CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Bu prosedürün genel amacı, in utero elektroporasyon yoluyla Cre-Lox rekombinasyonunu indükleyerek fare serebral korteksinde genetik bir mozaik oluşturmaktır. Genetik mozaikler üretmenin bu yöntemi, nörobiyolojideki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Belirli bir nöronal fenotip için hücre özerk bir şekilde bir genin gerekli olup olmadığının belirlenmesi gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, etkili Cre-Lox rekombinasyon sisteminin, utero elektroporasyonda eşit derecede etkili bir gen verme tekniği ile birleştirilmesidir. Bu yöntem iki-üç kortikal nöronları hedeflemeye odaklanmış olsa da, diğer kortikal tabaka derinliklerindeki nöronları hedeflemek için kullanılabilir. Beyin dokumuzda genetik mozaikler yapmaya çalıştığımızda, deney hayvanlarımızın doğumdan sonra hayatta kalmalarını sağlamada çeşitli problemlerle karşılaştık, bu yüzden tekniğimize çeşitli basitleştirmeler ve iyileştirmeler getirdik.

Embriyonik kök hücre enjeksiyonu veya nükleer transfer için tipik olan çok uzun konik ve çok ince uçlu bir pipet hazırlayın, önce cam kılcal damarı pipet çekiciye yerleştirerek. Kelepçeleri sabitledikten sonra, programı çekme protokolüne etkinleştirin ve cam kılcal damar üzerinde bir konik oluşturun. Bileşik ışık mikroskobu kullanarak konik uzunluğun 10 ila 15 mm arasında olduğundan emin olun.

Ardından, pipetin ucunu kırmak için tek katlı bir görevi 50 mL'lik bir beherin üzerine silin ve bir elinizle gergin bir şekilde gerin. Diğer elinizle, çekilen pipeti, konik tarafı aşağı bakacak şekilde, mendilin ortasından dik olarak itin ve koniklikte temiz bir kırılmaya neden olun. Bileşik ışık mikroskobu altında açıklığın boyutunu kontrol edin.

Ardından, kısmen doldurulmuş bir pipete 1 mcL %0,4 Tripan mavisi ve PBS aspire ederek pipeti kalibre edin ve pipetteki 1 mcL yüksekliğine bağlı olarak pipeti 1 mcL işaretleriyle mezun edin. Atmadan önce çekilen diğer pipetleri çıkarmak için kalibre edilmiş pipeti kullanın. Pipetleri pipet yuvasına toz ve diğer parçacıklardan arındırın.

E-15.5'te hamile bir fareyi derinlemesine uyuşturduktan sonra, indüksiyon odasını hafifçe eğerek ve farenin tepkisini not ederek doğru refleksi test edin. Doğrultma refleksi yoksa, fareyi cerrahi hazırlık alanına aktarın ve cerrahi bir anestezi düzlemini korumak için bir burun konisinden solunan izofluran uygulayın. Anesteziyi doğrulamak için pedal refleksini test etmek için forseps kullanın.

Çaba sarf ederken solunum hızını izleyin, derin, düzenli nefes almayı ve mukoza zarının pembe renkli ve nemli olduğunu arayın. Kurumaya karşı koruma için gözleri tamamen kaplayacak kadar veteriner oftalmik merhem sürün. Tüy dökücü kremi, karın kürkü eriyene kadar pamuklu çubuklarla karın bölgesine masaj yapın.

Sonra karın kürkünü silin. Kalan kalıntıları ve tüy dökücü kremi %70 etanol ve pamuklu çubuklarla dikkatlice temizleyin. İyot bazlı ovma solüsyonunu karın bölgesine dairesel hareketlerle uygulayın.

Daha sonra cerrahi alanı izole etmek ve steril koşulları korumak için cerrahi bir örtü kullanın. Deride 2 cm'lik bir ventral orta hat insizyonu yaptıktan sonra, rektus abdominisin orta hattını görselleştirmek için linea alba'yı bulun. Kası karından yukarı ve uzağa çekin ve aseptik teknikler kullanarak karın boşluğunu ortaya çıkarmak için 2 cm'lik bir orta hat kesisi yapın.

Steril bir 10 mcL mikropipet ucu kullanarak, analjezi için karın boşluğuna carprofen dağıtın. Daha sonra, rektus abdominis insizyonunun sol kenarına bir Hartmann sivrisinek forsepsini sıkıştırın. Forsepsleri, insizyonun sol tarafını açık tutarak, insizyonun solundaki devrilmiş Petri kabına yerleştirin.

Kesinin sağ tarafını da benzer şekilde sıkıştırdıktan sonra, kesi alanının etrafına gazlı bez süngeri yerleştirin. Bağlı bir limit vidası olmayan halka forseps kullanarak, herhangi iki komşu embriyo arasındaki uterusu herhangi bir dokuyu ezmeden veya yaralamadan çekin. Tüm embriyoları kesiden çıkarmaya başlayın ve gazlı bez süngerinin üzerine koyun.

Aspiratör tüpü düzeneğine kalibre edilmiş bir pipet bağlayın ve rahim duvarından hazırlanan tam olarak 1 mcL DNA solüsyonunu her embriyonun lateral ventrikülüne enjekte edin. Embriyoları manipüle etmek için başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanın ve enjeksiyon sırasında embriyoların rahim duvarına nazikçe itilmesine izin verin. Lateral ventriküller, embriyonun dorsal telensefalonu üzerinde iki koyu yama olarak görünür.

Lateral ventrikülü dolduran Tripan mavisini gözlemleyerek enjeksiyonun başarılı olduğunu onaylayın. Tüm embriyoları enjekte ettikten sonra, görsel korteksi hedeflemek için cımbız tipi elektrotların katotunu uterusa, doğrudan medial ve kaudal korteksin üzerine yerleştirin. Anodu embriyonun başının hemen altına ve önüne yerleştirin.

Ayak pedalıyla, 550 ms'lik bir aralıkla ayrılmış 50 voltluk 950 ms'lik darbelerin verilmesini tetikleyin. Tüm embriyoları elektropore ettikten sonra, uterusu bulunduğu oryantasyonda karın boşluğuna geri getirin. Rahmi yağlamak için tuzlu su kullanın, manuel ve son derece nazik bir şekilde yönlendirirken, embriyoları rahimdeki konumlarından çıkarmamaya dikkat edin.

Karın kaslarını emilebilir dikişlerle kapatın. Uçları bir cerrah düğümü ile bağlayarak basit bir kesikli dikiş kullanın. Cilt tabakasını emilebilir dikişlerle kapatın.

Yarayı kapatmak için az miktarda doku yapıştırıcısı sürün. Çözülmeyi önlemek için düğümlere doku yapıştırıcısı sürün. Yarayı çevreleyen ve aspire edilebilecek herhangi bir doku yapıştırıcısını çıkarmak için bir mikropipet kullanın.

Doku yapıştırıcısı kuruduktan sonra, hayvanı izoflurandan çıkarın ve dişinin ılık bir kafeste tek başına iyileşmesine izin verin. Tamamen iyileşene ve normal davranana kadar fareyi izlemeye devam edin. Çıkarıldıktan sonra, dişiyi erkekle birlikte kafese geri koyun.

Kafatasını 1 x PBS ile nemlendirilmiş tek katlı görev mendilleri ile düz bir yüzeye yerleştirin. Cımbız kullanarak önce oksipital kemiği çıkarın. Daha sonra parietal kemikleri dikkatlice çıkarın, cımbızı beynin yüzeyinden ve dışından çıkarın.

Kortekse zarar vermemek için meninksleri dikkatlice çıkarın. Kraniyal sinirleri koparmak ve beyni çıkarmak için cımbızın arkasını beynin altına kafatası boyunca sıkıştırın. Bregmaya yaklaşık 0,5 mm rostral koronal kesim yapmak için tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanın ve ilgilenilen dokuya yaklaşık 0,5 mm kaudal başka bir koronal kesim yapın.

Doku bloğu artık kesit almaya hazırdır. 1 mcL 2 mg / mL GFP Cre enjeksiyonu, bazıları parlak olabilen etiketli hücrelerin seyrek dağılımına neden olur. Doku 100 mikronda kesitli olduğundan, dendritik direklerin çoğu korunur.

İn utero elektroporasyon embriyonik gün 15.5'te gerçekleştirildiğinde, iki ve üç kortikal tabakalar boyunca etiketleme meydana gelir. Dendritik dikenler yüksek büyütmelerde gözlenebilir. 1.5 mcL 2 mg / mL GFP Cre enjeksiyonu, nöritlerin ve dendritik dikenlerin kaynağını izlemek zor olduğu için yetersiz olabilen çok yoğun etiketleme ile sonuçlanır.

Bununla birlikte, etiketli alanın çevresinde parlak bir hücre seçerek, bir nöronu ve süreçlerini görüntülemek hala mümkündür. Alternatif olarak, SuperNova yapılarının enjeksiyonu, çok parlak bir şekilde etiketlenmiş iki-üç nöronların seyrek bir dağılımına neden olur. Bir kez ustalaştıktan sonra, utero elektroporasyon ameliyatı, uygun şekilde yapılırsa 30 dakikadan az sürecektir.

Bu prosedürü diğer DNA yapılarıyla denerken, farklı konsantrasyonları ve hacimleri denemeyi unutmamak önemlidir, bu, mozaik analizi için gerekli olan istenen etiketleme seyrekliğinin elde edilmesine yardımcı olacaktır. Temsili sonuçlarımız ya tek bir yapı ya da yakın zamanda icat edilen SuperNova yapısını kullandı. İkincisinde, nöronların parlaklığını en üst düzeye çıkarırken mükemmel seyrek etiketleme elde edebileceğimizi bulduk.

Bu teknik, mozaik beyin dokusunu başka şekillerde oluşturmak için uyarlanabilir. Örneğin, CRISPR ve Cas9 gen düzenlemesi, utero elektroporasyon ile birleştirilebilir veya Cre-Lox rekombinasyonu, viral vektörlerin intraventriküler enjeksiyonu ile birleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, seyrek bir genetik mozaik elde etmek için kullanılan birkaç basitleştirilmiş ve rafine tekniği iyi anlamış olmalısınız, böylece Cre-Lox rekombinasyonunu ve utero elektroporasyonu bir araya getirebilirsiniz.

Size iyi şanslar dileriz.