HER2 Gene amplifikasyon meme kanserleri heterojen değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tarama Platform kurma

Bu laboratuvar prosedürünün genel amacı, yüksek verimli gümüş in situ hibridizasyon yoluyla heterojen olarak işlenmiş geniş bir dizi heterojen meme kanserinde HER2 intra-tümör genetik heterojenliğini aynı anda tanımlamak, ölçmek ve karşılaştırmaktır. Bu yöntem, patoloji arşivlerinden alınan geniş bir vaka kohortu olan HER2 gen amplifikasyonu heterojenliği çalışması gibi meme kanseri çevirisi ve araştırmalarının anahtar seçiminin ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, çoklu ve heterojen olarak işlenmiş meme kanserlerinin farklı topografik alanlarında yüksek verimli HER2 şizoanalizine izin vermesidir.

Genel olarak, in situ hibridizasyona yeni başlayan bireyler mücadele edecektir, çünkü retrospektif çalışmalar tipik olarak farklı fiksasyon, işleme ve saklama prosedürlerine tabi tutulan arşiv örneklerinin analizini gerektirir. Bu yöntem fikri ilk olarak 2003 yılından bu yana tüm meme kanserlerini kurumsal veri tabanımızdan yeniden sınıflandırmaya karar verdiğimizde aklımıza geldi. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Giulia Ercoli olacaktır.

Bu protokole, metin protokolünde açıklandığı gibi hasta ve doku örneklerinin seçimi ile başlayın. Her servis talebinin farklı alanlarının kayıtlarını içeren yeni bir elektronik tablo dosyası oluşturun ve açın. Vaka kimliği, blok kimliği, alan kimliği, doku tipi, topografya, morfoloji, biyobelirteç durumu ve mevcut diğer tüm immünohistokimyasal özellikler için ayrı sütunlar ekleyin.

Bir TMA projesi oluşturun. Dosya, yeni, blok'a giderek PMA alıcı bloklarını tanımlayın. Parafin bloğunun boyutlarını doldurmak ve yazmak için ilk alana tıklayın.

Ardından, dosya, yeni, doku dizisine giderek bir doku dizisi projesi oluşturun. İçe aktar simgesini tıklayın, ardından daha önce oluşturulan alıcı bloğunun şablon dosyasını seçin. Sonrakine tıkla.

Ardından, yuvarlak düğmeye tıklayarak nokta boyutu olarak bir milimetre seçin. Komşu noktaların iki merkezi arasındaki boşluk olan nokta aralığı olarak 500 mikronu seçin. Ardından, 231 olması gereken oluşturulan toplam nokta sayısını hesaplamak için hesap makinesi simgesine tıklayın.

Ardından ızgaralar ve alt ızgaralar oluşturmak için tanımla düğmesine tıklayın. Sekizinci ve 15 numaralı sütunları ve orta çizgiyi silin. Oryantasyon için birinci satırın üç noktasını koruyun.

Son harita toplam 183 noktayı kapsamalıdır. Dosyaya, yeni, doku türleri listesine giderek doku türleri listesini tanımlayın. Ardından dosya, yeni, güçlendirici projeye giderek projeyi tanımlayın.

Ardından, alıcı blokları hazırlayın. Temizlenmiş metal kalıpları 65 santigrat derecede elastik parafin ile doldurun. Parafin bloklarını metal kalıpların içinde gece boyunca film sıcaklığında soğumaya bırakın.

Ertesi gün parafin bloklarını metal kalıplardan çıkarın. Önce dizileyiciyi açarak ve ardından alıcı blokları dizileyici karuseline yerleştirerek otomatik veya yarı otomatik bir dizileyici kullanarak TMA'yı oluşturun. Lazer ışığını hareket ettirmek ve alıcı bloğun parafinindeki sol üst kenarla hizalamak için ok tuşlarını kullanarak her bir alıcı bloğuna başlangıç konumunu tanımlayın.

İleri'ye tıklayın ve dikey hizalama için tekrarlayın. Alıcı bloğunun önceden tanımlanmış koordinatında otomatik olarak bir delik oluşturmak için tekrar ileri'ye tıklayın. Zımbayı boşaltın.

Donör bloğunu örnekleme için konumlandırın ve daha önce açıklamalı ilgi alanından bir doku çekirdeğini çıkarın. Donör doku çekirdeğini alıcı bloktaki deliğe yerleştirin. Ardından donör bloğunu diziciden çıkarın.

TMA tamamlanana kadar bu adımları tekrarlayın. Yeni oluşturulan TMA bloğunun doku tarafını steril bir boş slayt üzerine koyun ve beş dakika boyunca 45 santigrat derecede laboratuvar fırınına koyun. Doku çekirdeklerini düzleştirmek için sürgü üzerindeki bloğa beş saniye boyunca hafifçe bastırın.

Toplam iki kez bir kez tekrarlayın. Daha sonra, TMA doku yüzeyini 65 santigrat derecede ince bir elastik parafin tabakası ile kaplayın. TMA bloğunu iki saat oda sıcaklığında bırakın.

Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi histokimyasal ve immünohistokimyasal analizler yapmadan önce TMA bloğunu 24 saat boyunca dört santigrat derecede aktarın. TMA slaytlarını 10 dakika boyunca 60 santigrat derecede analiz etmek için yerleştirin. Ardından immünostainer cihazını ve yazılımını başlatın.

Giriş görünümünde, protokoller düğmesine tıklayın ve ardından protokol oluştur/düzenle'ye tıklayın. Temel şablonu değiştirmek için ikili ISH kokteyl prosedürünü seçin. Kutu listesinde pişirmeyi işaretleyin ve sıcaklığı 20 dakika boyunca 63 santigrat dereceye ayarlayın.

Sonra bayrak deparafinizasyonu. Sonraki bayrak hücresi koşullandırması kutu listesinde. Ardından hücre koşullandırma CC2'yi işaretleyin ve sıcaklığı 86 santigrat dereceye ve inkübasyon süresini dört dakikaya ayarlayın.

Hafif CC2'yi sekiz dakika, standart 12 dakika ve sekiz dakika uzatılmış olarak işaretleyin. Kutu listesinde ISH-Protease üçünü işaretleyin ve inkübasyon süresini 16 dakika olarak ayarlayın. Probun HER2 dinitrofenilini ve kromozom 17 digoksigeninini seçin.

16 dakika inkübe edin ve ardından denatürasyonu 80 santigrat derecede 20 dakika boyunca ayarlayın. Probun inkübasyon süresini altı saat olarak ayarlayın. Ardından SISH multimer inkübasyon süresini 32 dakikaya ayarlayın.

Gümüş kromat ve inkübasyon süresini dört dakikaya ayarlayın. Daha sonra kırmızı multimer inkübasyon süresini 24 dakikaya ayarlayın. Kırmızı kromat ve inkübasyon süresini sekiz dakikaya ayarlayın.

Ardından kutu listesinde karşı boyamayı işaretleyin, hematoksilen ikisini seçin ve inkübasyon süresini sekiz dakikaya ayarlayın. Kutu listesinde karşı boyama sonrası işaretlemeyi işaretleyin, mavileştirme reaktifini seçin ve inkübasyon süresini dört dakika olarak ayarlayın. Son olarak, HER2 için şizoanaliz yapın.

HER2 kromozom numaralandırma probu 17 oranı, hücre başına 4.0 sinyale eşit veya daha büyük bir ortalama HER2 kopya sayısı ile 2.0'a eşit veya daha büyükse, HER2 gen amplifikasyonunu pozitif olarak değerlendirin. HER2 kromozom numaralandırma probu 17 oranının 2.0'dan az olup olmadığını ve ortalama HER2 kopya sayısının hücre başına 4.0 sinyalden az olup olmadığını negatif olarak değerlendirin. Burada, bir HER2 heterojen meme kanserinin gümüş in situ hibridizasyon analizini gösteren temsili mikrograflar gösterilmektedir.

Bu paradigmatik örnekte, özel bir tipi olmayan yüksek dereceli invaziv meme kanserinin iki farklı alanı, kırmızı noktalar olarak görselleştirilen sentromerik numaralandırma probu 17 ile karşılaştırıldığında, siyah noktalar olarak görselleştirilen HER2 gen amplifikasyonu açısından farklı sonuçlar göstermektedir. Özellikle, tümör çekirdeğine ait olan ve sitokeratin yedi düzensiz boyama paterni gösteren bir alan HER2 amplifiye edilirken, invaziv cephenin önündeki tek bir nokta vahşi tip HER2 paterni sergiledi. Bu videoyu izledikten sonra, çoklu ve heterojen olarak işlenmiş meme kanserlerini içeren doku işaretli dizilerin okunabilir şizoanalizinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik vaka seçiminden itibaren iki iş günü içinde yapılabilir. Bu yöntem meme kanseri için optimize edilmiş olsa da, mide kanseri gibi HER2 heterojenliğinin kritik olarak ilgili olduğu diğer kanser türlerine çevrilebilir. Bu tekniğin etkileri, HER2'nin basit değerlendirmesine kadar uzanır, çünkü daha büyük meme kanseri serilerinde çoklu topografik alanların kapsamlı bir şekilde haritalanması için tasarlanmıştır.

Bu prosedüre katılırken, TMA bloğunda herhangi bir çatlaktan kaçınmak önemlidir. Parafindeki minimal bir çatlak bile, yerinde hibridizasyonun kalitesini, tekrarlanabilirliğini ve genel netliğini ortaya çıkarır. Bu prosedürü takiben, özellikle tümör içi ve tümörler arası heterojenlik açısından meme kanserinin proteomikleri hakkında ek soruları yanıtlamak için MALDI kütle spektrometresi görüntülemesi yapılabilir.

TMA zımbaları ve sıcak parafin mumu ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman tek kullanımlık nitril eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.