Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.

Bu prosedürün genel amacı, geçici bir ekspresyon sistemindeki protein-protein etkileşimlerini kantitatif olarak tespit etmektir. Bu ölçüm, kimyasal veya çevresel bir işlemden sonra protein protein yönümüzü kantitatif olarak nasıl izleyeceğimiz gibi kuan sinyali işlem alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, sonuçların daha doğru olması için protein protein yönü yoğunluğunu temsil eden berrak aktiviteyi tespit etmek için bir luminometre veya bir CCD kamera kullanmasıdır.

Bu işleme başlamak için, tohum içeren bir nokta beş mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yüzde beş sodyum hipoklorit ve sıfır nokta yüzde bir triton x yüz içeren bir çözelti ekleyin. Tohumları sterilize etmek için çözeltiyi beş dakika dinlendirin. Daha sonra tohumları beş kez steril suyla yıkayın.

Yıkanmış tohumları iki yüz mikrolitre steril suda bekletin. İnce uçlar kullanarak, tek tek tohumları kaplanmış MS agar ortamının yüzeyine dikkatlice yerleştirin. Çimlenmeyi senkronize etmek için plakaları üç gün boyunca dört santigrat derecede saklayın.

Bundan sonra, orta plakaları on gün boyunca normal büyüme koşulları altında tutun. Çimlenen fideleri köklere zarar vermemeye dikkat ederek toprağa aktarın. Nemi korumak için tepsiyi gece boyunca şeffaf plastik bir kapakla örtün.

Bitkileri, agrobacterium tumefaciens sızmasına hazır olacakları yedi hafta boyunca kontrollü bir yetiştirme odasında yetiştirin. Başlamak için, a-tumefaciens yetkin hücre suşu GV3101'e yüz elli nanogram plazmit verin. A-tumefaciens kültürünü içeren tüpleri bir çalkalayıcıya yerleştirin ve dört saat inkübe edin.

Bir cam çubuk kullanarak, kültürü tüplerden LB ortamlarına aktarın. Dört gün boyunca 28 santigrat derecede kültür a-tumefaciens ve LB agar ortamı. Daha sonra, her plakadan tek bir a-tumefaciens kolonisini üç mililitre LB sıvı ortam içeren kendi tüpüne aşılamaya hazırlanın.

Kültürü yaymak için 24 saat boyunca 280 santigrat derecede 280 RBM'de çalkalayın. Daha sonra, 75 mikrolitre bakteri kültürünü, mililitre kanamisin başına 15 mikrogram ve mililitre rifampisin başına 50 mikrogram içeren 15 mililitre taze LB sıvı ortama aktarın. Bakterileri 220 RPM'de 30 santigrat derecede 8 saat boyunca OD600 0.5 ila 1 arasında olana kadar kültürleyin.

Bundan sonra, kültürü 15 mililitre santrifüj tüplerine aktarın. 15 dakika boyunca 4000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve paleti 15 mililitre dönüşüm çözeltisinde yeniden süspanse edin.

15 dakika boyunca 4000 kez yerçekimi ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Ardından, süspansiyon ve santrifüjleme adımını bir kez daha tekrarlayın. Süpernatanı atın ve paleti 5 mililitre dönüşüm çözeltisinde yeniden süspanse edin.

Yeniden askıya alınan paleti karanlık koşullarda oda sıcaklığında iki saat dinlendirin. Daha sonra, ya OD600'e 0.5'e dönüşüm çözeltisi ekleyin ya da eşleştirilmiş protein etkileşimlerini test etmek için iki numuneyi eşit hacimde birleştirin. Bir mililitrelik bir şırınga iğnesi kullanarak, asılı hücreleri dördüncü ila yedinci yapraklara sızdırın.

Bundan sonra, bitkileri hemen 12 saat boyunca siyah plastik bir örtü ile örtün. İlk olarak, başarıyı sağlamak için bitkilerin çok sağlıklı olması gerekir. İkinci olarak, sızma işlemi sırasında herhangi bir yaprağa zarar vermediğinizden emin olun.

Tepsiyi 12 saat karanlıkta tutun. Daha sonra, lusiferaz aktivitesini tespit etmeden önce bitkileri normal koşullar altında 2 ila 4 gün büyütün. Görüntüleme yöntemine başlamak için, sızmış bir yaprağı ayırın.

Tüm broşürü MS agar besiyeri içeren bir tabağa yerleştirin. 50 mililitrelik bir sprey şişesi kullanarak, yaprakların adaksiyal tarafına luciferon çalışma tamponu püskürtün. Ardından, klorofil otofloresansını söndürmek için 5 dakika karanlıkta tutun.

50 milisaniyelik ışıkla dolu pozlama süresi ve 1 dakikalık lüminesans algılama süresi ile görüntüler yakalamak için eksi 30 santigrat dereceye soğutulmuş daha düşük ışık soğutmalı bir CCD hayal cihazı kullanın. Bundan sonra, N-benthamiana yapraklarının sızma alanından yaprak parçalarını kesin. Parçaları, 96 oyuklu beyaz plakanın kuyucuklarında 100 mikrolitre deiyonize suya batırın.

On mikrolitre luciferon çalışma tamponu ekleyin. Plakayı 5 dakika dinlendirin. Ardından, protein etkileşim dinamiklerini incelemek için istenen herhangi bir özel tedaviyi gerçekleştirin ve lüminesansı doğrudan ticari bir luminometre ile ölçün.

Burada, COP 1 SPA 1 etkileşimlerini temsil eden berrak aktivitenin gösterimi gösterilmektedir. Lüminesans ile tespit edilen lusifer aktivitesi, CCD kamera ile görüntülenir. COP 1 SPA 1 etkileşimlerinin fonksiyonel lusiferazın bakır mutasyonu ile sonuçlandığı görülmektedir.

Jasmine 8 tedavisi altında zaman içinde lusiferaz aktivitesi daha sonra belirlenir. Lusiferaz aktivitesi ile temsil edilen COP 1 SPA 1 etkileşimlerinin karanlıkta kademeli olarak azaldığı görülmektedir. Yasemin 8 ile tedavi bu etkileşimleri daha da azaltır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa bitkiler hazır olduktan sonra 1 hafta içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, sağlıklı bitkileri korumayı unutmamak önemlidir. Yaprakları dikkatlice sızın ve kontrolleri uygun şekilde dahil edin.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, sinyal işlemleri alanındaki araştırmacıların protein protein etkileşim dinamiklerini hızlı bir şekilde keşfetmelerinin önünü açıyor. Bu videoyu izledikten sonra, tütün bitkilerinin nasıl yetiştirileceğini, agrobakterilerin tütün yapraklarına nasıl sızacağını ve tuzlu aktivitelerin nasıl tespit edileceğini iyi anlamış olmalısınız.