Name: İç kulak gen teslim yenidoğan Mouse için posterior semisirküler kanal yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: Öğrenin, yeni doğan farelerde iç kulak gen teslimi için posterior semisirküler kanal yaklaşımını. Bu güvenilir yöntem, tüm iç kulağı perfüze ederek gen terapisi araştırmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser NIDCD bölümü, Intramural araştırma /NIH (DC000082-02 W.W.C.) yanı sıra DC000081 fonlarından için gelişmiş görüntüleme çekirdek tarafından desteklenmiştir. Bizim hayvanlar için bakım için NIDCD hayvan tesis personel için sana şükrediyoruz.

Tüm hayvan yordamları hayvan bakım ve kullanım Komitesi Ulusal Enstitüsü sağırlık ve diğer iletişim bozuklukları (NIDCD ASP1378-15) tarafından kabul edildi.
1. yordam kurulum ve hazırlık
<ol><li>Etilen oksit denemenin başında tarafından tüm aletleri sterilize. Hayvanlar arasında boncuk sterilizasyon kullanarak aletleri temiz.</li>
	<li>Bir micropipette üzerinde mikro-enjektör içine viral gen terapisi içeren çözüm yükleyin. Bu çalışmada kullanılan viral vektör AAV2/8-whirlin yapıldı (1 x 1013 genom kopya sayısı mililitre, malzemelerin tabloya bakın). Not: Genellikle, 1.1 µL Toplam hacim micropipette yüklenir.</li>
</ol>2. anestezi
Not: Bu çalışmada kullanılan fare zorlanma whirler faredir. Homozigoz mutantlar (okulwi/kablosuz) ve heterozigoz littermates (okul+/ wi) kullanılmıştır.
<ol><li>Anne ayrı kafese (çöp ayrıdır) yerleştirin.</li>
	<li>Fareler sıcak tutmak için bir dolaşım ısı yastık (set 37,5 ° c) üzerinde çöp (P0 - P5 pups) içeren ev kafes yerleştirin.</li>
	<li>Lateks eldiven başparmak kısmı keser ve bir yavru içine yerleştirir.</li>
	<li>Yavru bir kova dolusu buz ~ 2 min için lateks eldiven başparmak yerleştirin.</li>
	<li>İmzalat yavru bir 4 "x 4" gazlı bez pup ve pack'ın yüzeyi arasında büyük kare ticari plastik donma paketiyle yerleştirin.</li>
	<li>Ağır bir lateks eldiven ezilmiş buz ile doldurun ve buz eldiveni yavru fok çevresinde yer.</li>
	<li>Yavru fok (bir firma ayak çimdik dahil) çeşitli uyaranlara karşı bir yanıt tam eksikliği ile yeterli anestezi Eğer görmek için kontrol edin. Yavru fok buz torbası (yaklaşık 5-10 dk) ameliyat süresince bırakın. Not: Belgili tanımlık pups ameliyat sırasında en fazla 15 dakika buz torbası açık bırakmak öneririz.</li>
</ol>3. cerrahi yaklaşım (şekil 1)
<ol><li>Hayvan anestezi bir kez deri bir iyot temizleme işlemi ve bir alkol silme ile kulak arkasında temiz.</li>
	<li>Postauricular kesik ~ 2 mm mikro-makas kullanarak kulağının arkasında olun ve mikro-makas ile boyun kas bölün.</li>
	<li>Yüz sinir ve bulla tanımlar. Bulla kıkırdak ve yarı saydam bu yaşta ve bu yüz sinir medial yatıyor. Stapedial arter bulla ile yararlı bir dönüm noktası olduğunu bu yaşta görülebilir.</li>
	<li>Yüz sinir konumlanmıştır ve özafagusu izleyin posterior semisirküler kanal (bundan) bulmak için. Kas lifleri ve yumuşak doku posterior semisirküler kanal mikro-makas kullanarak örten kaldırın. Not: Bundan bu yaşta kıkırdak.</li>
	<li>Bir cam micropipette (~ 10 mikron çapında) mikro-enjektörü kullanarak bundan nüfuz.</li>
	<li>Viral gen terapisi iç kulak enjekte. Not: Genellikle, Toplam 49 20 enjeksiyonlari nL gen tedavisi teslim edilir posterior semisirküler kanal 40 ~ s (Toplam hacim ~ 1 µL). Kullanılan viral titresi mL başına 1 x 1013 genom kopya oldu.</li>
	<li>5-0 polyglactin dikiş kullanarak cilt kesi kapatın.</li>
</ol>4. ameliyat sonrası bakım
<ol><li>Yavru fok anestezi sürekli manuel stimülasyon/haddeleme ile eldivenli insan parmak ile kurtarma sırasında normal vücut ısısı geri yüklemek için Isınma bir yastık yerleştirin.</li>
	<li>Yavru fok uyanık olduğunda, geri onun ev kafesin içine yerleştirin.</li>
	<li>Her yavru için eve kafes yatak maruz bir pamuk bez ile okşadı. Not: Bunun amacı onu çöp ameliyat sonrası yeniden kabul anne olasılığını artırır ameliyat öncesi yaptıkları gibi kokuyorsun fareler sahip olmaktır. Mümkünse, idrar anneden toplanan ve daha fazla reddedilme olasılığını azaltmak için bir pamuklu çubukla kullanarak pups ovuşturdu.</li>
	<li>Onun8duyarsızlaştırmak için annenin Burun madeni yağ uygulayın ve ev kafesin içine annesinin reintroduce.</li>
</ol>

<ol><li>Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+Hear%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for sensorineural hearing loss.</a> Ear Hear. 36, 1-7 (2015).</li>
<li>Askew, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmc+gene+therapy+restores+auditory+function+in+deaf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice.</a> Sci Transl Med. 7, 295(2015).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75, 283-293 (2012).</li>
<li>Pan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+restores+auditory+and+vestibular+function+in+a+mouse+model+of+Usher+syndrome+type+1c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c.</a> Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).</li>
<li>Isgrig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Balance+and+Auditory+Functions+in+a+Mouse+Model+of+Usher+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome.</a> Mol Ther. 25, 780-791 (2017).</li>
<li>Lentz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+hearing+and+vestibular+function+by+antisense+oligonucleotides+in+a+mouse+model+of+human+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness.</a> Nat Med. 19, 345-350 (2013).</li>
<li>Shibata, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+Prevents+Autosomal-Dominant+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss.</a> Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).</li>
<li>Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+care+and+use+of+mammals+in+neuroscience+and+behavioral+research%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp+Top+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research.</a> Contemp Top Lab Anim. 43, 48(2004).</li>
<li>Chien, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Hair+Cell+Stereocilia+Morphology+in+Inner+Ears+of+Deaf+Whirler+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice.</a> Mol Ther. 24, 17-25 (2016).</li>
<li>Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lipopolysaccharide+compromises+the+blood-labyrinth+barrier+and+increases+entry+of+serum+fluorescein+into+the+perilymph%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).</li>
<li>Okada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+targeting+mouse+vestibule+using+adenovirus+and+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors.</a> Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).</li>
<li>Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy+with+ancestral+AAV+in+adult+mice%3A+complete+transduction+of+inner+hair+cells+without+cochlear+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction.</a> Sci Rep. 7, 45524(2017).</li>
</ol>

Yazarlar yapmak için hiçbir ilgili açıklamalar var.

Birkaç cerrahi yaklaşım kemirgen iç kulak erişmek için tarif edilmistir. Posterior semisirküler kanal ve endolymphatic kesesi yaklaşımlar genellikle Vestibüler organları1erişmek için kullanılır, ancak Cochleostomy ve yuvarlak pencere yaklaşımlar en sık koklea, erişmek için kullanılır. Bir son çalışmada, o posterior semisirküler kanal enjeksiyonları viral gen tedavisi saç hücre iletim Vestibüler organ veya koklea5yüksek verimliliği sonuçlandı gösterdik. Aslında, koklear saç ...

İç kulak gen terapisi araştırma çalışmaları hızla gelişmekte olan bir alandır. Bu savaş ototoksisite, gürültü travma ve kalıtsal işitme kaybı1çeşitli hayvan modellerinde uygulanmıştır. Birkaç son çalışmalar mutant farelerde iç kulak gen terapisi teslim2,3,4,5,6sonra, işitme ve denge işlevlerini fonksiyonel iyileşme göstermiştir 7. bir anahtar faktörler iç kulak gen terapisi başarı iç kulak erişmek için kullanılan cerrahi yaklaşım olduğunu belirleme. İdeal olarak, cerrahi yaklaşım gerçekleştirmek kolay olurdu, anatomik işaretlerini tutarlı ve kolay tanımlamak olurdu ve hedeflenen hücre tiplerinin elde edilen iletim yüksek olacaktır.
Bir son çalışmada, viral gen terapisi whirler mutant fare (işitme kaybı ve Vestibüler disfonksiyon bir model) posterior semisirküler kanalından enjekte edildiğinde duyusal saç hücrelerinin verimli iletim Vestibüler içinde görülmüş gösterdi organları de olduğu gibi koklea5. Duyusal saç hücre iletim yüksek verimlilik iyileştirme bu mutant farelerde işitsel ve Vestibüler fonksiyonların sonuçlandı.
Bu makalede, Yenidoğan fare iç kulak erişmek için posterior semisirküler kanal yaklaşım biz ayrıntılı olarak tarif.

<table><tbody><tr><td>Ameliyat mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td>OPMI Pico KBB mikroskobu. Diğer diseksiyon mikroskopları da işe yarayacaktır.</td></tr><tr><td>Mikro forcepts</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-10, 11295-51</td> <td># 5 ve # 55 Dumont</td></tr><tr><td>Mikro makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Nanolitre2000 mikroenjektör</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isıtma yastığı</td><td>Mastex</td><td>Model 500/600</td><td></td></tr><tr><td>5-0 vicryl sütürler</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV8-girdap</td><td>Vektör Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam pipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td>Borosilikat cam</td></tr></tbody></table>

İç kulak gen teslim yenidoğan mouse için posterior semisirküler kanal yaklaşım

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

İç kulak gen tedavisi büyük söz işitme kaybı ve baş dönmesi için potansiyel bir tedavi olarak sunmaktadır. İç kulak gen terapisi başarısı önemli belirleyicileri işitme kaybı en aza indirerek tutarlı iletim verimliliği hedef hücre tiplerinin sonuçları bir teslimat yöntemi bulmak için biridir. Bu çalışmada, iç kulak gen teslim yenidoğan farelerde için uygun bir yöntem olarak posterior semisirküler kanal yaklaşım tarif. Gen teslim posterior semisirküler kanal aracılığıyla tüm iç kulakta sıvı mümkün olduğunu göstereceğiz. Posterior semisirküler kanal kolay anatomik tanımlanması, hem de en az gerekli temporal kemik manipülasyon, iç kulak gen teslim için cazip bir seçenek yapmak bu cerrahi yaklaşım.

Enjeksiyon AAV8 whirlin gen tedavisi yenidoğan whirler fareler posterior semisirküler kanal aracılığıyla içine S.1 genel enfeksiyon verimliliği ile sonuçlandı (yeşil) ifadesinde utricular saç hücreleri (Resim 2), whirlin (SD 38,1, n = 28)5 . Transduced saç hücreleri uzamış kontralateral sigara enjekte kulaklarından saç hücrelerine göre stereocilia (kırmızı) (5.35 ± 2.11 µm 3.20 ± 0.34 µm, vs sırasıyla)5.
<p ...

Bu çalışmada, iç kulak gen teslim yenidoğan farelerde için güvenilir bir yöntem olarak posterior semisirküler kanal yaklaşım tarif. Gen teslim posterior semisirküler kanal aracılığıyla tüm iç kulakta sıvı mümkün olduğunu göstereceğiz.

İç kulak gen teslim yenidoğan Mouse için posterior semisirküler kanal yaklaşım

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Bu prosedürün genel amacı, gen iletimi için fare iç kulağına erişmektir. Bu yöntem, gen terapisinin farenin iç kulağına verimli bir şekilde iletilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, güvenilir ve öğrenmesi kolay olmasıdır.Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, fare iç kulağının küçük boyutu nedeniyle mücadele edeceklerdir. Bununla birlikte, pratikle, çoğu insan cerrahi bir diseksiyonu on dakika içinde tamamlayabilir. Prosedüre steril aletlerle başlayın ve hayvanlar arasındaki aletleri temizlemek için boncuk sterilizatörünü açın.Terapötik virüsü bir mikro enjektöre bağlı on mikron çapında bir mikropipete yükleyin. Deneylerimizde kullanılan viral vektör, mililitre başına 28 genom kopyası için bir çarpı on ile 13-girdaptır. Bu videoda görselleştirme kolaylığı için metilen mavisi boyası kullanılmıştır.Kulağın arkasındaki cildi üç betadin ovma ve ardından alkollü mendil ile temizleyin. Ardından, kulağın yaklaşık iki milimetre arkasında bir posta yapmak için mikro makas kullanın ve alttaki yumuşak dokuyu bölün. Fasiyal siniri ve bülbülyü tanımlayın.Sternokleidomastoid kas, fasiyal sinire dik olarak uzanır. Stapedial arter, yararlı bir dönüm noktası olan bulla

posterior-semicircular-canal-approach-for-inner-ear-gene-delivery

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Fare iç kulak olan gelişim programı gebelikte özenli bir taslakları kaynaklı duyu organıdır. Biz bir...

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

Kaynak: Kozin, E. D., et.al. İşitsel yolun optogenetik stimülasyonu için murin dorsal koklear çekirdeğinin doğrudan görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, ışığa bağlı işitsel stimülasyonu mümkün kılmak için fare dorsal koklear çekirdeğine (DCN) virüs aracılı gen transferini göstermektedir. Işığa duyarlı bir iyon kanalı olan opsin kodlayan bir viral vektör, doğrudan erişim için bir kraniotomi ve serebellar aspirasyonu takiben DCN'ye enjekte edilir. İfade edilen opsinler, nöronların...

Işık kaynaklı işitsel stimülasyon için fare dorsal koklear çekirdeğine virüs aracılı gen transferi

Bu videoda, işitme ve vestibüler fonksiyona en az hasarla yarım daire kanalından bir farenin iç kulağına lokal ilaç verilmesine izin veren bir prosedür olan kanalostomi gösterilmektedir. Bu yöntem, viral vektörlerin, ilaçların ve küçük moleküllerin farenin iç kulağına aşılanmasını sağlar.

Yetişkin Bir Farenin İç Kulağına Lokal İlaç Verilmesi için Kanalostomi

Kaynak: Akil, O., et al., Yuvarlak Pencere Zarından Fare İç Kulağına Viral Aracılı Gen Verilmesi için Cerrahi Yöntem. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, genetik olarak indüklenen işitme kaybı olan bir fare yavrusunun iç kulağına terapötik bir gen verme prosedürünü göstermektedir. Adeno-ilişkili bir viral (AAV) vektör kullanılarak, gen yuvarlak pencere zarından enjekte edilir ve viral partiküllerin saç hücrelerine girmesine, glutamat taşıyıcı üretimini geri kazanmasına ve beyne ses sinyalini yeniden...

Bir fare modelinde işitme restorasyonu için viral vektör tabanlı gen tedavisi

Açıklanan kulak sonrası cerrahi yaklaşım, kan kaybını ve hayvan ölümlerini en aza indirirken fare koklear skala timpanisine hızlı ve doğrudan iletim sağlar. Bu yöntem, yuvarlak pencere zarından doğum sonrası farelere moleküler, farmakolojik ve viral iletim kullanılarak koklear tedavi için kullanılabilir.

Yuvarlak Pencere Membran aracılığıyla Fare İç Kulak için virally ve Gen Teslimat Cerrahi Yöntemi

Embriyonik fare iç kulağından koklear eksplantların izolasyonunu ve kültürünü tanımlayan bir yöntem sunuyoruz.  Ayrıca, kare dalga elektroporasyon yoluyla koklear eksplantlara gen transferi için bir yöntem gösteriyoruz. Gen transfer tekniği ile birleştirilmiş in vitro eksplant kültürü, araştırmacıların gelişim sırasında gen ekspresyonunu değiştirmenin etkilerini incelemelerini sağlar.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Bu protokolün amacı, bir murin modelinde dorsal koklear çekirdeğe doğrudan erişim sağlamak için cerrahi bir yaklaşımın ana hatlarını çizmektir.

İşitsel Yolu ve optogenetic Stimülasyon için Murin Dorsal Koklear Çekirdek Doğrudan Görselleştirme

Bu protokolün amacı, yenidoğan murin koklear eksplantlarının hazırlanması, kültürü, tedavisi ve immün boyanmasını göstermektir. Bu teknik, işitme araştırmalarında in vitro bir tarama aracı olarak kullanılabilir.

Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği<em&gt; In vitro</em&gt; İşitme Araştırmalarında Tarama Aracı

Yuvarlak pencere membran ile cerrahi bir yöntem bir insan dışı primat, ortak marmoset (Callithrix jacchus), iç kulak ilaçlara yönetmek için rapor.

Bir insan olmayan primatların ortak Marmoset (Callithrix jacchus) iç kulak ilaçlara Yönetim için bir cerrahi prosedür

Burada biz yerel ilaç dağıtım iç kulaklarına semisirküler kanal hasarı ile yetişkin ve neonatal farelerin duyma ve vestibüler işlevine izin veren canalostomy açıklayınız. Bu yöntem viral vektörler, eczacılık ve küçük moleküller fare iç kulak aşılamak için kullanılabilir.

Canalostomy yerel ilaç dağıtım yetişkin ve Neonatal farelerin iç kulaklarına bir cerrahi yaklaşım olarak

Öğrenin, yeni doğan farelerde iç kulak gen teslimi için posterior semisirküler kanal yaklaşımını. Bu güvenilir yöntem, tüm iç kulağı perfüze ederek gen terapisi araştırmalarını kolaylaştırır.

İç kulak gen teslim yenidoğan Mouse için posterior semisirküler kanal yaklaşım

Daha fazla video keşfet