Name: Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Keşfedin Caenorhabditis elegans nöronlarında hücre içi taşıma olaylarını canlı gözlemleme yöntemini. Bu teknik, diseksiyon veya anestezi gerektirmeden aksiyonel ve silyal taşımayı in vivo görselleştirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazar Dr. Asako Sugimoto (Tohoku Üniversitesi) derinden yararlı onun tartışma için teşekkürler. wyIs251 Doktor Kang Shen (Stanford Üniversitesi) cömert bir hediye etmişti. mnIs17 araştırma altyapı programları (P40 OD010440) NIH ofisi tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlandı. Bu eser JSP'ler KAKENHI grant #17 H 05010 ve #16 H 06536 ve Daiichi Sankyo Vakfı, beyin bilim Vakfı ve Naito Vakfı tarafından desteklenmiştir.

1. numune hazırlama <ol><li>Generate transgenik C. elegans zorlanma transgenik metodolojisi 18 kullanarak ilgi. Alternatif olarak, uygun suşların Caenorhabditis genetik Merkezi (CGC) dan elde edilir. Sinaptik vezikül öncüleri aksonal taşımacılığının görselleştirmek için transgenik çizgi wyIs251 kullanın [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. LFT gözlemlemek için transgenik çizgi mnIs17 [osm-6::gfp] 19 edinin. Bu protokol için bu suşlar kullanılır. 
	Not: Ya extrachromosomal dizi, genomik entegrasyonu veya bile GFP çakma çalışır. Arka plan sinyalleri azaltmak için pan-nöronal rehberleri yerine hücre özel Organizatör kullanın. 
	Not: Bakım Worms diğer protokolleri 20 dakika içinde açıklanmıştır. Suşları tutulan Escherischia coli OP50 besleyici nematodunun büyüme üzerinde çimenler üzerinde orta (NGM) levhalar (%1,7 (w/v) özel, 50 mM NaCl, %0.25 (w/v) pepton, 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL kolesterol, 25 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4 60 mm çap plastik yemekleri) 20 ° C.</li>
	<li>Grow solucanlar 20 ° C'de NGM Tabaklarda solucanlar herhangi bir yaşam döngüsü aşaması için. 
	Not: Bir aksonal transport ve LFT herhangi bir aşamada gözlemleyebilirsiniz. Genç Yetişkin geç L4 çünkü iyi bir pozitif kontrol birden çok yayın-si olmak kullanılmış bu aşamaları ve görüntülenmeyecektir kaçakçılığı olayları 14 , 21 , 22 , 23.</li>
</ol> 2. % 10 hazırlanması özel Not: pek çok satıcı agar agar tozlar ve özel gibi benzer ürünler sağlar. Elektroforez sınıf özel kullanın (jel gücü &#62; 1200 g/cm 2). Ucuz agar tozlar işe yaramaz çünkü elde edilen jel solucanlar hareketsiz yeterince güçlü değil.
<ol><li>Mix 0.4 g özel 4 mL distile su (DW) bir cam tüp (1.5 cm x 10,5 cm). Buharlaşma önlemek için cam tüp üzerinde bir kapak koyun.</li>
	<li>90 dk için 95 ° C ısı bloğu cam tüp yerleştirilir. Buna ek olarak, DW ile dolu başka bir cam tüp (1.5 cm x 10,5 cm) hazırlamak ve 95 tutmak ° C. koymak Pasteur damlalıklı 95 ° C'de DW ( şekil 1 A). Bir sürü küçük kabarcıklar özel tüp içinde görülecektir ve çözüm bulanık olmalıdır. Çözüm açık hale gelinceye kadar bırakın. Sonra karıştırmak özel çözüm homojen hale gelinceye kadar yukarı ve aşağı tarafından pipetting. 
	Not: Mikrodalga fırın DW ve özel yapılmış zaman % 10 özel çözüm hazırlamak için kullanılamaz. Küçük kabarcıklar mikrodalga tarafından neden olduğu özel erime önlemek. Ancak, katılaşmış % 10 özel jel kolayca kullanarak yeniden bir mikrodalga erimiş olabilir. Cam tüpler % 10 özel jel içeren önceden hazırlanan ve 4 ° C'de en az 6 ay süreyle depolanır. Böylece, gerektiğinde bir mikrodalga kullanarak stok eritmek ve bu iletişim kuralı 3 adımda başlayabilirsiniz. 
	Not: Özel yavaş yavaş uzun bir süre veya sonra tekrarlanan katılaşma ve erime 95 ° C'de inkübe Eğer kuvvetlendirmek için yetenek kaybeder. Bu durumda, yeni % 10 özel hazırlayın.</li>
</ol> 3. Hazırlık özel ped <ol><li>Adım 2.2, hazırlanan ısıtılan Pasteur damlalıklı kullanarak 76 x 22 mm slayt üzerinde 2 damla % 10 özel yerleştirin.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde Resim 1 B ve itme aşağı ikinci slaytta özel çözüm düzleştirmek için gösterildiği gibi kapak özel damla önce ikinci 76 x 22 mm 2 kaydıraklı katılaşır. Kalınlığı 0,5-1 olmalıdır mm.</li>
	Özel çözüm yıkanır kadar <li>hızlı bir şekilde Pasteur pipet pipetting 95 ° C DW tarafından yukarı ve aşağı yıkayın. Aksi takdirde, damlalıklı tarafından özel jel haline tıkanmış. Pipet ayakta 95 ° C'de DW bırakın.</li>
	<li>1 dk bekle. Özel defteri oluşturur ve bulutlu olur. Sonra el ile ( şekil 1 C) ayrı slaytları slayt.</li>
</ol> 4. Kurtlardan montaj Not: solucan hareketi bile az miktarda önlemek iyi gözlem. Levamisole solucan hareket özel yastık 24 , 25 önlemek için geleneksel olarak kullanılmıştır. Ancak, Levamisole C. elegans nöronal reseptörleri inhibe ve bu nedenle nöronlar 15 kaçakçılığı olayları etkileyebilir. Polistren lastikteki kullanarak açıklanan burada iyi bir alternatif 17.
<ol><li>~ 30 transgenik solucanlar yeni NGM için uygun veri işaretleyicilerini ifade plaka Platin tel kullanarak bakteri almak olmadan bir sürgülü ayna transillumination ile donatılmış bir stereo mikroskop altında transfer. 
	Not: Platin tel ve Pasteur pipet (5 inç) bir platin tel çekme yapılmış ve platin tel ucu dümdüz. Platin tel alır hazırlanması ve bunlar solucanlarla kullanımı Wormbook (http://www.wormbook.org) açıklanmıştır.</li>
	<li>Plaka terk solucanlar NGM özel jel bakteri olmadan hareket olarak 1 dk. için bakteri otomatik olarak solucanlar yüzeyler arasında kaldırılır.</li>
	<li>Yerine 0,5-1,0 a µL % 2,6 100 nm çapında polistren lastikteki agar pad ( şekil 1 D) üzerine su içinde damla. 10-20 solucanlar bakteri-özgür NGM plaka için lastikteki aktarın. Damla ve platin tel kullanarak solucanlar almak, örtüşen önlemek için forma solucan organları ( şekil 1 E).</li>
	<li>22 x 40 mm 2 coverslip ( şekil 1 F) uygulanır. Hava kabarcıkları kaldırmak, ancak ezici solucanları önlemek için yavaşça itin. Örnek görüntüleme için hazırdır. 
	Not: anestezi yönetilen çünkü solucanlar sadece agar pad, polistren lastikteki ve coverslip 17 tarafından üretilen sürtünme Kuvvetleri tarafından sabitlenir. Besleyici bakteri ve/veya çok fazla çözüm varlığı sürtünme kuvveti zayıf yapacak. 
	Not: Coverslips (örneğin, 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2) iş farklı boyutlarda. Ancak, daha büyük coverslips daldırma su veya örnekleri gözlem sırasında sızıntı objektif lens yağdan önleyebilirsiniz.</li>
</ol> 5. Gözlem Not: her mikroskop sistem ve kamera için uygun görüntüleme parametreleri (lazer gücü, kazanç, binning, vb) farklılık gösterir. Burada, bir iplik disk confocal tarayıcı ve dijital bir CCD kamera ile donatılmış widefield mikroskop kullanılmaktadır.
<ol><li>20 ° C sıcaklık kontrolü sahne alanı ayarla veya oda sıcaklığında 20 ayarlamak ° C.</li>
	<li>Örnek slayt mikroskop sahneye koydu. 100 x kullanın (sayısal diyafram = 1.3 veya daha iyi) objektif lens.</li>
	 Şekil 2 A (için wyIs251 ve aksonal transport) veya Resim 2 B (mnIs17 ve LFT için) pozitif denetimleri olarak belirtilen alanlar için <li>Bak . Diğer alanlarda iyi 22 analiz edilebilir.</li>
	<li>Kümesi parametreleri (CCD kazanç = 200, Binning = 1 veya 2, 488 güçte lazer nm = 1.0-1.3 mW). 4 kare/s zaman sukut yazmak ilâ 1 dk. dosyaları Kaydet mutli-TIFF biçimi olarak gerçekleştirmek. 
	Not: GFP sinyalleri yok ve GFP::RAB-3 veya OSM-6::GFP 30 için izlemeye devam etmek zordur eğer s, lazer güç çok güçlü. Bu durumda, lazer gücü düşür. Diğer taraftan, veziküler hiçbir hareket kaydedildiyse, lazer gücü çok zayıftır. Bu durumda, lazer gücü arttır.</li>
	<li>Farklı bir solucan gözlemlemek ve 5.3 ve 5,4 yineleyin. Gözlemler 20 dakikaya kadar sürebilir, ama her solucan p etkilerini önlemek için yalnızca bir kez kaydedilmesi gerekenHo'ya hasar. 
	Not: En az 20 dk olmadan önemli kusurları 7 , 27 , 28 için solucanlar gözlenmiştir. Daha uzun gözlem cenneti mümkün olabilir &#39; t oldu henüz test. Açık bir işareti nöronal ölüm neurite şişme gibi nöronal Morfoloji değişimdir. Zayıf GFP sinyaller akson ve dendrites wyIs251 ve mnIs17 görüldüğü gibi neurite Morfoloji aksonlar veya dendrites sadece bakarak kolayca denetlenebilir. Nöronal Morfoloji Şekil 2 ' de gösterildiği.</li>
	<li>Film dosyaları oluşturmak.
	Fiji yazılımı kullanarak <ol><li>açık çok TIFF dosyasını. Dosya gidin &#62; aç sonra 5.4. adımda kaydettiğiniz çok TIFF dosyası seçin. 
		Not: Fiji-ebilmek var olmak downloaded jttps://fiji.sc. Resmi J ve eklentileri kymographs oluşturmak için kullanılabilir. Böylece, ilgili talimatları için seçilen eklenti.</li> <li>'ı tıklatın &#34; dikdörtgen seçim &#34; düğmesini ( şekil 3 bir, ok) seçeneğini belirleyip bir dikdörtgen çizerek ilgi alanı bir bilgisayar fare ile (sarı dikdörtgen şekil 3 A). Görüntü gidin &#62; yığınları &#62; araçlar &#62; yapmak Substacks ve filmde içerdiği dilim numaralarını seçin. Bir substack oluşturulur.</li>
		<li>Substack pencereyi tıklatarak etkinleştirin ve resim gidin &#62; ayarla &#62; Parlaklık/Kontrast. Parlaklık ve kontrastı ayarlamak için bir pencere gösterir. Pencerede, üst slayt bar (en az) sağa doğru böylece arka plan sinyal kaybolur ve ikinci top bar (maksimum) sola kadar bu hareketli veziküller ve parçacıklar oldukça iyi arka plan üzerinde görülebilir.</li>
		<li>Gitmek için görüntü &#62; yığınları &#62; zaman Stamper. Film 4 kare/s 5,4 adımda kaydedilen zaman aralığını 0.25 olduğu s. Böylece, yazın &#34; 0,25 &#34; aralığındaki.</li>
		<li>Oluşturmak bir film dosyası olarak kaydet seçerek &#62; AVI Dosya menüsünden (film 1 ve 2). 
		Not: uygun eklentileri kullanarak, dosyayı, diğer biçimleri aşağıdaki gibi kaydedebilirsiniz &#34; mpeg4 &#34; veya &#34; mov &#34; dosyaları.</li>
	</ol></li> <li>Kymographs oluşturmak.
	<ol><li>FIji yazılım kullanarak yeniden özgün film dosyaları açın ve tekrar adım 5.6.2 ve parlaklık ve kontrastı ayarlamak için 5.6.3.</li>
		<li>Tıklama &#34; satır parçalara &#34; ( şekil 3 B, ok). Bir fare kullanarak kirpikler veya axon (Sarı Hat, şekil 3 B) boyunca parçalı bir çizgi çizin.</li>
		<li>Gitmek için analiz &#62; çok Kymograph &#62; çok Kymograph ( şekil 3 C). Satır genişliği penceresi ( şekil 3 D) görüntülenir. Türü &#34; 3 &#34; Linewidth pencere ve Tamam'ı tıklatın ( şekil 3 D).</li>
		<li>Kymograph pencere oluşturulur. Resmi TIFF ya da JPEG formatında kaydedin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+in+neurons%3A+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function%2C+development%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li>
<li>Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%2C+axonal+transport%2C+and+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Microtubules, axonal transport, and neuropathy.</a> N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).</li>
<li>Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+studied+in+Chlamydomonas+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants.</a> Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).</li>
<li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+motors+in+cilia%3A+moving+along+the+cell%27s+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna.</a> J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).</li>
<li>Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).</li>
<li>Ishikawa, H., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliogenesis%3A+building+the+cell%27s+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ciliogenesis: building the cell's antenna.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).</li>
<li>Niwa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinhibition+of+a+Neuronal+Kinesin+UNC-104%2FKIF1A+Regulates+the+Size+and+Density+of+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses.</a> Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).</li>
<li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li>
<li>Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+coordination+of+intraflagellar+transport+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional coordination of intraflagellar transport motors.</a> Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).</li>
<li>Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF26A+is+an+unconventional+kinesin+and+regulates+GDNF-Ret+signaling+in+enteric+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development.</a> Cell. 139 (4), 802-813 (2009).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charcot-Marie-Tooth+disease+type+2A+caused+by+mutation+in+a+microtubule+motor+KIF1Bbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta.</a> Cell. 105 (5), 587-597 (2001).</li>
<li>Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF1Bbeta-+and+KIF1A-mediated+axonal+transport+of+presynaptic+regulator+Rab3+occurs+in+a+GTP-dependent+manner+through+DENN%2FMADD%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD.</a> Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).</li>
<li>Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+motor%2C+KIF13A%2C+controls+anxiety+by+transporting+the+serotonin+type+1A+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor.</a> Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).</li>
<li>Klassen, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arf-like+small+G+protein%2C+ARL-8%2C+promotes+the+axonal+transport+of+presynaptic+cargoes+by+suppressing+vesicle+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation.</a> Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).</li>
<li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans%2C+Drosophila+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cellular+dynamics+during+Caenorhabditis+elegans+postembryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li>
<li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), 53419(2013).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li>
<li>Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+osm-6%2C+a+gene+that+affects+sensory+cilium+structure+and+sensory+neuron+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nephronophthisis-related+gene+ift-139+is+required+for+ciliogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Sci Rep. 6, 31544(2016).</li>
<li>Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+neuron-wide+analysis+of+synaptic+vesicle+precursor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking.</a> Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).</li>
<li>Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+balance+between+capture+and+dissociation+of+presynaptic+proteins+controls+the+spatial+distribution+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses.</a> Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).</li>
<li>Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+dendritic+transport+and+the+AP-1+mu1+clathrin+adaptor+UNC-101+localize+odorant+receptors+to+olfactory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia.</a> Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).</li>
<li>Kumar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104%2FKIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6 (11), 1001200(2010).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vesicle+protein+SAM-4+regulates+the+processivity+of+synaptic+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport.</a> PLoS Genet. 10 (10), 1004644(2014).</li>
<li>Blacque, O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WD+repeat-containing+protein+IFTA-1+is+required+for+retrograde+intraflagellar+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport.</a> Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).</li>
<li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modulation+of+IFT+kinesins+extends+the+sensory+repertoire+of+ciliated+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mScarlet%3A+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li>
<li>Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li>
<li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659(2016).</li>
<li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li>
</ol>

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Sınırlama ile ilgili mevcut yöntemler Burada açıklanan yöntemi aksonal transport ve LFT gibi hızlı olayları gözlemlemek için optimize edilmiştir. Böylece, immobilizasyon daha daha uzun kuluçka öncelik. Ise önemli pertürbasyon olmadan en az 20 dk için kaçakçılık olayları gözlemlemek mümkün olabilirdi, bu yöntem her zaman axon uzama ve hücre göç gibi uzun gözlem gerektiren yavaş olayları gözlemlemek uygun olmayabilir. Daha uzun gözlem için bir özel yüzdesini azaltarak koşulları optimize etmek gerekiyor ...

Canlı hücre görüntüleme hücre içi taşıma analiz etmek için önemli bir araçtır. Nöronal hücre Biyolojide canlı hücre görüntüleme ile aksonal taşıma nöronal fonksiyon ve morfogenetik1anlamak için gerekli analizlerdir. Aksonal transport kusurları birkaç nörodejeneratif hastalıklar2altında yatan. Sırasıyla kinesin süper proteinler ve dinein aksonal transport anterogradely ve retrogradely,1,2taşır.
Kirpikler Mikrotubul ağ ve kaçakçılığı makine gelişmiş3olan başka bir hücresel yuvası vardır. Protein sentezi makine kirpikler, silier proteinler kirpikler ipuçları sitoplazma gönderilmesi gerekir yani yerelleştirilmemiştir. Kirpikler özel kinesin ve dinein, aradım kinesin-2 ve sitoplazmik dinein-2, sırasıyla, kirpikler4, intraflagellar taşıma (LFT)5denilen bir fenomen bileşenleri taşıma. LFT bozukluğu hastalıkları ciliopathies6adı verilen bir spektrum neden olur. Böylece, LFT mekanizması tarafından canlı hücre görüntüleme analizi silier oluşumu ve patogenezinde temel mekanizmaları anlamak için gereklidir.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonal transport ve LFT7,8,9eğitim için iyi bir modeldir. LFT gözlemlemek için Chlamydomonas yaygın olarak bir model organizma5,6kullanılmıştır. Chlamydomonas tek hücreli bir organizma olduğu için LFT ilişki ile yaşlanma, nöronal fonksiyon ve davranış analiz etmek zor olacaktır. Buna ek olarak, CRISPR/Cas9 gibi temel genetik teknikleri Chlamydomonasiçin uygulanmadı. Çünkü aksonal transport ve LFT morfogenez ve homeostasis hayvanlar 10için gerekli olan fare ve Drosophila, gibi daha yüksek model organizmalar bozulma aksonal transport ve LFT kez ölümcül fenotipleri neden olur, 11. Fare olması durumunda, hücre kültürü ve transfection genellikle aksonal transport ve birçok beceri ve geniş zaman12,13gerektirir LFT gözlemlemek için gereklidir. Buna ek olarak, önemli fizyolojik bağlam çok kültürlü hücreleri ve hücre satırlarını kaybetmiş. Sinir sisteminin solucanların yaşam için gerekli olduğundan, C. elegans mutantlar hangi aksonal taşıma veya LFT kesintiye öldürücü7,9,14değil çoğu zaman. Doğrudan aksonal transport ve LFT vivo içinde diseksiyon olmadan C. elegans saydamdır ve bu nedenle GFP etiketli işaretleri gözlemlemek kolaydır çünkü görülebilmektedir.
C. elegans, anestezi16veya lastikteki17bir mikrosıvısal aygıt15, özel kablolar kullanarak gibi hareketsiz için çeşitli protokoller vardır. Anestezi eklenmesi nöronlar15kaçakçılığı olayları inhibe. Mikrosıvısal-aygıt yöntemin açık bir dezavantajı bir mikrosıvısal aygıt hazırlanıyor her zaman kolay değildir. Bunun yerine, özel yastıkları ve lastikteki immobilizasyon zaman atlamalı görüntüleme C. elegansiçinde gerçekleştirmek için rahat ve kolay bir yöntem var. Burada, C. elegans hareketsiz ve aksonal transport ve LFT in vivo olarak görselleştirmek için bu temel iletişim kurallarını açıklamak C. elegans. Diğer yöntemlerine göre burada açıklanan yöntemi özel ekipman gerektirmez ve çok daha ucuz ve daha kolay gerçekleştirmek.

<table><tbody><tr><td>Sürgülü cam (76&nbsp; x 26 mm)</td><td>Matsunami</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camı (22&nbsp; x 40 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C024401</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wako</td><td>318-01195</td><td></td></tr><tr><td>Polystylene mikroboncuklar 0.1 mikron</td><td>Polysciences</td><td>#00876</td><td></td></tr><tr><td>Isı bloğu</td><td>TAITEC</td><td>0063288-000</td><td>CTU-mini</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>geniş alan mikroskobu</td></tr><tr><td>Dönen disk Tarayıcı</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>eğirme diski konfokal tarayıcı&nbsp;</td></tr><tr><td>Dijital CCD kamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C10600-10B</td><td>ORCA-R2 dijital CCD kamera</td></tr><tr><td>Objektif lens (x100, NA1.4)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100XO</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipeti (5 inç)</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>Cam tüp (1,5 cm çap x 10,5 cm)</td><td>IWAKI</td><td>9820TST15-105NP</td><td></td></tr><tr><td>TV9211: wyIs251</td><td>Kang Shen Laboratuvarı</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OTL11: mnIs17</td><td>Ref. 27, 29</td><td>N/A</td><td>SP2101, 6 kez vahşi tip ile geri çaprazlandı</td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>435064-9000-000</td><td>STEMI 508&nbsp;</td></tr><tr><td>Ayna transillüminasyon ünitesi</td><td>Carl Zeiss</td><td>435425-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>platin tel (0,2 mm)</td><td>Nilaco Corporation</td><td>m78483501</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plastik tabak</td><td>Falcon</td><td>#351007</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fiji N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> <tr><td>https://fiji.sc/ nematod büyüme ortamı (NGM)&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>% 1.7 (a / h) agaroz, 50mM NaCl,% 0.25 (a / h) Pepton, 1 mM CaCl2, 5 mg / mL Kolesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 &nbsp;</td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Aksonal taşıma ve intraflagellar taşıma (LFT) akson ve kirpikler morfogenez ve işlevi için gerekli olan. Kinesin süper proteinler ve dinein anterograd ve retrograd taşıma, sırasıyla düzenleyen moleküler motorlar vardır. Bu motorlar Mikrotubul ağları raylar kullanır. Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonal transport ve LFT vivo içindeçalışmaya bir güçlü model organizmadır. Burada, aksonal transport ve LFT yaşam gözlemlemek için bir protokol tarif C. elegans. Taşınan kargo kargo protein flüoresan proteinler yeşil flüoresan protein (GFP) gibi kullanarak etiketleyerek görüntülenmeyecektir. C. elegans şeffaf ve kargo GFP öğesini proteinler hücre özel Organizatör altında belirli hücrelerdeki ifade edilebilir. Yaşayan solucanlar lastikteki % 10 özel jel üzerinde öldürmek veya solucanlar anesthetizing tekrarlanmasıyla çözülebilir. Bu koşullar altında kargo hareket doğrudan akson ve yaşam kirpikler gözlenen C. elegans diseksiyon olmadan. Bu yöntem hedef proteinler değiştirerek herhangi bir hücre ve/veya onlar ifade edilir hücreleri herhangi bir kargo molekül gözlenmesi için uygulanabilir. Moleküler motorlar gibi en temel proteinler ve aksonal transport ve LFT katılmaktadırlar adaptör protein C. elegansiçinde korunmuş. Diğer model organizmalar için karşılaştırıldığında, mutantlar elde edilen ve daha kolay C. elegansiçinde saklanır. Bu yöntem çeşitli C. elegans mutantlarla birleştirerek aksonal transport ve LFT moleküler mekanizmaları açıklığa kavuşturmak.

Aksonal DA9 nöron nakliyesi Anterograd ve retrograd aksonal transport GFP::RAB-3 wyIs251 satırını kullanarak aynı anda DA9 motor nöron kaydedilebilir. Anterograd ve retrograd DA9 nöron proksimal dorsal axon taşımacılığında ortalama hızı yaklaşık 1,8 ve 2.6 mikron/s, sırasıyla22var. 0.03 ve akson s başına mikron başına 0,018 hakkında hareketli veziküller sayısıdır. Böylece, bir 30 s gözlem DA9 akson 100 x lens ile 10 mikron için bir yakl...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonlar ve hücre içi taşıma çalışma için iyi bir modeldir. Burada, vivo içinde kayıt ve analiz C. elegansaksonlar ve intraflagellar taşıma için bir protokol açıklayın.

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Bu hızlandırılmış kaydın genel amacı, Caenorhabditis elegans nöronlarındaki hücre içi taşıma olaylarını gözlemlemektir. Bu yöntem, aksonal taşıma ve kamçılar arası taşıma gibi hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, C.Elegans'ta diseksiyon yapılmadan hücre içi taşınımın gözlenebilmesidir. Bu deneye, 20 yaşında ilgilenilen transgenik C.elegans türünü büyüterek başlayın

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Basit bir mikroakışkan cihaz anestezik ücretsiz gerçekleştirmek için...

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Kaynak: Doser, R., et al. Nöronal Kalsiyum İşleminin In Vivo Hücre Altı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, transgenik Caenorhabditis elegans suşlarının ventral sinir kordonu nöronlarındaki hücre altı kalsiyum akışının in vivo görüntülemesini göstermektedir. İki farklı kalsiyum indikatörü kullanılır: bir suşta bir sitoplazmik indikatör ve diğerinde bir mitokondriyal indikatör kullanılır. Nöronlar, nöronal sitoplazma ve mitokondri içindeki floresan yoğunluğundaki gerçek zamanlı...

Caenorhabditis elegans Nöronlarında Hücre Altı Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi...

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

Biz solucan amylopathies yönlerini incelemek için yöntemler...

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Hayvanın hareketsiz hale getirilmeden uzun zaman ölçeklerinde davranışı ve nöral aktiviteyi görüntülemek, davranışı anlamak için bir ön koşuldur. Agaroz mikroakışkan odacıkların görüntülenmesi (), Caenorhabditis elegans'ın tüm yaşam evreleri için nöral aktivite ve davranışı görüntülemek için kullanılabilir.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Bu iletişim kuralı Caenorhabditis elegans solucanlar davranışlar içinde sinirsel aktivite içinde genetik olarak kodlanmış Ca2 + gazetecilere kayıt değişiklikleri açıklar.

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

Bu yöntem çift optogenetik ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri görüntü bazal sitosolik kalsiyum düzeyleri ve model organizma C. elegansvücut duvarı kasları uyarılmış kalsiyum geçici değişiklikler için bir yol sağlar.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Makale, canlı bir nematoda tek nöron çözünürlüğünde endojen etiketli kargoların aksonal taşınmasını görselleştirmek için floresan mikroskobu edinim parametrelerinin optimizasyonunu açıklamaktadır.

Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

Keşfedin Caenorhabditis elegans nöronlarında hücre içi taşıma olaylarını canlı gözlemleme yöntemini. Bu teknik, diseksiyon veya anestezi gerektirmeden aksiyonel ve silyal taşımayı in vivo görselleştirmeyi sağlar.

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Daha fazla video keşfet