Name: N-metil-D-Aspartat (NMDA) reseptör karşı antikor kanında tespit etmek için basit hücre tabanlı ayirt tahlil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Öğrenin, HEK293 hücreleri kullanarak NMDA reseptörüne karşı otoantikorları tespit etmek için basit bir hücre tabanlı ayırma yöntemi. Bu güvenilir tarama tekniği, otoimmün ensefalit tanısına yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser Chang Gung tıbbi Vakfı (grant numarası CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 ve CMRPG3E0633) tarafından desteklenmiştir.

Çalışma kurumsal inceleme kurulu, Chang Gung Memorial hastanede Linkuo, Taoyuan, Tayvan (102-2577A3) tarafından kabul edildi.
1. NR1-GFP ifade plazmid hazırlanması
<ol><li>NR1-GFP plazmid Mix 10 ng ile 100 µL Escherichia coli yetkili hücreleri zorlanma DH5α steril bir 1,5 ml tüp, damlalıklı karışımı yavaşça kadar santrifüj kapasitesi ve aşağı 4 - 6 kez ve buz için 20 dk metroyla kuluçkaya.</li>
	<li>Tüp bir su banyosunda 1 dk 42 ° C'de kuluçkaya, su banyosundan tüpü çıkarması, 1 mL lysogeny suyu (LB) orta tüpün içine ekleyin ve tüp 37 ° c için 1 h sallayarak ile bir kuluçka kuluçkaya.</li>
	<li>50 µL Ampisilin (0.1 mg/mL) içeren bir LB agar plaka üzerine karışımı spread ve LB agar plaka bir kuluçka 37 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Bir koloni steril ucu kullanarak gecede LB agar plaka almak ve belgili tanımlık uç girdap bir 5 mL LB orta ve Ampisilin (0.1 mg/mL) de içeren bir bakteri kültürü tüp. Gecede sallayarak ile bir kuluçka 37 ° C'de tüp kuluçkaya.</li>
	<li>Aliquot 3 mL 250 mL steril LB orta ve Ampisilin (0.1 mg/mL) içeren bir 500 mL şişe içine gecede bakteri kültürü. Şişeye 37 ° C'de sallayarak ile kuluçkaya. Dalga boyu 600 adlı bakteri kültürü optik yoğunluk (OD) düzenli olarak kontrol OD600 0,6-1.0 ulaşıncaya kadar bir Spektrometre kullanılarak nm. Not: gece bakteriyel kültürünün de 800 µL gliserol hisse senedi hazırlamak ve gliserol hisse senedi altında-80 ° C ileride kullanmak üzere saklamak için 200 µL gliserol ile karıştırın.</li>
	<li>Nr1-GFP ifade plazmid ile 250 mL bakteriyel kültür hazırlamak<ol>
<li>Santrifüjü 6.000 x g 4 ° C'de 15 dakika de tarafından hücreleri toplamak</li>
		<li>Bakteri Pelet RNase A içeren 10 mL resuspension arabellekte resuspend; hiçbir yığın iyice görmüş kadar girdap.</li>
		<li>10 mL lizis arabellek bakteriyel süspansiyon eklemek, hafifçe karışım 4 - 6 kez ters ve lysate, oda sıcaklığında (RT) 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>10 mL önceden soğutulmuş yağış arabellek için lysate ekleyin, 4 - 6 kez karışımı yavaşça tersine çevirin.</li>
		<li>Lysate kapaklı bir filtre kartuşu varil içine dökün; RT, 10 dk bekleyin</li>
		<li>Kartuş çıkış meme kapağını çıkarın, bir dalgıç kartuşu takın ve pistonu hafifçe bastırın. Filtre uygulanmış toplamak bir 50 mL tüp içine lysate.</li>
		<li>Tüpü yaklaşık 10 kat ters çevirme tarafından karışımı karıştırın ve karışımı 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya 2.5 mL özel arabelleğe üretici süzülmüş lysate ekleyin.</li>
		<li>Filtre uygulanmış lysate karışımı ile 10 mL denge tampon ön dengelenmiş bir filtre sütun uygulanır. Yerçekimi tarafından boşaltmak sütun izin.</li>
		<li>Sütun 30 mL yıkama arabellek ile iki kez yıkayın, sonra 15 mL elüsyon tampon kullanarak sütundan DNA elute.</li>
		<li>10.5 mL (0.7 birimler) isopropanol eluted DNA arabelleğe ekleyin, karıştırın ve 20.000 x g 4 ° C'de 30 dk için karisimin santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Süpernatant özenle dikkatle boşaltmak, DNA Pelet 5 mL endotoksin-Alerjik % 70 etanol ile bir kez yıkama ve 20.000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant dikkatle boşaltmak, 5-10 dk bir kimyasal başlıklı Pelet Makinası ve 300-500 µL endotoksin-Alerjik arabelleği Pelet geçiyoruz.</li>
		<li>Belgili tanımlık eriyik vasıl bir Spektrofotometre kullanarak UV 260/280 nm emilimini ölçerek plazmid konsantrasyonu belirlemek. Not: ifade plazmid aynı iletişim kuralını kullanarak GFP hazırlık.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. transfection HEK293 hücre NR1-GFP ifade plazmid ile
<ol><li>Aliquot 200 µL % 2 jelatin çözüm her bir 48-şey kültür tabak iyi ve plaka için en az 30 dk. 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>200 µL % 10 fetal sığır serum (FBS) her iyi içeren hücre kültür ortamının iyi ve tohum 5 x 104 HEK293 hücrelerinde jelatin çözümden Aspire edin. Gecede %5 CO2 ile sağlanan bir oksijen kuluçka 37 ° C'de plaka kuluçkaya. Not: Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayıldı.</li>
	<li>Ertesi gün, taze kültür orta % 10 içeren 200 µL ile harcanan kültür orta yerine FBS iyi başına.</li>
	<li>Her, tek şey, hazırlamak çözüm A 100 karıştırılarak NR1-tGFP plazmid 20 µL kültür orta ve 0.8 µL transfection reaktif 20 µL kültür orta ile karıştırma tarafından çözüm B ng. Toplam hacim her deneme için hazırlamak için gerekli olan kuyu sayısını çarpın.</li>
	<li>Çözüm C çözüm A ve çözüm B karıştırarak hazırlayın ve RT karisimin 20-30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Her şey HEK293 hücreleri içeren için çözüm C aliquot 40 µL plaka yavaşça girdap ve plaka gecede %5 CO2 ile sağlanan bir oksijen kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Ifade NR1-GFP rekombinant protein 40 X-200 X büyütme ile floresan mikroskop altında ana bilgisayar hücrelerdeki kontrol (uyarma/emisyon: 482/502 nm) ve hücre tabanlı ayirt tahlil için devam edin. Not: aynı iletişim kuralını kullanarak HEK293 hücre içine ifade plazmid GFP Transfect.</li>
</ol>3. hücre tabanlı ayirt tahlil
<ol><li>Kuyulardan harcanan orta Aspire edin, sonra yıkama her şey ile fosfat 200 µL serum fizyolojik (PBS) üç kez arabelleğe alınmış.</li>
	<li>Her şey için 200 µL % 4 paraformaldehyde çözüm ekleyin; RT plaka 15dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Paraformaldehyde çözüm kuyulardan Aspire edin ve her yıkama PBS 200 µL ile üç kez iyi.</li>
	<li>PBST içinde 200 µL % 10 yağsız süt ekleyin (% 0,1 ara-20 PBS) her şey ve RT plaka nazik sallayarak ile 1 h için kuluçkaya çözüm.</li>
	<li>% 10 yağsız süt kuyudan PBST çözümünde Aspire edin, sonra 200 µL PBST Wells'le bir kez yıkayın.</li>
	<li>Nazik RT için 1 h sallayarak ile birincil antikor olarak seyreltilmiş plazma (1: 100 PBST içinde) Wells'le kuluçkaya. Not: Otoimmün beyin iltihabı için şüpheli hastaların kan plazma elde edilir.</li>
	<li>Kuyulardan seyreltilmiş plazma Aspire edin ve her yıkama PBST 200 µL ile üç kez iyi.</li>
	<li>Keçi Anti-insan IgG Alexa Fluor 594 (1:1, 000 seyreltme PBST) ile her şey için Birleşik 200 µL ekleyin ve nazik için 1 h sallayarak ile kültür plaka RT, kuluçkaya.</li>
	<li>IgG Birleşik Alexa Fluor 594 Çözümle keçi Anti-insan Aspire edin ve her yıkama PBST 200 µL ile üç kez iyi.</li>
	<li>100 µL gliserol çözüm (PBS ve 1:100,000, 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) % 50 gliserol) her şey için ekleyin.</li>
	<li>Gözlemlemek ve hücreleri kullanarak bir 10 X mercek ve 4 X, 10 X ve 20 X hedefleri floresan mikroskop altında görüntü. Not: her boya için doğru filtre kullanın: NR1-GFP için (uyarma/emisyon 482/502 = nm), Alexa Fluor 594 için (uyarma/emisyon 561/594 = nm), DAPI için (uyarma/emisyon 358/461 = nm). GFP aynı şekilde ifade HEK hücreleri kullanarak negatif kontrol kuralları.</li>
</ol>

<ol><li>Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+surface+antibody-mediated+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis.</a> Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).</li>
<li>Lancaster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+and+treatment+of+autoimmune+Encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis.</a> J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Pruss, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+analysis+of+NMDA+receptor+antibodies+in+encephalitis+of+unknown+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin.</a> Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).</li>
<li>Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Autoimmune encephalopathies.</a> Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).</li>
<li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+an+observational+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).</li>
<li>Chapman, M. R., Vause, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+diagnosis%2C+psychiatric+presentation%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment.</a> Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).</li>
<li>Gable, M., Glaser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+encephalitis+appearing+as+a+new-onset+psychosis%3A+disease+course+in+children+and+adolescents+within+the+california+encephalitis+project%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project.</a> Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).</li>
<li>Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+experience+and+laboratory+investigations+in+patients+with+anti-NMDAR+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis.</a> Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).</li>
<li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-D-aspartate+antibody+encephalitis%3A+temporal+progression+of+clinical+and+paraclinical+observations+in+a+predominantly+non-paraneoplastic+disorder+of+both+sexes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes.</a> Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).</li>
<li>Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+antibody+encephalitis%3A+performance+evaluation+and+laboratory+experience+with+the+anti-NMDA-receptor+IgG+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay.</a> Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).</li>
<li>Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+glutamate+receptor+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes.</a> Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).</li>
<li>Ramberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+diagnostic+accuracy+of+microscopy+and+flow+cytometry+in+evaluating+n-methyl-d-aspartate+receptor+antibodies+in+serum+using+a+live+cell-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay.</a> PLoS One. 10 (3), e0122037(2015).</li>
<li>Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+a+severe%2C+multistage%2C+treatable+disorder+presenting+with+psychosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis.</a> J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).</li>
<li>Dahm, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+of+autoantibodies+against+brain+antigens+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease.</a> Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).</li>
<li>Jézéquel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-+and+single+molecule-based+methods+to+detect+anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+autoantibodies+in+patients+with+first-episode+psychosis+from+the+OPTiMiSE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project.</a> Biol Psychiatry. , (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Orada canlı hücre tabanlı ayirt tahlil11hücre tabanlı ayirt tahlil9 sabit, dahil olmak üzere literatürde bildirilen NMDA reseptör karşı otoantikorlar varlığı ekran için çeşitli hücre tabanlı immünolojik deneyleri , ve Akış Sitometresi tabanlı tahlil14. Canlı hücre tabanlı ayirt tahlil Akış Sitometresi tabanlı tahlil eğitimli personel ve özel ekipman gerekirken NR1 protein ectopically ifade hücreleri hazırlık kısa bir süre sonra yapılmalıdır. Bir sabi...

Anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit her yaştaki hastalarda gelişebilir ve ağırlıklı olarak kadın hasta1,2etkiler bir yeni tanınan hastalığı varlıktır. Ensefalit3ilk bilinmeyen etiyolojisi olan hastalarda en sık tanı konmuş ensefalit biridir. Hastalar genellikle Anti-NMDA reseptör ensefalit ile etkilenen bir baş ağrısı ya da ateş, bilinç düzeyini değiştirmek ve ajitasyon, sinirlilik gibi akut nöropsikiyatrik belirtiler çeşitli hızlı geliştirme tarafından takip prodromal belirtiler var , anksiyete, uykusuzluk, Varsanılar, sanrılar, saldırganlık, tuhaf davranışlar, hareketi anormallikleri, otonomik bozukluk ve nöbet saldırıları4,5. Bu koşul ve immünoterapi ile zamanında tedavi erken tanınması daha iyi sonuç ve etkilenen hastalar6bile tam kurtarma için önemlidir. Bu nedenle, bu anti-NMDA reseptör otoimmün beyin iltihabı akut veya yeni başlangıçlı psikotik özellikler7,8ile başvuran hastaların önemli bir ayırıcı tanı olarak düşünülmesi gereken önerilmektedir.
Klinik özelliklerin yanında hafiye-in kan veya CSF NMDA reseptör karşı antikor anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit9doğru tanı için önemlidir. Anti-NMDA reseptör antikor algılamaya immünolojik testler çoğu birkaç araştırma laboratuvarları10,11' kullanılabilir ve tek bir piyasada bulunan hücre tabanlı ayirt tahlil için tarama olduğunu Anti-NMDA reseptör otoantikorlar12. Bu çalışmanın amacı uygun laboratuvar olarak anti-NMDA reseptör klinik araştırma kolaylaştırmak için anti-NMDA reseptör otoantikorlar varlığı ekran için kullanılan basit içi hücre tabanlı ayirt tahlil geliştirmektir Otoimmün ensefalit. NMDA reseptör özellikle beyin ve ifade bir heterotetramer iyon kanal protein kompleksi var. Bu iki zorunlu NR1 alt birimleri ve NR2A, NR2B, NR2C veya NR2D13bir ya da iki alt birimleri ile birlikte yapılır. Bir önceki çalışma antikorlar tarafından hedef ana epitope NR1 alt birim5ekstraselüler N-terminal etki olduğunu bildirdi. Bu nedenle, bu iletişim kuralı, biz insan rekombinant NR1 alt birim proteini insan embriyonik böbrek epitel hücre satırı (HEK293) yeşil flüoresan protein (GFP) tagged NMDA reseptör hızlı ve algılamak için bir hücre tabanlı ayirt testi geliştirmek anti-NMDA reseptör otoantikorlar kan IgG sınıf.

<table><tbody><tr><td>GRIN1 (GFP etiketli) - İnsan glutamat reseptörü, iyonotropik, N-metil D-aspartat 1 (GRIN1), transkript varyantı NR1-1</td><td>Origene (Rockville, MD, ABD)</td><td>RG219368</td><td>C-terminal tGFP dizileri pCMV6-AC-GFP ile etiketlenmiş NR1-cDNA klonu</td></tr><tr><td></td><td>Origene (Rockville, MD, ABD)</td><td>PS100010</td><td>C-terminal tGFP etiketli memeli vektörü</td></tr><tr><td>EndoFree Plazmid Maxi Kit</td><td>Qiagen (Hilden Almanya)</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>İnvitrojen (Carlsbad, CA, ABD)</td> <td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I İndirgenmiş Serum Ortamı</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Yüksek Glikoz, Pirüvat</td><td>Thermo Fisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Karakterize Fetal Sığır Serumu, ABD Menşeli</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-İnsan IgG (H + L) İkincil Antikoru, Alexa Fluor 594 konjuge</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11014</td><td></td></tr><tr><td>Pozitif kontrol: anti-glutamat reseptörü (tip NMDA)</td> <td>Euroimmun AG, L&uuml; beck, Almanya</td><td>CA 112D-0101</td><td></td></tr><tr><td>Euroimmun Test Kiti</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

n-metil-d-aspartat (nmda) reseptör karşı antikor kanında tespit etmek için basit hücre tabanlı ayirt tahlil

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

Anti-NMDA reseptör antikor varlığı çeşitli nöropsikiyatrik belirtiler etkilenen hastalarda anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit olarak adlandırdığı, neden olabilir. NMDA reseptör kan veya beyin-omurilik sıvısı (bos) karşı belirli antikor tespiti bu durumun doğru tanı için önemlidir. NMDA reseptör iki zorunlu NMDA reseptör alt birim 1 (NR1) ve bir ya da iki NMDA reseptör dahil olmak üzere dört alt birimleri içeren bir iyon kanal karmaşık proteindir alt birim 2A (NR2A), NMDA reseptör alt birim 2B (NR2B), NMDA reseptör alt birim 2C (NR2C), veya NMDA reseptör alt birim 2D (NR2D). Anti-NMDA reseptör antikor epitope bir NMDA reseptör NR1 alt birimi hücre dışı N-terminal etki mevcut olduğu bildirildi. Bu çalışmanın amacı bir tarama testi klinik ve temel araştırma kolaylaştırmak için kanda NR1 alt birim NMDA reseptör karşı otoantikorlar olup olmadığını belirlemek için kullanılan bir basit hücre tabanlı ayirt tahlil geliştirmektir Anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit.

Ortalama olarak, biz 200-300 µg endotoksin ücretsiz ifade plazmid NR1-GFP ve GFP 250 mL bakteriyel kültüründen Protokolü'nün 1 bölümünde açıklanan yordamı edinebilir. Bir miktar 100 ng/iyi ifade plazmid 48-şey plaka protokol 2 bölümde açıklandığı gibi kültürlü HEK293 hücre transfection için kullanıldı. 24-30 h transfection sonra hücreleri NR1 GFP ifade ve GFP rekombinant proteinler floresan mikroskop altında tespit edilemedi. Şekil 1A şek...

NR1 alt birim NMDA reseptör karşı otoantikorlar ile otoimmün ensefalit şüphesi hastaların kan algılamak için antijen olarak insan embriyonik hücreleri (HEK293) yeşil flüoresan protein tagged NMDA reseptör ectopically dile getirdi. Bu basit yöntem klinik ayarları, amacıyla filtreleme için uygun olabilir.

N-metil-D-Aspartat (NMDA) reseptör karşı antikor kanında tespit etmek için basit hücre tabanlı ayirt tahlil

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Bu testin genel amacı, otoimmün ensefalit şüphesi olan hastaların kanındaki NMDA reseptörüne karşı otoantikorları tespit etmektir. Ölçüm, akut nöro-psikiyatrik semptomları olan hastaların ayırıcı tanısında anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, basit ve güvenilir bir tarama önlemi olmasıdır.Jelatin kaplı kültür plakaları hazırlayarak bu işleme başlayın. 48 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna 200 mikrolitre% 2 jelatin çözeltisi ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede en az 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, jelatin çözeltisini kuyulardan aspire edin.Her bir oyuğa 5 kez 10 ila 4. HEK293 hücrelerine% 10 FBS içeren 200 mikrolitre hücre kültürü ortamında tohumlayın. Plakayı% 5 karbondioksit ile beslenen nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, her bir oyuktaki kullanılmış kültür ortamını% 10 FBS içeren 200 mikrolitre taze kültür ortamı ile değiştirin.Deneydeki toplam kuyu sayısına göre ölçeklendirerek, NR1-GFP plazmidini kültür ortamı ile karıştırarak çözelti A'yı hazırlayın. Transfeksiyon reaktifini kültür ortamı ile karıştırarak çözelti B'yi hazırlayın. Çözelti A ve çözelti B'yi karış

a-simple-cell-based-immunofluorescence-assay-to-detect-autoantibody

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, bir sıçan hipokampal nöronal kültürü kullanılarak bir numunedeki spesifik antijenlere karşı antikorları tanımlamak için bir tekniği göstermektedir. Kültürlenmiş nöronların, N-Metil-D-aspartat reseptörlerini (NMDAR'lar) hedefleyen otoantikorlar içeren hasta örneklerine maruz bırakılmasıyla, nöronal yüzeye bağlı otoantikorların varlığı, immün boyama yoluyla ortaya çıkar.

Hipokampal Nöronal Kültür Kullanılarak İnsan Serumundaki Otoantikorları Tespit Etmek İçin Bir Test

Son yıllarda, canlı hücre bazlı deneyler, yüzey ve şekilsel antijenlere karşı antikorlar tespit etmek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Burada, hastaların büyük kuşaklarının analiz sağlayarak sitometri yüksek verimli akışını kullanarak bir yöntem açıklanmaktadır. Yeni antikorların tespiti immün aracılı bozuklukların tanı ve tedavi artıracaktır.

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Burada, insanlardan ve farelerden serum IgG ve IgM otoantikorlarının aynı anda tespiti için kullanılabilecek özelleştirilebilir antijen mikrodizileri oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu diziler, ilgilenilen herhangi bir antijene veya epitopa karşı antikorların yüksek verimli ve kantitatif tespitine izin verir.

IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray&#39;ler Üretimi

DFS70 otoantikorlar doğru yorumu geleneksel HEp-2 yüzeylerde kullanırken zorlu yapma ortak enerjiye antikor hastalık ilişkili kalıpları taklit. Protokol üzerinden geleneksel HEp-2 eleme ve hem monospecific hem de karma ANA olumlu durumlarda yüksek güven ile DFS70 desenleri ayırt ANA'roman mühendislik HEp-2 substrat avantajları açıklar.

Monospecific ve karışık DFS70 desen bir roman hepatit-2 ELITE/DFS70 nakavt substrat ile birlikte ANA tarama sırasında eşzamanlı ayrım

NMDA reseptörleri (NMDAR) çalışma daha büyük ölçekli, kolaylaştırmak ve küçük moleküller düzenleyici etkileri muayene ve tedavi uygulamaları izin vermek için bu iletişim kuralını hedefidir.

NMDA reseptörleri glisin/D-serin ve glutamat duyarlılık ile çalışmak için bir yüksek-den geçerek kalsiyum-flux tahlil

Hücre tabanlı tahlil serum anti-aquaporin-4 immünglobulin G. algılamak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir Bu yöntem, klinik tanı ve Nöromyelitis optik spektrum bozuklukları, bilimsel araştırmalar için uygulanabilir.

İnsan Serum Anti-aquaporin-4 immünoglobulin G algılama hücre tabanlı tahlil tarafından

7 otoantikor testini bir araya getiren basit bir çoklanmış ECL testi modelliyoruz. Tahlil, çölyak hastalığı, otoimmün tiroid hastalığı ve otoimmün poliglandüler sendrom 1 dahil olmak üzere T1D ve diğer birçok otoimmün hastalığı aynı anda tarayabilir.

Yüksek Verimli Bir Elektrokemilüminesans 7-Plex Testi Aynı Anda Tip 1 Diyabet ve Çoklu Otoimmün Hastalıklar İçin Tarama

Otoimmün ensefalit, merkezi sinir sisteminin antikor aracılı hastalıklarının yeni bir kategorisidir. Hipokampal nöronlar bu antikorları keşfetmek ve karakterize etmek için kullanılabilir. Bu makalede, hastaların serum ve beyin omurilik sıvısındaki otoantikorları belirlemek için primer hücre kültürü ve immün boyama için bir protokol sunulmaktadır.

Otoimmün Ensefalitte Yer Alan Yeni Patojenik Antikorları Tespit Etmek ve İncelemek için Hipokampal Nöronal Kültürler

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan hastalığı ile güçlü bir humoral otoimmün yanıtı paylaşan bir multipl skleroz (MS) hayvan modelidir. Burada, EAE ile aşılanmış farelerin serumundaki otoantikorları ölçmek için basit ve esnek bir ELISA protokolü bildiriyoruz.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Üzerine Farelerde Otoreaktif Antikorların Miktar Tayini

Anti-MDA'yı tespit etmek için adım adım bir immünositokimya (ICC) metodolojisi sunuyoruz5. Bu yaklaşım, anti-MDA5 otoantikorlarının doğru bir şekilde saptanmasına olanak tanıyan ve miyozit hastalarında hızla ilerleyen interstisyel akciğer hastalığının teşhisine yardımcı olan hücre fiksasyonu, geçirgenleştirme, antikor inkübasyonu ve görüntüleme tekniklerini içerir.

HeLa Hücreleri Kullanılarak Anti-MDA5 Otoantikorlarının Tespiti ve Işık Mikroskobu ile İmmünositokimya

İnsan ve hayvan serumlarında antikor yanıtının özelleştirilebilir tespiti için hücresiz sentetik biyoloji ilkelerine ve nokta-leke tekniğine dayanan yakın zamanda geliştirilmiş bir immünoassay platformunu açıklıyoruz.

İnsan ve hayvan serumlarında antikor yanıtının tespiti için pratik ve uyarlanabilir bir immünoassay platformu olarak hücresiz nokta lekesi

Öğrenin, HEK293 hücreleri kullanarak NMDA reseptörüne karşı otoantikorları tespit etmek için basit bir hücre tabanlı ayırma yöntemi. Bu güvenilir tarama tekniği, otoimmün ensefalit tanısına yardımcı olur.

N-metil-D-Aspartat (NMDA) reseptör karşı antikor kanında tespit etmek için basit hücre tabanlı ayirt tahlil

Daha fazla video keşfet