Name: Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Öğrenin, asidik tümör mikroçevresinde kanser hücrelerinin davranışlarını incelemek için hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurma yöntemini. Bu teknik, tümör biyolojisi ve asidozla ilişkili hastalıklarda tedavi stratejileri geliştirmeye katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Division genom bilim ve laboratuvar üyeleri teşekkür sistemleri Biyoloji ve tıp, RCAST, Tokyo Üniversitesi için. Biz özellikle teşekkür Dr H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, Tokyo Üniversitesi), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida ve Dr. A. Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co, Ltd) yararlı tartışmalar ve destek. Bu eser kısmen için genç bilim adamı (A) (26710005, T.O.), yenilikçi alanları (26116711 ve 16 H 01567, T.O.) bilimsel araştırma için Grant-in-Aid ve Grant-in-Aid için zorlu Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir Araştırmacı araştırma (16K 14605, T.O.) Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji Japonya, Takeda Bilim Vakfı (to), kanser araştırmaları (to) Kobayashi temeli ve kanser araştırmaları için proje ve Terapötik evrim (P-oluşturma) ve yenilikçi kanserle savaş Japonya ajansı tıbbi araştırma ve geliştirme, AMED (to) için pratik araştırma.

1. asidik kültür orta hazırlanması
<ol><li>
Denetim (pH 7,4) hazırlanması ve düşük-pH (pH 6.8) kültür orta
	<ol>
<li>4.75 g L-glutamin olmadan DMEM tozu 500 mL su içinde çözülür.</li>
		<li>0,33 M NaHCO3 çözüm basınç sıkı bir şişe hazırlayın. Dikkat: NaHCO3 ısıtmalı ve termal olarak çürümüş CO2 gaz yayar bu yana bir basınç sıkı şişe kullanmak önemlidir.</li>
		<li>Otoklav orta ve çözüm. Bu arabellekleri 25 ° C'ye soğutmak izin</li>
		<li>200 mM L-glutamin, penisilin-streptomisin, 5 mL 5 mL ekleyin ve 50 mL fetal sığır serum DMEM 500 ml bikarbonat olmadan.</li>
		<li>Denetim (pH 7,4) orta için 0,33 M NaHCO3 çözüm DMEM 100 mL bikarbonat olmadan başına 2,4 mL ekleyin. Düşük-pH (pH 6.8) orta için 0,33 M NaHCO3 çözüm DMEM 100 mL bikarbonat olmadan başına 0.6 mL ekleyin.</li>
		<li>Altında %5, kuluçka 37 ° C'de 24 saat sonra orta pH kontrol CO2. Not: NaHCO3 çözüm miktarı kuluçka ve hava basıncı CO2 içeriğe bağlı olarak farklı olabilir orta pH bağlı olarak ayarlanması gerekir. İdeal olarak, ilk kez, NaHCO3 çözüm için DMEM eklemek için uygun miktarını belirlemek için çeşitli bikarbonat konsantrasyonu ile orta pH ölçmek daha iyi.<ol>
<li>Hemen CO2 kuluçka kültür çanak çıkardıktan sonra kültür orta toplamak ve pH metre kullanarak pH ölçmek. Orta sıcaklık bir su banyosu kullanarak 37 ° C'de tutun. Orta pH bağımsız olarak üç kez ölçmek. Not: NaHCO3 çözüm 4 ° C'de muhafaza edilmelidir ve her ortamın taze hazırlanmalıdır. Bu çalışmada kullanılan piyasada bulunan ürünler Malzemeler tabloiçinde listelenir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Laktat kaynaklı veya HCl kaynaklı asidik kültür ortamı hazırlama
	<ol>
<li>74 µL laktat çözüm veya 1 M HCL 125 µL denetim orta (1.1.5 adımda hazırlanan) 100 mL ekleyin.</li>
		<li>Altında %5, kuluçka 37 ° C'de 24 saat sonra orta pH kontrol CO2. Not: Laktat veya HCl bir çözüm de kuluçka ve hava basınç CO2 içeriğe bağlı olarak farklı olabilir orta pH göre ayarlanması gerekir. İdeal olarak, seri laktat veya HCl konsantrasyonu için ortamın pH istenen ayarlamak için uygun miktarını belirlemek ile orta pH ölçmek iyidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hasat ve hücreleri tedavi
<ol><li>Altında %5 CO2 gerçekleştirmeden önce en az 1 hafta deneyler 37 ° C'de hücreler yetiştirilmesi başlatın. Not: Bu çalışmada kullanılan hücre hatları Malzemeler tabloiçinde listelenir.</li>
	<li>% 70-90 confluency ulaştığınızda geçiş hücreleri. Hücreleri Konfluent olmak izin vermez. Orta 2-3 günde günlük ekimi sırasında değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri 5 mL PBS ekleyerek yıkayın. PBS Aspire edin ve 1 mL tripsin gibi ayırmayı enzim ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri yuvarlanır ve ayırmak başlamak kadar 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>5 mL kültür orta de müstakil hücrelere ekleme ve enzim devre dışı bırakın. 15 mL tüp ve 300 x g. aspiratı süpernatant adlı 3 dk santrifüj hücre süspansiyon aktarmak ve kültür orta hücrelerle yeniden askıya alma.</li>
	<li>Bir hemasitometre ve Trypan-mavi kullanarak canlı hücreleri saymak.</li>
	<li>Tohum 5.0 x 105 hücreleri/iyi bir 10 cm tabak orta 10 ml. 37 ° c altında %5 24 h için hücreleri kuluçkaya CO2.</li>
	<li>Kültür orta Aspire edin, 5 mL PBS hücrelerle yıkama ve 10 mL asidik kültür orta bölüm 1'de hazırlanan ekleyin. 37 ° c altında %5 24 h için hücreleri kuluçkaya CO2.</li>
</ol>3. RNA izolasyon
<ol><li>Kültür orta Aspire edin ve hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın. Hücrelerin RNA ayıklama reaktif ekleyerek bozabilir ( Malzemeleri tablolarıgörmek).</li>
	<li>Çanak kısaca kazımak, RNA ayıklama reaktif bir pipet ile kaldırın ve RNA ayıklama reaktif/hücre 1,5 mL tüp lysate mevduat. 5 min için oda sıcaklığında bırakın.</li>
	<li>250 µL kloroform ekleyin ve 5 min için oda sıcaklığında yaklaşık 15 s. bırak ve ≥8, 000 x g 5 min için santrifüj tüpü şiddetle çalkalanır.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak sulu faz dikkatli bir şekilde çıkarın. Sulu faz bırak. Başka bir 1,5 mL tüp içinde yerleştirin.</li>
	<li>Sulu faz 550 µL isopropanol ekleyin ve karışımı yavaşça. 5 dakika santrifüj (≥20, 000 x g) maksimum hızda süreyle oda sıcaklığında 4 ° C'de 20 dk için bırakın</li>
	<li>İsopropanol dökün ve 1 mL % 75 etanol DEPC su tedavi ekleyin. Hafifçe karıştırın. 8000 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Etanol ve granül kurumasına izin pipet.</li>
	<li>DEPC yaklaşık µL 15-25 (verim) bağlı olarak su RNA Pelet tedavi ekleyin. İyice karıştırın.</li>
	<li>260 OD ölçerek izole RNA konsantrasyonu ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak nm.</li>
</ol>4. cDNA sentezi
<ol><li>PCR reaksiyon tüp içinde aşağıdaki parçaları birleştirmek: 5 µg toplam RNA, 1 µL Oligo dT (50 µM) veya astar karışımlarda (60 µM), 1 µL 10 mM dNTP ve 14 µL toplam hacmiyle nükleaz ücretsiz su.</li>
	<li>Mix ve kısaca bir küçük benchtop santrifüj kullanarak bileşenlerini santrifüj kapasitesi (~ 5 s). 65 ° C'de 5 min için örnek RNA/astar denatüre Kısaca spin (~ 5 s) küçük bir benchtop kullanarak santrifüj kapasitesi ve örnek derhal en az 1 dk. için buz koymak.</li>
	<li>Aşağıdaki bileşenleri ekleyin: 4 µL 5 ters transkripsiyon arabellek x, 1 µL transkriptaz (200 U/µL), 1 µL RNase inhibitörü (40 U/µL). Not: Piyasada kitleri örnekleri Malzemeler tablo gösterilir
</li>
	<li>Tüp, kap mix ve kısaca belirtilen içeriğini bir küçük benchtop santrifüj santrifüj kapasitesi (~ 5 s). 10 dk 50-55 ° C kombine tepki karisimin kuluçkaya.</li>
	<li>Reaksiyon 10 dk 80 ° C'de kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
</ol>5. gerçek zamanlı PCR kullanarak asit duyarlı gen ekspresyonu ölçümü
<ol><li>Aşağıdaki bileşenler, 384-iyi tepki plaka birleştirmek: 1 µL şablon cDNA, 0,75 µL 10 N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine X 0.3 µL 50 µM ileri astar, 0.3 µL 50 µM ters astar, 1 µL Taq polimeraz, 2.5 µL 10 x Taq polimeraz arabellek, 2.5 µL 20 mM dNTP, 16.65 µL su. Not: Piyasada kitleri örneği Malzemeler tablogösterilmiştir. Astar listesi Tablo 1' de gösterilen. 96-iyi tepki plaka da bu adımda kullanılabilir. Diğer probları (örneğin, Taqman sonda) de kullanılabilir.</li>
	<li>Deneme ve gerçek zamanlı PCR sistemi aşağıdaki PCR programa ayarlayın: 50 ° C için 2 dk, 1 döngüsü; 10 dk, 1 döngüsü için 95 ° C; 95 ° C 15 s ve 60 ° C için 1 dakika, 40 döngüleri; 95 ° C 15 s, 1 döngüsü; 60 ° C 15 s, 1 döngüsü; 95 ° C 15 s, 1 döngüsü.</li>
	<li>Yer plaka qPCR alet. Programı başlatın. Not: pH duyarlı genlerin MSMO1Upregulation, INSIG1ve IDI1 tarafından protein düzeyleri ölçülebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cancer+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li>
<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li>
<li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue%3A+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li>
<li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Why do cancers have high aerobic glycolysis?</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li>
<li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li>
<li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752(2015).</li>
<li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li>
<li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293(2008).</li>
<li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li>
</ol>

Yazar Ayano Kondo bir çalışandır, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.

Burada, bir basit asidik pH kültür sistemi ve değerlendirme sürecinin açıklanan. Orta asitleştirme, Yani, düşük bikarbonat konsantrasyonu, laktat ek ve HCl ek olarak, üç yöntemlerin bileşimini pH-yanıtlama mekanizması iyice araştırmak ve hücresel yanıt diğer tümör olarak karşılaştırmak için bize etkin hipoksi veya besin açlık gibi microenvironmental koşulları.
Bu yöntem, kültür orta uygun konsantrasyonlarda bikarbonat, laktat ve HCl belirlemek için anahtardır. Bu yöntem ilk kez gerçek...

Tümör microenvironment tümör ilerleme ve kanser hücre metabolizması1,2,3kritik rol oynar. Kanser hücreleri genellikle hipoksi, besin yoksunluğu ve asidik ekstrasellüler pH (pHe) gibi koşullara maruz kalır. Ancak, tümör ilerleme pHe rolü gibi kapsamlı açıklık olmuştur değil hipoksi veya besin açlık olduğu gibi. Tümör dokusunda pHe yaklaşık pH 6.84,5ulaşan asidik hale gelebilir. Asidik pH aerobik ve anaerobik glycolytic atılımı proton (H+) doğar ve laktat Proliferasyona kanser tarafından5,6hücreler.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda ortaya o asidik pHe kaynaklı Histon deasetilasyonu, yağ asidi oksidasyon ve ağır asidik ortamı7,8,9,10adaptasyon için asidik organellerin ekzositozu. Ancak, mekanizmalar aracılığıyla hangi hücre dışı asitleştirme kanser davranış ve düzenleyiciler asidik pH tümör microenvironment içinde tam olarak tespit anahtar kimliğini etkiler. Ayrıca, çeşitli raporlar bikarbonat, Tris, borular ve HEPES tampon veya laktat ve HCl belirsiz konsantrasyonları kullanarak çeşitli asidik pH medya açıklanan, ancak kararlılığını ayarlanan orta ne de kapsamlı göstermek için birkaç rapor vardır: birkaç farklı asidik kültür media7,8,9,10 karşılaştırılması
Anahtar düzenleyiciler ve kanser hücrelerinin hücre dışı asitleştirme bağlamında metabolik değişiklikler aydınlatmak için kurulan bir asidik pHe korumak için basit vitro kültür manken ve pHe kanser hücreleri11' deki rolü inceledi. Bu yöntemi kullanarak, biz tutulan 37 ° c altında %5 6,8 pHe ile asidik bir kültür orta düşük bikarbonat konsantrasyonu kültür ortamı kullanarak CO2. pH 7.4 normal olarak kullanılan ve orta kontrol. Orta pH en az 24 saat sürekli ve 72 h PANC-1 ve AsPC-1 pankreas kanseri hücre kültür sırasında yavaş yavaş azaldı. Gelişmiş Glikoliz sadece da laktat7,8,9proton atılımı hızlandırır çünkü aynı zamanda asidoz laktat kaynaklı yerine laktat ekleme azaltarak tarafından taklit eden bir kültür yöntemi kurdu bikarbonat konsantrasyonu. Ayrıca, HCl kaynaklı asidik pHe orta asidik pH kültür ortamına hücresel yanıt bikarbonat azaltılmış bir konsantrasyon nedeniyle değildir olasılığını dışlamak için bize izin verir. Ayrıca, 6.4-7,4 farklı bikarbonat konsantrasyonu ile pH ile çeşitli medya kullanarak, biz ölçüde hücresel yanıt pHe efektleri değerlendirebilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı" Nissui" 2</td><td>Nissui</td><td>05919</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin çözeltisi</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Karışık Çözelti (Stabilize)</td> <td>Nacalai</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Çözeltisi, Fenol Kırmızısı ile</td><td>Nacalai</td><td>32778-05</td><td></td></tr><tr><td>%0.5-Tripan Mavi Leke Çözeltisi</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>Laktik asit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Birinci İplikli Sentez Sistemi</td><td>Thermo Fisher</td><td>18091</td><td></td></tr><tr><td>Güç SYBR Yeşil PCR Master Karışımı&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4368702&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Adı</td><td>Company</td><td> Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td> Hücre hatları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>ASPC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr><tr><td>KMS-6</td><td>JCRB Hücre Bankası</td><td></td><td></td>JCRB0432</tr><tr><td>TIG</td><td>JCRB Hücre Bankası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC9</td><td>ATCC</td><td>CCL-212</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Equipment</ Wi-Fi</td> Thermo Fisher ND-ONE-W QuantStudio 5 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi Thermo Fisher CRL-1682 ile güçlü ><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Bir Mikro Hacimli UV-Vis Spektrofotometresi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bir hücre dışı asidik ph kültür sistemi kurulması

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Hipoksi veya besin açlık gibi tümör microenvironment şartları kanser ilerlemesi ve malignite kritik rol oynarlar. Ancak, asidik ekstrasellüler pH tümör saldırganlık ve onun altında yatan mekanizma rol kapsamlı hipoksik veya besin açlık koşulları ile karşılaştırıldığında araştırılmamıştır. Buna ek olarak, asidik ekstraselüler tümör microenvironment taklit etmek için iyi tanımlanmış kültür yöntemi tam olarak bildirilmemiştir.
Burada asidik ekstrasellüler pH kullanarak bikarbonat ve artan laktat veya HCl konsantrasyonu kültür orta azaltılmış korumak için basit vitro kültür yöntemi mevcut. Orta pH en az 24 saat sürekli ve yavaş yavaş 72 kültür PANC-1 ve AsPC-1 pankreas kanseri hücrelerinin takip h tarafından azalmıştır. Bu çalışmada üç ayrı asidik ortam koşullarında son derece hipoksi ya da besin açlık. MSMO1, INSIG1ve IDI1 gibi upregulated pH-yanıt veren genler göre Bu genlerin upregulation asidik pH bir işareti olarak kullanılabilir. Bu basit teknikler asidik tümör microenvironment altında tümör malignite temel mekanizmaları aydınlatmak yararlıdır. Bu nedenle, hücre dışı asidik pH kültür sistemimiz hücresel asidik pH yanıt sadece kanser hücrelerinin zamanda kadar asidik diğer bozukluklar da dahil olmak üzere, Diyabetik ketoasidoz ile ilgili olarak renal tübüler hücreler gibi Primer hücre keşfi sağlar, Laktik asidoz, renal tübüler asidoz ve solunum asidozu.

Uygun bikarbonat konsantrasyonu belirlemek için DMEM aralığı 0 - 8 mM NaHCO3 (kültür orta son konsantrasyonu) hazırlanmış ve 6.4-7.4 (şekil 1) arasında değişen pH ile Kültür medya hazırlanmasında başarılı oldu. DMEM ile 8 mM NaHCO3 (pH 7,4) olarak bir denetim orta ve asidik pH ile 2 mM NaHCO3 (pH 6.8) bir ortam olarak ekstrasellüler pH pH 6.8 solid tümör4,5için ulaşır ...

Asidik tümör microenvironment tümör ilerlemesinde önemli rol oynar. Kanser hücreleri in vitro olarak asidik ekstrasellüler pH etkilerini değerlendirmek için basit asidik kültür sistemleri kuruldu.

Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Bu basit in vitro kültür yönteminin genel amacı, asidik bir tümör mikroçevresi altında tümör malignitesinin altında yatan mekanizmaları aydınlatmaktır. Bu yöntem, tümör biyolojisi alanında, kanser ilerlemesinin altında yatan mekanizma ve tümör mikroçevresine yanıt olarak malignite gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajları, ortam pH'ının stabilitesi ve birkaç asidik pH ortamını karşılaştırma yeteneğidir.Bu tekniğin anlamı sadece kanserin tedavisine değil, aynı zamanda asidik bozuklukların tedavisine de uzanıyordu, çünkü asidoz çeşitli hastalık türleriyle ilişkili olabilir. Başlamak için, 4.75 gram DMEM gücünü 500 mililitre suda L-glutamin ile çözün. Ayrıca basınç geçirmez bir şişede 0.33 molar sodyum bikarbonat çözeltisi hazırlayın.Ortamı ve çözeltiyi otoklavlayın. Bu tamponların 25 santigrat dereceye kadar soğumasına izin verdikten sonra, bikarbonatsız 500 mililitre DMEM'e beş mililitre 200 milimolar L-glutamin, beş mililitre penisilin-streptomisin ve 50 mililitre fetal sığır serumu ekleyin. Bir kontrol ortamı için, bikarbonatsız 100 mililitre DMEM başına 2.4 mililitre 0.33 molar sodyum bikarbonat çözeltisi ekleyin.Düşük pH'lı ortam için, bi

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mikrobiyal ökaryotlarda hem kalıcı buz kaplı Antarktika göllerde fotosentetik kaynaklı karbon ve en yırtıcı türlerinin bir kaynağıdır. Bu rapor, Antarktika gölü Bonney gelen metabolik olarak çok yönlü mikrobiyal ökaryotlar izole etmek için bir zenginleşme kültür yaklaşımı açıklar ve Ribuloz-1 ,5-bisphophate karboksilaz oksijenaz (RUBISCO'nun) faaliyeti için bir radyoizotop testi kullanılarak inorganik karbon fiksasyonu potansiyeli değerlendiriyor.

Karbon Fiksasyon Potansiyel bir Kimyasal Tabakalı Antarktika Gölü ve Ölçme Mikrobiyal Ökaryotik Zenginleştirme Kültürlerinin Kurulması

Bu makale, mantar virülans mekanizmaları hakkındaki bilgimizi ilerletmek için yararlı bir araç olacak olan fakültatif bir hücre içi insan mantar patojeni Candida glabrata'nın insan makrofajları ile etkileşimini incelemek için bir in vitro hücre kültürü model sistemi oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir.

İnsan THP-1 Makrofajlarında Candida glabrata'nın Hücre İçi Davranışını İncelemek İçin İn vitro Sistemin Kurulması

Bakteriler yaşamları boyunca zararlı veya faydalı mutasyonlar biriktirebilir. Bir hücre popülasyonunda, yararlı mutasyonlar biriktirmiş bireyler, arkadaşlarını hızla geride kalabilir. Burada, floresan etiketli bireyleri kullanarak zaman içinde bakteri hücresi popülasyonunda tür içi rekabeti görselleştirmek için basit bir prosedür sunuyoruz.

Floresan Etiketli Suşların Cocultivation'ı ile Bakteri Hücre Popülasyonunda İntraspecies Rekabetini İzleme

Bu makalenin ilk bölümü, plazma zarlarında veziküler Na+/H+ değiştiricileri eksprese eden mutant hücre hatlarının nasıl seçileceğini gösterir. İkinci bölüm, bu değiştiricilerin iyon seçiciliğini ve kinetik parametrelerini belirlemek için kullanılan hücre içi pH ölçümlerine ve hızlı iyon alımına dayalı protokoller sağlar.

Na fonksiyonel karakterizasyonu<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Seçim Proton-öldürme Kullanma hücre içi Bölmeler ve Eşanjörleri Plazma Membran Them Express

Glikoliz, çoklu biyolojik sistemlerde tanımlayıcı bir metabolik belirteçtir. H + hücre dışı akışını ölçerek glikolizin izlenmesi yaygındır, ancak kantitatif ve açık olması için düzeltme gerektirir. Burada, hücre dışı asitlenmenin solunum ve glikolitik kaynaklarını ayırt etmek için hücre dışı akı verilerinin nasıl toplanacağını ve düzeltileceğini gösteriyoruz.

Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

Gut ana bilgisayar-mikrop etkileşimleri sentetik bir sözlü topluluk, vitro gastrointestinal sindirim ve ince bağırsak epitel modeli birleştirerek yeni bir yaklaşım kullanarak değerlendirildi. Biz hücre istilası patojenler ve çoklu türler biyofilmler değerlendirmek veya bile probiyotik formülasyonları Beka sınamak için adapte edilebilir bir yöntem mevcut.

Sentetik bir bakteriyel konsorsiyum Vitro Gut ana bilgisayar-mikrop arabirimde canlılık değerlendirilmesi

Burada biz hazırlamak ve medaka (Oryzias latipes) birincil hipofiz hücre kültürleri korumak için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş koşullarda sıcaklık, osmolalite ve pH gibi önemli parametreleri göz önünde bulundurun fizyolojik şartlarda, böylece fizyolojik olarak daha anlamlı sonuçlar etkinleştirme balık, taklit ederek.

Balık Pituitaries bir yüksek kaliteli birincil hücre kültürü hazırlanması

Diş plaklarını filtre ederek ve konak bakterilerle birlikte kültleştirerek, saccharibacteria adlı yeni bakteriyel fitülümün yetiştirilmede zor olan üyelerini izole etmek için bir yöntem gösteriyoruz.

Ağız Boşluğundan Simbiyotik Sakkarakterinin Kararlı İkili Kültürlerinin Kurulması

Burada, inkübatör olarak düşük maliyetli, enerji verimli tezgah üstü termomikserler kullanan termofillerde adaptasyon için deneysel bir evrim protokolü sunuyoruz. Teknik, 75 °C'lik optimum büyüme sıcaklığına sahip bir arkeon olan Sulfolobus acidocaldarius'ta sıcaklık adaptasyonunun karakterizasyonu yoluyla gösterilmiştir.

Yaşamın Uç Noktalarında Adaptasyon: Ekstremofil Archaeon Sulfolobus acidocaldarius ile Deneysel Evrim

Burada, üç elektrotlu, iki odacıklı bir biyoelektrokimyasal sistem kullanarak laktik asit bakterilerinde aracılı hücre dışı elektron transferini (EET) karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemi Lactiplantibacillus plantarum ve redoks aracısı 1,4-dihidroksi-2-naftoik asit ile gösteriyoruz ve aracılı EET'yi değerlendirmek için kullanılan elektrokimyasal tekniklerin kapsamlı bir tanımını sunuyoruz.

Laktik Asit Bakterilerinde Üç Elektrotlu, İki Odacıklı Biyoelektrokimyasal Sistem ile Aracılı Hücre Dışı Elektron Transferinin Karakterize Edilmesi

Öğrenin, asidik tümör mikroçevresinde kanser hücrelerinin davranışlarını incelemek için hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurma yöntemini. Bu teknik, tümör biyolojisi ve asidozla ilişkili hastalıklarda tedavi stratejileri geliştirmeye katkı sağlar.

Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Daha fazla video keşfet