İç kulak gen teslim yenidoğan Mouse için posterior semisirküler kanal yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, gen iletimi için fare iç kulağına erişmektir. Bu yöntem, gen terapisinin farenin iç kulağına verimli bir şekilde iletilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, güvenilir ve öğrenmesi kolay olmasıdır.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, fare iç kulağının küçük boyutu nedeniyle mücadele edeceklerdir. Bununla birlikte, pratikle, çoğu insan cerrahi bir diseksiyonu on dakika içinde tamamlayabilir. Prosedüre steril aletlerle başlayın ve hayvanlar arasındaki aletleri temizlemek için boncuk sterilizatörünü açın.

Terapötik virüsü bir mikro enjektöre bağlı on mikron çapında bir mikropipete yükleyin. Deneylerimizde kullanılan viral vektör, mililitre başına 28 genom kopyası için bir çarpı on ile 13-girdaptır. Bu videoda görselleştirme kolaylığı için metilen mavisi boyası kullanılmıştır.

Kulağın arkasındaki cildi üç betadin ovma ve ardından alkollü mendil ile temizleyin. Ardından, kulağın yaklaşık iki milimetre arkasında bir posta yapmak için mikro makas kullanın ve alttaki yumuşak dokuyu bölün. Fasiyal siniri ve bülbülyü tanımlayın.

Sternokleidomastoid kas, fasiyal sinire dik olarak uzanır. Stapedial arter, yararlı bir dönüm noktası olan bulladan görülebilir. Arka yarı dairesel kanalı bulmak için fasiyal siniri üst ve arka olarak takip edin.

Arka yarı dairesel kanalın üzerindeki kas liflerini ve yumuşak dokuyu çıkarmak için mikro makası kullanın. Daha sonra mikro enjektör üzerine yüklenen cam mikropipet ile arka yarı dairesel kanala nüfuz edin ve boyayı iç kulağa enjekte edin. Tipik olarak, yaklaşık bir mikrolitrelik bir toplam hacim için 40 saniye boyunca arka yarı dairesel kanala toplam 20 adet 49 nano litre enjeksiyon yapılır.

Son hacmi uyguladıktan hemen sonra pipeti geri çekin. Ardından, 5-0 poliglaktin sütür kullanarak cilt kesisini kapatın. Bu videoda gösterildiği gibi AAV8-jakuzi farelerine AAV8-jakuzin enjeksiyonu, utriküler saç hücrelerinde yeşil renkte gösterilen girdap ifadesi ile sonuçlandı.

Dönüştürülen saç hücreleri, kontralateral, enjekte edilmemiş kulaklardan gelen saç hücrelerine kıyasla kırmızı ile gösterilen uzamış stereocilia'ya sahipti. AAV8-girdapın posterior yarı dairesel kanal enjeksiyonu ayrıca girdap farelerinde koklear saç hücrelerinin transdüksiyonu ile sonuçlandı. Dönüştürülen saç hücreleri, stereocilia uçlarında girdap ifade etti ve kontralateral, enjekte edilmemiş kulaklardan gelen saç hücrelerine kıyasla uzamış stereocilia'ya sahipti.

Bu prosedürü takiben, iç kulak gen iletiminin işitsel ve vestibüler fonksiyonlar üzerinde bir etkisi olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için ABI ve stereo testi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, iç kulak gen iletimi alanındaki araştırmacıların, fare iç kulağındaki gen iletimi kusurlarını keşfetmelerinin yolunu açtı.