N-metil-D-Aspartat (NMDA) reseptör karşı antikor kanında tespit etmek için basit hücre tabanlı ayirt tahlil

Bu testin genel amacı, otoimmün ensefalit şüphesi olan hastaların kanındaki NMDA reseptörüne karşı otoantikorları tespit etmektir. Ölçüm, akut nöro-psikiyatrik semptomları olan hastaların ayırıcı tanısında anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, basit ve güvenilir bir tarama önlemi olmasıdır.

Jelatin kaplı kültür plakaları hazırlayarak bu işleme başlayın. 48 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna 200 mikrolitre% 2 jelatin çözeltisi ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede en az 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, jelatin çözeltisini kuyulardan aspire edin.

Her bir oyuğa 5 kez 10 ila 4. HEK293 hücrelerine% 10 FBS içeren 200 mikrolitre hücre kültürü ortamında tohumlayın. Plakayı% 5 karbondioksit ile beslenen nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, her bir oyuktaki kullanılmış kültür ortamını% 10 FBS içeren 200 mikrolitre taze kültür ortamı ile değiştirin.

Deneydeki toplam kuyu sayısına göre ölçeklendirerek, NR1-GFP plazmidini kültür ortamı ile karıştırarak çözelti A'yı hazırlayın. Transfeksiyon reaktifini kültür ortamı ile karıştırarak çözelti B'yi hazırlayın. Çözelti A ve çözelti B'yi karıştırarak ve karışımı oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe ederek C çözeltisini hazırlayın.

Daha sonra, HEK293 hücrelerini içeren her bir oyuğa 40 mikrolitre C çözeltisi alikot edin. Plakayı nazikçe döndürün ve plakayı gece boyunca %5 karbondioksit ile sağlanan nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücre bazlı immünofloresan testine geçmeden önce, konakçı hücrelerde NR1-GFP rekombinant proteininin ekspresyonunu 40 kat ila 200 kat büyütme ile floresan mikroskop altında kontrol edin.

Bu teste başlamak için, önce harcanan ortamı kültür plakasının oyuklarından aspire edin ve ardından her bir kuyucuğu üç kez 200 mikrolitre PBS ile yıkayın. Her oyuğa 200 mikrolitre% 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Paraformaldehit çözeltisini kuyucuklardan aspire edin ve her kuyucuğu üç kez 200 mikrolitre PBS ile yıkayın.

Daha sonra, her bir oyuğa PBST çözeltisinde 200 mikrolitre% 10 yağsız süt ekleyin ve plakayı bir saat boyunca hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında inkübe edin. PBST çözeltisindeki %10'luk yağsız sütü kuyulardan aspire edin ve kuyuları bir kez 200 mikrolitre PBST ile yıkayın. Kuyucukları, birincil antikor olarak PBST'de bir ila 100 oranında seyreltilmiş plazma ile inkübe edin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe çalkalayın.

Bir saat sonra, seyreltilmiş plazmayı kuyucuklardan aspire edin ve her bir kuyucuğu üç kez 200 mikrolitre PBST ile yıkayın. Her bir oyuğa, Alexa Fluor 594 ile konjuge edilmiş 200 mikrolitre keçi anti-insan IgG ekleyin ve kültür plakasını bir saat boyunca hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, Alexa Fluor 594 çözeltisi ile konjuge edilmiş keçi anti-insan IgG'yi aspire edin ve her bir kuyuyu üç kez 200 mikrolitre PBST ile yıkayın.

Üçüncü PBST yıkamasından sonra, her bir oyuğa DAPI içeren 100 mikrolitre gliserol çözeltisi ekleyin. Her boya için doğru filtreyi ve dört kez, 10 kez ve 20 kez objektifli 10 kez göz merceği kullanarak hücreleri floresan mikroskop altında gözlemleyin ve görüntüleyin. Transfeksiyondan 24 ila 30 saat sonra çekilen bu temsili görüntüler, NR1-GFP'yi eksprese eden HEK293 hücrelerini göstermektedir.

Hücrelerin yaklaşık% 30'u floresan mikroskobu altında yeşil sinyale sahipti. İlgili Alexa Fluor 594 görüntülerinde, panel B'deki kırmızı sinyal, anti-NMDA reseptör otoantikorlarının HEK293 hücrelerinde eksprese edilen NR1'e bağlandığını gösterir. Panel E'deki zayıf kırmızı sinyal, Alexa Fluor 594 görüntülerinin arka plan gürültüsünü gösterir.

NR1-GFP'yi eksprese eden hücreler, bir insan plazma örneğinde anti-NMDA reseptör otoantikorlarının varlığını taramak için kullanıldı. Bu birleştirilmiş görüntülerde sarı renk, NR1-GFP ve anti-NMDA reseptör otoantikorlarının kolokalizasyonunu gösterir. Oklar, belirgin kolokalizasyona sahip hücre örneklerini gösterir.

Yeşil ve kırmızı sinyallerin %30'dan fazla örtüşmesini gösteren bir plazma örneği bu durumda pozitif olarak yorumlanacaktır. Negatif kontrolün birleştirilmiş görüntüsünde, anti-NMDA reseptörü otoantikorlarının testte NR1-GFP'ye spesifik bağlanmasını doğrulayan yeşil ve kırmızı sinyallerin çok az örtüşmesi vardır. Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa teknik dört saat içinde yapılabilir.

Bu tekniği denerken, bunun sadece bir tarama önlemi olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu prosedürleri takiben, pozitif vakaların özgüllüğü gibi ek soruları yanıtlamak için western blot analizi ve doku bazlı analiz gibi diğer önlemler alınabilir. Geliştirildikten sonra teknik, psikiyatri alanındaki araştırmacıların akut ruh sağlığı acil durumu olan hastaların ayırıcı tanısını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, kandaki NMDA reseptörüne karşı otoantikorları taramak için testin nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.