Name: Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Öğrenin Nicotiana benthamiana yapraklarında lusiferaz tamamlayıcı görüntüleme yöntemiyle protein-protein etkileşimlerini nicel olarak tespit etmeyi. Bu hızlı teknik, sinyal iletimi araştırmalarında etkileşim dinamiklerini güvenilir şekilde ölçmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Jiangsu eyaleti doğal Bilim Vakfı (BK20140919), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31470375), öncelik akademik Program Geliştirme, Jiangsu yükseköğretim kurumları ve Qing Lan proje tarafından desteklenmiştir.

1. bitki (8 hafta) hazırlanması
<ol><li>%5 NaClO ve % 0.1 Triton X-100 (V/V) çözüm ve bırak tohumlar sterilize etmek 5 min için 1 mL içeren bir 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 50 Nicotiana benthamiana tohum koymak.</li>
	<li>5 kez tohum steril su ile durulayın ve tohum steril su 200 µL içinde askıya alma.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde yer bireysel tohum ince ipuçları ve çimlenme eşitlemek 3 gün boyunca 4 ° C'de mağaza orta plakaları ile MS-agar orta (1 l (KOH), 1 x Murashige & Skoog tuzları, 10 g Sükroz, pH %5,8 1 agar) yüzeyinin. Not: mikrop kirlenmesini önlemek için temiz bir bankta bu adımı gerçekleştirin. Tüp sterilizasyon sırasında sallamak gerekli değildir.</li>
	<li>Koşullarda normal büyüme (22 ° C, 80-90 µmolm-2s-1 beyaz ışık şiddeti) 10 gün için orta plakaları yerleştirin ve ardından toprağa germinated fidan aktarın. Not: fide kökleri toprağa taktığınızdan emin olun ve kökleri zarar vermeyen. Tepsiyi nem korumak için bir şeffaf plastik kapak ile gecede kapsayacak.</li>
	<li>16 h/8 h açık/koyu döngüsü ve % 70 nem kontrollü büyüme odasındabir bitkiler büyümek. 7-hafta-yaşlı i. benthamiana bitkiler Agrobacteriumtumefaciens infiltrasyon (şekil 1A) için hazır. Not: bitkilerin su ve bitkiler sağlıklı tutmak için gerektiği gibi zararlıları kontrol edin.</li>
</ol>2. geçici ifade İ. Benthamiana yaprakları (7-10 gün)
<ol><li>Plazmid teslim 150 ng (pEGAD-HA-LUC denetim plazmid, boş vektör ve inşa plazmid LCI için tahlil, bu durumda biz pCAMBIA1300-Nluc ve pCAMBIA1300-Cluc plazmid yapımı için kullanılan) A. tumefaciens yetkili hücreye GV3101 ile zorlanma bir Standart elektroporasyon yöntemi.</li>
	<li>Kültür A. tumefaciens Luria-Bertani (LB) agar orta (1 l 10 g NaCl, 5 g maya ekstresi, 10 g tryptone, %1,5 agar) içeren 50 µg/mL sefaloridin ve Rifampisin 28 ° c 4 gün için 50 µg/mL. Not: Vektör ve kullanılan A. tumefaciens zorlanma antibiyotik seçimi bağlıdır.</li>
	<li>Bir aşılamak her plaka A. tumefaciens koloni 3 mL LB sıvı orta sefaloridin 50 µg/mL ve 50 µg/mL Rifampisin içeren tek ve 28 ° c hücre kültürü yaymak 24 h için 220 rpm'de sallamak.</li>
	<li>Bakteriyel kültürünün 75 µL 15 mL taze LB sıvı sefaloridin 50 µg/mL ve 50 µg/mL Rifampisin, 200 katına sulandrarak içeren orta içine aktarın. OD600 0.5-1.0 arasında olana bakteri için 8 h hakkında 30 ° C'de 220 rpm'de kültür.</li>
	<li>15 mL santrifüj tüpleri A. tumefaciens sıvı kültüründe aktarmak ve 4.000 x g ve 4 ° C'de 15 dakika atma süpernatant süreyle santrifüj kapasitesi ve pelet pelet yıkamak için dönüştürme çözüm 15 mL askıya alma.</li>
	<li>4000 x g ve 4 ° C'de 15 dakika tüp spin ve süpernatant atın. Bir kez daha çamaşır adımı yineleyin.</li>
	<li>Pelet 5 mL dönüştürme çözüm resuspend ve 2 h için oda sıcaklığında tutmak. OD600 son konsantrasyonu 0.5 veya karışımı iki örnek ile eşit birim test eşleştirilmiş protein etkileşimleri için olana A. tumefaciens Pelet hücreleri dönüştürme çözüm ile yoğunluğunu ayarlayın.</li>
	<li>Askıya infiltrat hücreleri içine 7 4th th 1 mL needleless şırınga (şekil 1B-C) bırakır. İnfiltrasyon sonra bitkiler hemen ile siyah bir plastik kapak kapak ve karanlık 12 h için belgili tanımlık tepsi yer. Bundan sonra 2-4 gün önce LUC faaliyetleri tespit için her zamanki bitkiler büyümek. Not: sağlıklı yaprakları benzer boyutu seçin. Bir yaprak dört farklı dilimlerinde infiltrasyonu yolunda.</li>
</ol>3. Luciferase etkinlik (bir gün) tespit
Not: Luciferase etkinliğini izlemek için iki yol vardır. Bir görüntüleme üzerinde temel alır ve diğer kantitatif luciferase etkinliğini ölçmek etmektir.
<ol><li>
Görüntüleme yöntemi
	<ol>
<li>İnfiltre bir yaprak bağlantısını kesin ve tüm broşür MS-agar orta koymak.</li>
		<li>Biyoluminesans çalışma arabellek yaprak adaxial yüzeyine 50 mL sprey şişe sprey. Malzemeler klorofil otomatik Floresans gidermek 5 min için anlatmamanı.</li>
		<li>Esir alma imge (Şekil 2) için aparatı (-30 ° C-soğutmalı) görüntüleme bir düşük ışık soğutmalı CCD kullanın. Işık under çekim hızı 50 ms ve ışıldama algılama zaman 1 dak. Not: makine kılavuzuna göre parametrelerini ayarlamak. Düşük sıcaklıklar görüntü kalitesini artırmak için sinyal-gürültü oranı artıracaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternatif olarak, bir ticari luminometer ile doğrudan ışıldama ölçmek.<ol>
<li>Dikkatle i. benthamiana yaprakların infiltrasyon alanından (yaklaşık 0.25 cm2) yaprak parçaları kesip ve yaprak disk 100 µL 96-şey beyaz plaka (şekil 3) deiyonize su içine bırakın.</li>
		<li>Biyoluminesans çalışma arabelleği 10 µL eklenir ve 5 min için bırakılır. Sonra protein etkileşim dynamics çalışmaya spesifik tedaviler gerçekleştirin. Not: bir luminometer protein-protein etkileşimleri belirli tedavi altında Kinetik temsil luciferase aktivite dynamics elde etmek için farklı zaman noktalarda ile ışıldama algılamak. Bu yöntem çok sayıda protein çiftleri aynı anda test etmek için avantajları vardır. Bu bir ticari luminometer olmadan luciferase protein miktar tarafından western blot incelemek, bu nedenle LUC aktivite quantitively bakın. Işık mutlaka gerekli değildir, sadece plaka luminometer içinde tutmak ve farklı zaman noktalarda ışıldama ölçmek. Aksi takdirde, plaka algılama boşluk sırasında bir büyüme odasına taşımak. İstatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için en az üç biyolojik çoğaltır kullanın. LUC faaliyetleri farklı infiltrasyon bölgelerdeki değişir de, onların değişen desenler normalleştirme sonra tutarlı vardır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF%28COI1%29+complex+during+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li>
<li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li>
<li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li>
<li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li>
<li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li>
<li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li>
<li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li>
<li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+repression+of+photomorphogenesis%3A+role+switching+of+COP%2FDET%2FFUS+in+light+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li>
<li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li>
<li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li>
<li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan basit ve in vivo protein-protein etkileşimleri çalışmak için tekrarlanabilir ve protein etkileşim dynamics eksojen tedavi altında tespit için özellikle uygun protokolüdür. Bu tahlil anahtar i. benthamiana infiltrasyon adımdır. İnfiltrasyon başarılı olmasını sağlamak için bitkiler çok sağlıklı olması gerekir. Bir başka önemli faktör luciferase aktivite infiltrasyon sonra kontrol etmek ne zaman olacağı. Doğru cevap bu soru için vardır. Araştırmacılar farklı gün sonra saat<sup class="xref"...

Büyüme çevresi ile koordine etmek için bitkiler hissediyorum, transduce ve sinyal yardımlar için yanıt vermek için zarif sinyal yolları gelişmiştir. Bir bayrak yarışı kaçakçıları gibi bitki sinyal iletimi gerekli oyuncu proteinlerdir. Bu yaygın olarak protein-protein etkileşim (PPI) hücresel iletişim için önemli bir rol oynar kabul edilmiştir. Protein fosforilasyon, asetilasyon ve yıkımı tüm hedef protein ve onun değiştirme enzimler arasında fiziksel etkileşim bağlıdır. Örneğin, Jasmonate ZIM-etki alanı protein (JAZ) aile proteinler transkripsiyon faktörü MYC2 ile etkileşim ve onun transkripsiyon etkinlik1,2bastırmak. ÜFE önemi göz önüne alındığında, büyük ölçekli protein interactomes tesislerinde olmuştur son zamanlarda3,4,5araştırdı. Bu interactome sonuçlar daha da çeşitli hücresel fonksiyonları koordinatları karmaşık düzenleyici ağ ortaya koyuyor.
ÜFE izlemek için kurulan bir yaklaşım vardır. Maya iki hibrid (Y2H) tahlil PPI algılama için en çok kullanılan yöntemdir. Y2H yapmak kolay ve protein etkileşimlerini incelemek hızlı bir test için uygundur. Y2H bilinmeyen etkileşim ortakları belirli protein-in-faiz için eleme için de yaygın olarak kullanılır. Y2H tamamen Maya gerçekleştirilir çünkü ancak, bu gerçek senaryo bitki hücreleri ve yüksek yanlış pozitif oranları getiriyor yansıtmak değil. Başka bir strateji açılan tahlil olduğunu. Genel olarak, iki protein ifade edilen Escherichia coli hücrelerden saf ve karışık ve protein etkileşimleri algılamak için immobilize. Bu yöntem zaman alıcı olmasa da, bu vivo içinde etkileşim sonuçları da elde edemiyor. Vivo etkileşim, co-immunoprecipitation (co-IP) yüksek kalite antikor immunoprecipitate protein ilgi gerektirir ve dolaylı PPIs olasılığı dışlayamazsınız en popüler tahlil amaçlıdır. Ayrıca, co-IP karmaşık deneysel prosedürler nedeniyle sonuçlar genellikle bireysel uzmanlığı ile farklı.
Muhabir dayalı sulandırma deneyleri büyük ölçüde vivo içinde PPI tespiti ilerlemek. Bu yöntemler Floresans rezonans enerji transferi (FRET)6, bimolecular floresan uluslara (BiFC)7ve (LCI) tahlil8Imaging ateş böceği luciferase uluslara içerir. Bu üç yaklaşım olmasına rağmen daha iyi co-IP doğrudan vivo içinde yansıtmak için PPI, perde ve BiFC floresan sinyallerini algılamak için özel mikroskoplar gerekir ve kolayca etkileşim yoğunluğunu ölçmek olamaz. Buna ek olarak, LCI, substrat biyoluminesans ile tepki sonra parlayan ateş böceği luciferase yararlanır. Daha da önemlisi, ÜFE yoğunluk luciferase aktivite değerinden belirlenebilir. Böylece, LCI sadece iki protein etkileşim veya değil, ancak aynı zamanda tedavi üzerine etkileşim dinamikleri hakkında bilgiler sağlar olup olmadığını gösterir. Etkileşim (yüzey plasmon rezonans veya termo-istikrar vardiyalara göre) dynamics9,10, izlemek için kurulan bir yöntem olmakla bu yaklaşımlar hassas aletler veya belirli etiketleme gerektirir. Buna ek olarak, LCI gerçekleştirmek ve bulmak kolaydır.
LCI prensip luciferase (N-Luc veya C-Luc, sırasıyla adlı) amino-terminal ve karboksil-terminal yarısı bu protein A ve B ve proteinlerin aynı anda bitki hücrelerinde ifade bu iki füzyon ile erimiş. Protein A protein B ile etkileşim, luciferase iki yarısı bir etkin luciferase enzim olmak yeniden. Luciferase faaliyet luminometer veya CCD kamera ile tespit edilebilir. LCI için kararlı transformants elde etmek gerekli değildir; geçici ifade bir yüksek kaliteli etkileşim sonuç almak için yeterlidir.
HALKA tipi E3 Ubikuitin ligaz bünye photomorphogenic 1 (COP1) transkripsiyon faktörleri sayısız ile etkileşim ve onların bozulması-26S proteasome11teşvik etmektedir. Bu COP1 hedefli transkripsiyon faktörlerin bazıları olumlu düzenleyiciler, photomorphogenesis için. Karanlıkta, COP1 phytochrome A-105 1 (SPA1), COP1 E3 etkinlik8artırır bastırıcı ile etkileşime girer. Sonra algı ışık photoreceptors COP1 etkinliği inhibe ve COP1 yüzeylerde12,13,14stabilize etmek üzere COP1-SPA1 etkileşimi iptal etmek. Bu örnek eğitimi PPI ve ÜFE dynamics belirleme biyolojik önemi gösterir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Dönüşüm çözeltisi</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Morfolineetansülfonik asit</td><td>VETEC</td><td>V900336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27.8 mM Glikoz</td><td>VETEC</td><td>V900392</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl2&times; 6H2O</span</td><td>>VETEC</td><td>V900020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu; M Asetosiringon</td><td>ALDRICH</td><td>D134406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pH 5.7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Luciferin çalışma tamponu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM Luciferin potasyum tuzu</td><td>ALTIN BİYOTEKNOLOJİ</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>%0.025 Triton X-100</td><td>VETEC</td><td>V900502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>H2O - 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

luciferase tamamlayıcı imaging tahlil nicotiana benthamiana yaprakları protein-protein etkileşim dynamics geçici belirlenmesi için

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein etkileşimleri sinyal iletimi en hücresel süreçler içinde geçişi için temel mekanizmaları vardır; Bu nedenle, kimliği roman protein-protein etkileşim çiftleri ve protein etkileşim dynamics izleme nasıl bitkiler çevresel faktörler ve/veya gelişimsel sinyalleri yanıt ifşa için özel ilgi vardır. Yaklaşımlar bir bolluk içinde vitro veya vivo içindeprotein-protein etkileşimlerini incelemek için geliştirilmiştir. Bunlar arasında Imaging (LCI) yeni kurulan luciferase uluslara tahlil vivo içinde protein-protein etkileşimleri gösteren için en basit ve en hızlı yöntemdir. Bu tahlil, protein A veya protein B luciferase, amino-terminal veya karboksil-terminal yarısı ile sırasıyla eritilmiş olan. Protein A protein B ile etkileşim kurduğunda, luciferase iki yarısı fonksiyonel ve aktif luciferase enzim oluşturmak için yeniden. Luciferase faaliyet luminometer veya CCD kamera ile kaydedilebilir. Diğer yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, LCI tahlil hem nitelik hem de nicelik protein-protein etkileşimleri gösterir. Agrobacterium infiltrasyon Nicotiana benthamiana yaprakları geçici protein ifade için yaygın olarak kullanılan bir sistemdir. LCI ve geçici ifade kombinasyonu ile COP1 ve SPA1 arasındaki fiziksel etkileşimi jasmonate tedaviden sonra yavaş yavaş düşürülmüştür bu yaklaşımlar göster.

Üç büyük adım protein-protein etkileşimleri vivobitki büyüme, tütün infiltrasyon ve luciferase tahlil de dahil olmak üzere, eğitim için bu luciferase uluslara protokolündeki saydı. Bu iletişim kuralı en önemli adımda sıvı A. tumefaciens i. benthamiana yaprakları (şekil 1) sızmak.
İşte jasmonate COP1-SPA1 etkileşimleri azaltarak onaylayan bu teknik kullanışlılığı bir örnekt...

Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Bu prosedürün genel amacı, geçici bir ekspresyon sistemindeki protein-protein etkileşimlerini kantitatif olarak tespit etmektir. Bu ölçüm, kimyasal veya çevresel bir işlemden sonra protein protein yönümüzü kantitatif olarak nasıl izleyeceğimiz gibi kuan sinyali işlem alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, sonuçların daha doğru olması için protein protein yönü yoğunluğunu temsil eden berrak aktiviteyi tespit etmek için bir luminometre veya bir CCD kamera kullanmasıdır.Bu işleme başlamak için, tohum içeren bir nokta beş mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yüzde beş sodyum hipoklorit ve sıfır nokta yüzde bir triton x yüz içeren bir çözelti ekleyin. Tohumları sterilize etmek için çözeltiyi beş dakika dinlendirin. Daha sonra tohumları beş kez steril suyla yıkayın.Yıkanmış tohumları iki yüz mikrolitre steril suda bekletin. İnce uçlar kullanarak, tek tek tohumları kaplanmış MS agar ortamının yüzeyine dikkatlice yerleştirin. Çimlenmeyi senkronize etmek için plakaları üç gün boyunca dört santigrat derecede saklayın.Bundan sonra, orta plakaları on gün boyunca normal büyüme koşulları altında tutun. Çimlenen fideleri köklere zarar vermemeye dikkat ederek toprağa aktarın. Nemi korumak için tepsiyi gece boyunca şeffaf plastik bir kapakla örtün.Bitkileri, agrobacterium tumefaciens sızmasına hazır olacakları yedi hafta boyunca kontrollü bir yetiştirme odasında yetiştirin. Başlamak için, a-tumefaciens yetkin hücre suşu GV3101'e yüz elli nanogram plazmit verin. A-tumefaciens kültürünü içeren tüpleri bir çalkalayıcıya yerleştirin ve dört saat inkübe edin.Bir cam çubuk kullanarak, kültürü tüplerden LB ortamlarına aktarın. Dört gün boyunca 28 santigrat derecede kültür a-tumefaciens ve LB agar ortamı. Daha sonra, her plakadan tek bir a-tumefaciens kolonisini üç mililitre LB sıvı ortam içeren kendi tüpüne aşılamaya hazırlanın.Kültürü yaymak için 24 saat boyunca 280 santigrat derecede 280 RBM'de çalkalayın. Daha sonra, 75 mikrolitre bakteri kültürünü, mililitre kanamisin başına 15 mikrogram ve mililitre rifampisin başına 50 mikrogram içeren 15 mililitre taze LB sıvı ortama aktarın. Bakterileri 220 RPM'de 30 santigrat derecede 8 saat boyunca OD600 0.5 ila 1 arasında olana kadar kültürleyin.Bundan sonra, kültürü 15 mililitre santrifüj tüplerine aktarın. 15 dakika boyunca 4000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve paleti 15 mililitre dönüşüm çözeltisinde yeniden süspanse edin.15 dakika boyunca 4000 kez yerçekimi ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Ardından, süspansiyon ve santrifüjleme adımını bir kez daha tekrarlayın. Süpernatanı atın ve paleti 5 mililitre dönüşüm çözeltisinde yeniden süspanse edin.Yeniden askıya alınan paleti karanlık koşullarda oda sıcaklığında iki saat dinlendirin. Daha sonra, ya OD600'e 0.5'e dönüşüm çözeltisi ekleyin ya da eşleştirilmiş protein etkileşimlerini test etmek için iki numuneyi eşit hacimde birleştirin. Bir mililitrelik bir şırınga iğnesi kullanarak, asılı hücreleri dördüncü ila yedinci yapraklara sızdırın.Bundan sonra, bitkileri hemen 12 saat boyunca siyah plastik bir örtü ile örtün. İlk olarak, başarıyı sağlamak için bitkilerin çok sağlıklı olması gerekir. İkinci olarak, sızma işlemi sırasında herhangi bir yaprağa zarar vermediğinizden emin olun.Tepsiyi 12 saat karanlıkta tutun. Daha sonra, lusiferaz aktivitesini tespit etmeden önce bitkileri normal koşullar altında 2 ila 4 gün büyütün. Görüntüleme yöntemine başlamak için, sızmış bir yaprağı ayırın.Tüm broşürü MS agar besiyeri içeren bir tabağa yerleştirin. 50 mililitrelik bir sprey şişesi kullanarak, yaprakların adaksiyal tarafına luciferon çalışma tamponu püskürtün. Ardından, klorofil otofloresansını söndürmek için 5 dakika karanlıkta tutun.50 milisaniyelik ışıkla dolu pozlama süresi ve 1 dakikalık lüminesans algılama süresi ile görüntüler yakalamak için eksi 30 santigrat dereceye soğutulmuş daha düşük ışık soğutmalı bir CCD hayal cihazı kullanın. Bundan sonra, N-benthamiana yapraklarının sızma alanından yaprak parçalarını kesin. Parçaları, 96 oyuklu beyaz plakanın kuyucuklarında 100 mikrolitre deiyonize suya batırın.On mikrolitre luciferon çalışma tamponu ekleyin. Plakayı 5 dakika dinlendirin. Ardından, protein etkileşim dinamiklerini incelemek için istenen herhangi bir özel tedaviyi gerçekleştirin ve lüminesansı doğrudan ticari bir luminometre ile ölçün.Burada, COP 1 SPA 1 etkileşimlerini temsil eden berrak aktivitenin gösterimi gösterilmektedir. Lüminesans ile tespit edilen lusifer aktivitesi, CCD kamera ile görüntülenir. COP 1 SPA 1 etkileşimlerinin fonksiyonel lusiferazın bakır mutasyonu ile sonuçlandığı görülmektedir.Jasmine 8 tedavisi altında zaman içinde lusiferaz aktivitesi daha sonra belirlenir. Lusiferaz aktivitesi ile temsil edilen COP 1 SPA 1 etkileşimlerinin karanlıkta kademeli olarak azaldığı görülmektedir. Yasemin 8 ile tedavi bu etkileşimleri daha da azaltır.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa bitkiler hazır olduktan sonra 1 hafta içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, sağlıklı bitkileri korumayı unutmamak önemlidir. Yaprakları dikkatlice sızın ve kontrolleri uygun şekilde dahil edin.Geliştirildikten sonra, bu teknik, sinyal işlemleri alanındaki araştırmacıların protein protein etkileşim dinamiklerini hızlı bir şekilde keşfetmelerinin önünü açıyor. Bu videoyu izledikten sonra, tütün bitkilerinin nasıl yetiştirileceğini, agrobakterilerin tütün yapraklarına nasıl sızacağını ve tuzlu aktivitelerin nasıl tespit edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

luciferase-complementation-imaging-assay-nicotiana-benthamiana-leaves

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale BioRad düzgün soğan epidermal hücrelerin içine plazmid DNA tanıtmak için Helios Gen Tabancası ve nasıl Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) ilkesine dayalı soğan hücreleri protein-protein etkileşimleri test etmek için nasıl kullanılacağını...

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

Bu video, protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için bölünmüş lusiferaz tamamlama testini göstermektedir. Bu tahlilde, ilgilenilen proteinler, lusiferaz enziminin küçük ve büyük parçalarına etiketlenir. Proteinler etkileşime girdiğinde, büyük ve küçük fragmanlar, belirli bir substratın varlığında ölçülebilen parlak ışıldama açığa çıkaran aktif bir enzim kompleksi oluşturmak üzere birleşir.

Spesifik Protein-Protein Etkileşimlerini Tanımlamak için Bölünmüş Lusiferaz Tamamlama Testi

Agrobacteria (Tütün mozaik virüsü-esaslı) aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için hızlı ve ekonomik bir yaklaşımdır başlatmak vektörleri taşıma ile vakum infiltrasyonu göre Nicotiana bitkilerinde geçici protein üretimi. Biz prosedürü basitleştirilmiş ve bakteri yetiştirme koşulları optimize konak türlerin seçimi, ve RNA susturulması bastırıcılara ko-tanıtarak hedef birikimini geliştirdi.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Hücre altı düzeyde, sinyal olayları gelişimsel ve çevresel ipuçları tarafından dinamik olarak modüle edilir. Burada, dinamik protein-protein etkileşimini izlemek ve bitki hücrelerinde sinyal iletiminin uzamsal organizasyonunu açıklamak için tütün geçici ekspresyon sistemini kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Burada sunulan protokol, bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son varyantını kullanarak, canlı memeli hücrelerinde sitoplazmik olarak maruz kalan N- ve / veya C-termini ile Golgi-yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin oluşumunu göstermeyi amaçlamaktadır.

Golgi-Resident Tip III Membran Proteinleri tarafından oluşturulan Heterolog Komplekslerin Bölünmüş Luciferaz Komplemantasyon Testi Kullanılarak Gösterilmesi

Burada ifade, çıkarma ve rekombinant insan IgG arınma için basit bir yöntem Nicotiana benthamianaGFP erimiş açıklar. Bu protokol, kolon kromatografisi kullanan çok sayıda proteinin saflaştırılması ve görselleştirilmesi için genişletilebilir. Ayrıca protokol, proje tabanlı keşif ler sağlayan, şahsenn ve sanal üniversite öğretim laboratuvarına uyarlanabilir.

Nicotiana benthamiana'da Geçici Olarak Ifade Edilen IgG Füzyon Proteinlerinin Üretimi

Burada, BiFC tabanlı FRET-FLIM test tarafından floresan etiketli proteinler kullanarak üç protein ortağı arasındaki üçlü kompleks oluşumunu görselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, protein-proteinetkileşim komplekslerini vivo olarak incelemek için değerlidir.

BiFC-FRET-FLIM Tahlilinde MADS Kutusu Transkripsiyon Faktörünün İki Monomeri ile Kalsiyum Sensör Proteini Arasındaki Üçlü Etkileşimin Belirlenmesi

Floresan rezonans enerji transferi (FRET), canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Burada, histon modifiye edici enzimlerin, bitki dokularındaki gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesi için hedef promotörlere onları işe alan transkripsiyon faktörleri ile ilişkisini incelemek için bir FRET protokolü sunulmaktadır.

Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki Etkileşimlerin in vivo Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi

Bu protokol, virüs-plazmodesmata etkileşimleri veya plazmodesmal transport sırasında plazmodesmataya protein hedeflemenin konfokal mikroskopi tabanlı analizleri için optimal plazmodesmal belirteçlerin seçimini açıklar.

Nicotiana benthamiana'da Plasmodesmata'ya Protein Ayıklamasının Konfokal Mikroskopi Analizi

Öğrenin Nicotiana benthamiana yapraklarında lusiferaz tamamlayıcı görüntüleme yöntemiyle protein-protein etkileşimlerini nicel olarak tespit etmeyi. Bu hızlı teknik, sinyal iletimi araştırmalarında etkileşim dinamiklerini güvenilir şekilde ölçmenizi sağlar.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için (Video) | JoVE Journal

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Daha fazla video keşfet