonra artık dokuya iki mililitre CGM ekleyin ve süpernatanı hasat etmeden ve doku kalıntılarını atmadan önce öğütme prosedürünü tekrarlayın. Her 15 mililitrelik doku tüpünden süpernatanları toplayın ve serebellar hücreleri toplamak için santrifüjleyin. Peleti 10 mililitre CGM'de yeniden süspanse edin.Astrositler, poli-D-lizine CGNP'lerden daha hızlı ve daha güçlü yapıştığından, poli-D-lizin kaplı 6 oyuklu plakaların kuyucuklarına dört mililitreye kadar hücre süspansiyonu ekleyin ve astrositleri çıkarmak için 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Plakayı sallayın, süpernatanı 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve ardından süpernatanı daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Peletleri 10 mililitre CGM'de yeniden süspanse edin ve hücreleri bir Neubauer sayma odası ile sayın.Dört ila altı saat sonra, yapışan CGNP'ler yuvarlak görünür ve proliferatif olur. Hücreleri CGM'de poli-L-ornitin kaplı plakalara tohumlayın ve 37 santigrat derece, %5 CO2 ve %100 bağıl nemde inkübe edin. Bir gün in vitro veya DIV1'den sonra, çoğu CGNP yuvarlaktır ve çoğalır.Bazı CGNP'ler farklılaşmaya başlayacak ve nöronal çıkıntıların büyümesine başlayacaktır. Kültürlenmiş hücreleri sabitlemek için, CGNP içeren kuyucuklara doğrudan bir mililitreye kadar% 1 PFA ekleyin. 22 santigrat derecede beş dakikalık bir inkübasyondan sonra, 53 mikrolitre glisin ekleyin ve üç mililitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.Hücreleri bir mililitre PBS'de hasat etmek için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücreleri 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve 1.000 g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, proteaz inhibitörü içeren 700 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve numuneleri dört santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.Bu süre zarfında numuneleri her beş dakikada bir vorteksleyin. İnkübasyonun ardından, hacmin tüp başına 400 mikrolitreyi geçmemesini sağlamak için numune tüplerini bölün. Daha sonra, lyse hücrelerinin kromatinini kesmek için maksimum güçte 10 dakika boyunca sonikat yapın.10 dakika sonra, örnekleri girdaplayın ve ardından sonikasyonu ve girdabı iki kez daha tekrarlayın. DAPI kullanarak bir faz kontrast mikroskobu veya floresan mikroskobu ile kalan çekirdekler için lizatı kontrol edin. Hücre kalıntılarını 13.000 g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyerek peletleyin.Bittiğinde, ön temizleme adımı için süpernatanı kullanın. Numuneleri önceden temizlemek için önce numune başına 20 mikro litre konjuge olmayan manyetik boncukları buz gibi soğuk PBS Tween'de yıkayın. Manyetik bir stand yardımıyla yıkamaları çıkarın.Daha sonra, ön temizleme için her numuneye 600 mikrolitre seyreltme tamponu ve 20 mikrolitre yıkanmış manyetik boncuk ekleyin ve bir döndürücü üzerinde dört santigrat derecede iki saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, manyetik bir stand kullanarak boncukları çıkarın. Daha sonra her bir lizatın% 5'ini giriş numunesi olarak alın ve eksi 20 santigrat derecede dondurun.Numuneler önceden temizlenirken antikor eşleşmesi gerçekleştirilebilir. Çip başına 45 mikrolitre Protein A Manyetik Boncuk'u daha önce olduğu gibi buz gibi PBS Tween ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, boncuklara bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin.Daha sonra 45 mikrolitre boncuk başına üç mikrogram antikor ekleyin. Antikorları boncuklara bağlamak için bir döndürücü üzerinde dört santigrat derecede iki saat inkübe edin. Kuluçka süresi geçtiğinde, yıkanmış antikora bağlı boncukları buz gibi soğuk PBS'nin bir boncuk hacminde yeniden süspanse edin.Önceden temizlenmiş her bir ekstraktı yaklaşık 643,5 mikrolitrelik iki tüpe bölün. Aynı hacimde seyreltme tamponu ve antikora bağlı boncuklar ekleyin ve numuneleri bir döndürücü üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, boncukları buz gibi soğuk talaş tamponları ile her biri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede bir döndürücüde yıkayın, ardından TE tamponu ile beş dakikalık üç yıkama yapın.Elüsyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 1.400 RPM'de bir saat seyreltin. Bir saat geçtikten sonra, her çip örneğine 10 mikrogram Rnase ve giriş örneklerine beş mikrogram ekleyin. Numuneleri çalkalayıcı üzerinde 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.Son olarak, çip numunesi başına 100 mikrogram Proteinaz K ve giriş başına 50 mikrogram ekleyin. Gece boyunca 65 santigrat derecede 1.400 RPM'de inkübe edin. H3K79 dimetilasyon seviyeleri, üç günlük CPC kültürü ve SGC 0946 ile DOT1L inhibisyonundan sonra azalır.Çip analizinden sonra QCPR, başlangıçta yüksek histon-3-lizin-79 metilasyon seviyelerine sahip genlerin inhibitör tedavisine en duyarlı olduğunu ortaya koydu. Daha düşük H3K79 dimetilasyon kapsamına sahip genler, metilasyon seviyelerinde önemli bir değişiklik göstermedi. Bu ısı haritası, histon-3-lizin-79 metilasyon seviyelerinin transkripsiyon başlangıç bölgesi etrafında zirve yaptığını ve transkripsiyon bitiş bölgesine doğru azaldığını göstermektedir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık bir hafta içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, izole beyin hücrelerinde histon modifikasyonları üzerinde kromatin immünopresipitasyonunun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

isolation-cultivation-neural-progenitors-followed-chromatin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Beyin dokusunda hücresel heterojenite testlerin çoğu tek hücreli çözünürlük eksikliği nedeniyle kromatin epigenetik işaretlerin çalışma için önemli bir sınırlama teşkil etmektedir. Nöronlar genellikle glia ve diğer non-nöronal hücreler ile iç içe. Biz özü ve insan beyninin nöron çekirdekleri toplamak için bir protokol sağlar.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon

Burada, üç boyutlu (3D) kültür üretmek genişletmek ve immunolabel postnatal hipokampal nöral progenitör hücrelerin (NPC) nasıl açıklar. Sonra, hibrid görselleştirme teknolojiler kullanılarak, dijital görüntüler immunolabelled cryosections tüm 3D neurosphere boyunca immünopozitif hücreler mekansal konumunu yeniden ve harita için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

3D Nöral Kök Hücre Kültürü yerelleştirme Protein: Hybrid Görselleştirme Metodolojisi

Bu protokol hücreleri izleyebilirsiniz özel tasarımlı electrotactic odalarında 2D ve 3D ortamlar oluşturmak için kullanılan yöntemler,...

2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç

Nöral tüpten embriyonik nöral krest izolasyonu kullanımını...

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

Bu video, yetişkin insan fibroblastlarından türetilen indüklenmiş nöral progenitör hücreleri (iNPC'ler) izole etmek için bir tekniği göstermektedir. iNPC kolonilerinin izole edilmesi ve iNPC popülasyonunun sürekli çoğalmasını ve genişlemesini kolaylaştıran uygun kültür ortamının varlığında laminin kaplı çok kuyulu plaka kuyularında kültürlenmesi ile ilgili adımları ana hatlarıyla belirtir.

Yetişkin İnsan Fibroblastlarından Türetilen İndüklenmiş Nöral Progenitör Hücre Kolonilerinin İzole Edilmesi

Bu video, bir fare yavrusunun beyinciğinden serebellar nöral progenitör hücrelerin izolasyonunu ve yetiştirilmesini göstermektedir. Serebellar granül nöron progenitörleri, astrositleri etkili bir şekilde uzaklaştırarak diferansiyel adezyon yoluyla izole edilir ve saflaştırılır. Bu kültürlenmiş progenitörler daha sonra serebellar granül nöronlarına farklılaşır.

Murin serebellar granüler nöron progenitörlerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi

Kaynak: Mendez, F. M.  et al., Murin Beyin Tümörü Nörosferleri Kullanılarak Doğal Kromatin İmmünopresipitasyonu. J. Vis. Uzm. (2018). Bu video, doğal kromatin immünopresipitasyonu kullanılarak bir fare beyin tümöründen türetilen nörosfer hücrelerinden protein-DNA komplekslerinin izolasyonunu göstermektedir. Aşağı akış analizi için DNA'yı serbest bırakmak için kromatin hazırlama, immünopresipitasyon, yıkama ve protein sindirimi adımlarını detaylandırır.

Nörosfer Hücrelerinin Doğal Kromatin İmmünopresipitasyonu

Farklılaşmış insan nöral kök hücreleri (hNSC'ler) üzerindeki miRNA'lardaki değişiklikleri karakterize etmek amacıyla, üç boyutlu bir sistemde hNSC farklılaşmasını, miRNA PCR dizisi ile mikroRNA ekspresyonundaki değişikliklerin değerlendirilmesini ve miRNA hedef tahmini için hesaplamalı analizi ve ikili lusiferaz testi ile doğrulanmasını açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Epigenetik mekanizmalar sık tümörü değişmiş. Kromatin immunoprecipitation Kromatin yapısı ve gen transkripsiyonu düzenleyen Histon modifikasyonlar değişimler sonucu genetik değişiklikler gliyom içinde sonuçlarını incelemek için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı yerel Kromatin immunoprecipitation fare Beyin tümör neurospheres üzerinde açıklar.

Fare Beyin tümör Neurospheres kullanarak yerel Kromatin Immunoprecipitation

Biz tandem kromatin için adım adım bir protokol tarif immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) hücre türüne özgü genom çapında histon değişiklik çözümleme sağlar.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Keşfedin kromatin immunoprecipitation yöntemiyle H3K79me2 epigenetik modifikasyonlarını analiz etmeyi. Bu teknik, embriyonik ve postnatal beyin dokusundan izole edilen sinir progenitör hücrelerinde histon modifikasyonlarını incelemeyi sağlar.

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Daha fazla video keşfet