Bleomycin ile fareler Airways önceden Merkezi Klima Orthotopic akciğer kanseri hücre Engraftment verimliliğini artırır
28 Haziran 2018
Biz önceden airways yaralanma ile Klima tarafından fare ciğerlerine akciğer kanser hücrelerinin orthotopic engraftment önemli ölçüde geliştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım aynı zamanda akciğer microenvironment, metastatik yayılması, akciğer kanseri komorbiditeler içinde stromal etkileşimleri çalışmaya uygulanabilir ve daha verimli bir şekilde hasta oluşturmak için xenografts türetilmiş.
Bu prosedürün genel amacı, tümörü başlatan akciğer kanseri hücrelerinin farelerin hava yollarına nakledilmesinin etkinliğini arttırmaktır. Bu yöntem, ilaç direncinin nedenleri ve fibroz ile akciğer kanseri arasındaki ilişki de dahil olmak üzere kanser biyolojisindeki temel soruları yanıtlamak için yeni klinik öncesi modellerin oluşturulmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tümör başlatan hücrelerin çeşitli fare suşlarının akciğerlerine transplantasyon verimliliğini arttırmasıdır.
Bu tekniğin etkileri tedaviye doğru uzanır, çünkü tedaviye farklı klinik yanıtlara sahip olduğu bilinen daha çeşitli insan akciğer kanseri alt tiplerini modellememizi sağlar. Bu protokol için önce farelere bleomisin enjekte edilmelidir. Daha sonra 14 gün sonra tümör hücreleri enjekte edilir.
Her iki enjeksiyon için prosedür çok benzerdir ve burada açıklanmıştır. Enjeksiyondan iki saat önce, bleomisin stoğunu buz üzerinde çözün ve çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin. Buz üzerinde tutun.
Bir hücre bolusu için, metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanmış bir hücre süspansiyonuna sahip olun. Her fare için işlem süresi hep birlikte yaklaşık 10 dakikadır. Bir ayak parmağı çimdikleme kullanarak uygun anesteziyi onayladığınızdan emin olun ve gözlere veteriner merhemi sürün.
Şu anda, farenin koyu renkli saçları varsa, doğru bir şekilde görüntülenebilmesi için tüm kaburga bölgesini hem ventral hem de dorsal olarak tıraş edin. Ardından, fareyi sırtı platforma gelecek şekilde ön dişlerinden sabitleyerek entübasyon platformuna yerleştirin. Bir hücre bolusu enjekte edilecekse, şimdi hafif bir tritürasyon ile yeniden süspanse edin.
Şimdi göğsün üst bölgesini aydınlatın, ağzı açın ve düz forseps kullanarak dili nazikçe dışarı çekin. İğneyi çıkararak trakea için bir IV kateter hazırlayın, ardından trakeal açıklığın üzerine yerleştirin. Daha sonra, kateterin üst kısmı ön dişlere yakın olana kadar kateteri trakeaya yerleştirin ve yerleşimini doğrulamak için kateterin içini aydınlatın.
Ardından, 50 mikrolitre taze yapılmış bleomisin veya hücre süspansiyonunu doğrudan katetere dağıtın. Tüm hacmin kateterden aşağı inmesi için birkaç saniye bekleyin. Ardından kateteri çıkarın ve %10'luk çamaşır suyuna atın.
Fare sıvıyı solumuyorsa, solunumunu dikkatlice izleyin ve kateter konumunu ayarlayın. Fare nefes almayı durdurursa, kateteri hemen çıkarın ve kateteri yeniden takmadan önce farenin nefes almasına izin verin. Kateteri çıkardıktan sonra, tedavi edilmiş, hala anestezi altında ve görüntüye hazır beş fareye sahip olmak için prosedürü gerçekleştirmeye devam edin.
Kurtarma için, fareyi bir kurtarma kafesinde IACUC onaylı bir ısıtma yastığına sırtüstü yatırın ve tamamen iyileşene kadar izleyin. Hücreleri enjekte ettikten iki veya üç dakika sonra, bir insülin iğnesi kullanarak retro-orbital olarak 100 mikrolitre lusiferin enjekte edin. Her görüntüleme seansında enjeksiyon için kullanılan gözü değiştirin.
En az iki dakika bekledikten sonra, bir hayvan biyolüminesans görüntüleyicisine en fazla beş fareyi sternal yaslanma pozisyonunda yerleştirin ve lüminesans ayarlarını kullanarak bir sırt resmi elde edin. Kontrol panelinin altında, hücrelerin lüminesansını ölçmek için çözünürlük ve hassasiyet ayarlarını yapın. Çoğu uygulama için üç dakika ile başlayın, gruplamayı orta olarak ayarlayın, f/stop'u bir olarak ayarlayın, görüş alanını d olarak ayarlayın ve konu yüksekliğini 1,5 olarak ayarlayın.
Enjeksiyon başarılı olduysa, bir akciğerde veya her iki akciğerde üst göğüs bölgesinde bir sinyal tespit edilir. Hücreler trakeanın girişinde kümelenmişse, enjeksiyon başarısız olmuştur. Dorsal görüntüyü aldıktan sonra, fareleri çevirin ve ventral bir görüntü elde edin ve ayarı gerektiği gibi ayarlayın.
Görüntülemeden sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi ameliyat sonrası bakıma devam edin. Ardından, bu görüntüleme protokolünü aşılamadan üç gün sonra ve daha sonra haftada bir tekrarlayın. Görüntüleri analiz etmek için bir biyolüminesans analiz yazılımı kullanın.
İlk olarak, serideki tüm uygun görüntüleri yükleyin. Bu bölüm bir yazılım paketiyle ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Daha sonra, her fare için, serinin ilk görüntüsünde, kare bir ilgi alanı oluşturun ve tüm akciğer bölgesini kaplayan üst göğüs bölgesinin üzerine yerleştirin.
Ardından, sağ tıklamayı kullanarak tüm ilgi alanlarını kopyala işlevine erişin ve gruptaki her görüntüye aynı ilgi alanlarını uygulamak için bu aracı kullanın. Ardından, her görüntüde, her farenin üst göğsünü kaplayacak şekilde karelerin konumlarını değiştirin. Bunu hem ventral hem de dorsal görünümler için yapın.
Şimdi, görüntü penceresinin sol üst köşesinde fotonlar işlevini seçin. Ardından hesaplama seçeneğini belirleyin. İlgilenilen bölgelerden gelen veriler daha sonra toplam akı olarak bir çıktı tablosunda görüntülenir.
Bu verileri gerektiği gibi analiz edin. Bağışıklık zayıfladığında, timik fareler bleomisin ile tedavi edildi. Hücre bolus aşılamasından önce, bleomisin ile tedavi edilen farelerde 14. günde geçici fibroz gözlendi, ancak araçla tedavi edilen farelerde gözlenmedi.
Daha sonra, yerleşik insan akciğer kanseri hücre hattı olan H2030'dan hücreler, bu farelerin akciğerlerine intratrakeal olarak verildi. 35 gün sonra, bleomisin ile tedavi edilen farelerde akciğer tümörü yükü yüksekti. Bununla birlikte, araçla tedavi edilen hayvanlarda herhangi bir tümör tespit edilmedi.
Akciğer tümörü yükü histoloji kullanılarak doğrulandı. Araç ile ön tedavi edilen akciğerlerde tümör nodülü bulgusu saptanmazken, bleomisin ön tedavi görmüş akciğerlerde büyük tümör nodülleri vardı. Metastatik bir H2030 BrM 3 hücre hattının nakledilmesinden 39 ila 57 gün sonra, biyolüminesans görüntüleme için çok yoğundu, bu nedenle uzak organlarda metastaz ex vivo olarak analiz edildi.
Çeşitli dokularda küçük lezyonlar tespit edilebilir, bu da bu yöntemin spontan olarak yayılan hastalığı incelemek için umut vaat ettiğini düşündürmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, görüntüleme olmadan beş farenin kafesi başına 10 dakika ve fareleri görüntülerken de kafes başına 20 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kateterin uygun şekilde yerleştirilmesini sağlamayı ve hayvanın solunumunu izlemeyi unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, aşılanmış tümörlerin ilaçlara nasıl yanıt verdiği veya akciğerlere özgü tümör stromal etkileşimlerini karakterize etmek gibi ek soruları yanıtlamak için farmakolojik çalışmalar veya hasat edilen dokunun aminoasetik kimyası gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, fizyolojik olarak ilgili bir ortamda hastadan türetilen ksenogreftler de dahil olmak üzere farklı fare suşlarına ve tümör modellerine uygulanabilir. Bleomisin ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken biyolojik tehlike başlığında manipülasyon ve uygun şekilde imha etme gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, yaralanma yoluyla hava yollarını ön koşullandırarak fare akciğerlerinde akciğer kanseri hücrelerinin ekimlenmesini artırma yöntemini açıklar. Bu teknik, stromal etkileşimlerin, metastatik yayılmanın ve akciğer kanseri eşmorbiditelerinin çalışmasını kolaylaştırabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Onkoloji
- Tercameli Araştırma
- Preklinik Modeller
Arka Plan
- Tümör öncü akciğer kanseri hücrelerinin farelere ekimi, kanser biyolojisini incelemek için kritik öneme sahiptir.
- İlaç direnci ve fibroz ile akciğer kanseri arasındaki ilişkiyi anlamak esastır.
- Farklı insan akciğer kanseri alt tipleri tedavilere değişik tepkiler verir.
- Mevcut modeller bu varyasyonları yeterince temsil etmeyebilir.
Çalışmanın Amacı
- Fare içinde akciğer kanseri hücresinin ekimlenme verimliliğini arttırmak.
- Kanser biyolojisi ile ilgili temel sorulara cevap verebilecek preklinik modeller oluşturmak.
- Daha geniş bir insan akciğer kanseri alt tiplerinin modelini oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- Fare, hava yolu hasarını indüklemek için bleomisin ile enjekte edilir.
- 14 gün sonra, hava yollarına tümör hücreleri enjekte edilir.
- Ekimlenme verimi çeşitli fare soyları boyunca değerlendirilir.
- Stromal etkileşimlerin ve metastatik davranışın analizi yapılır.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, tümör öncü hücrelerin ekimlenme verimini önemli ölçüde artırır.
- Çeşitli akciğer kanseri alt tiplerinin modellenmesini sağlar.
- Akciğer kanseri ve fibroz arasındaki ilişki hakkında bilgiler elde edilir.
- Terapi ve ilaç direnci anlayışı için potansiyel etkiler vurgulanır.
Sonuçlar
- Bu teknik, preklinik modellerde akciğer kanseri biyolojisini incelemeyi artırır.
- Çeşitli akciğer kanseri alt tiplerinde terapötik yanıtları araştırmak için bir platform sağlar.
- Gelecekteki çalışmalar bu yöntemi yeni tedavi stratejilerini keşfetmek için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Establishing physiologically relevant orthotopic lung cancer models remains a bottleneck in preclinical oncology due to low engraftment efficiency. This method addresses a critical discovery-stage challenge by enhancing tumor cell take rates through airway preconditioning, enabling more reliable assessment of tumorigenic capacity. Improved model fidelity supports better go/no-go decisions in target validation and lead identification by reducing biological noise and increasing predictive confidence in downstream therapeutic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in physiologically relevant lung microenvironment.
- Operational Value: Increases engraftment efficiency from 0-17% to 71-100%, reducing animal use and experimental variability.
- Strategic Value: Supports target de-risking by allowing consistent tumorigenic capacity assessment across mouse strains and tumor origins.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable bioluminescent readouts for longitudinal tumor burden monitoring.
- Operational Value: Standardizes orthotopic engraftment procedure across diverse murine models and cell sources.
- Strategic Value: Facilitates scalable screening of therapeutic agents in models that recapitulate lung-specific stromal interactions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models metastatic dissemination to distant organs, enabling study of clinically relevant disease progression.
- Operational Value: Works with limiting cell numbers, supporting preclinical testing of patient-derived xenografts and rare biospecimens.
- Strategic Value: Enhances preclinical continuity by linking fibrosis modulation to lung cancer outgrowth and therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for lung cancer programs where stromal context influences drug response.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on fibrosis-cancer interactions and stromal-mediated tumorigenicity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tumor take metrics essential for assay validation and compound prioritization.
- Analytics: Provides longitudinal bioluminescence and histological endpoints for comparative analysis of treatment effects.
- Translational Research: Models lung-to-organ metastasis, enabling evaluation of anti-metastatic strategies in vivo.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for engrafting diverse lung cancer subtypes across strains, reducing model development time.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tumorigenicity assays by reducing false-negative engraftment rates.
- Operational Value: Requires only 10-20 minutes per cage of five mice, supporting high-throughput model generation.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement by improving model reliability in preclinical efficacy studies.
- Portfolio Impact: Supports prioritization of lung cancer targets with enhanced preclinical validation in orthotopic settings.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine intubation and intratracheal injection techniques.
- Necessitates biosafety precautions for bleomycin handling, including use of a biohazard hood and proper waste disposal.
- Depends on access to bioluminescence imaging infrastructure for longitudinal engraftment monitoring.
- Requires standardization of bleomycin dosing and 14-day injury-to-engraftment interval across sites.
- Limited to immunocompromised or syngeneic models where engraftment is measurable; not applicable to immunocompetent syngeneic models without adaptation.
