Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)

Bu ısı şokunun neden olduğu protein ekspresyon sisteminin genel amacı, böcek hücrelerinde potansiyel olarak fonksiyonel olarak antagonistik iki proteinde protein anti-apoptotik aktivitesini değerlendirmektir. Bu yöntem, biyoteknoloji ve proteomikteki aday proteinlerin anti-apoptotik aktiviteleri ve protein etkileşimleri gibi işlevleri ve aktiviteleri hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gen ekspresyonunun zamanlamasının ısı şoku indüksiyonu ile kontrol edilmesidir.

Dolayısıyla bu yöntem, proteinin fonksiyonel durumu hakkında fikir verebilir. Memeli protein ekspresyonu gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu protokolde kullanılan Spodoptera frugiperda veya Sf9 böcek hücreleri, 28 santigrat derecede 25 santimetre karelik hücre kültürü şişelerinde hücre kültürü ortamında büyütülür.

Hücreleri şişeden ayırmak için hücre kültürü şişesini sallayın. Ardından, hücrelerin yaklaşık% 80'inin ayrıldığından emin olmak için ışık mikroskobu altında kontrol edin. Hücre süspansiyonunun% 50'sini 25 santimetre karelik yeni bir hücre kültürü şişesine aktarın ve hücrelerin oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bağlanmasına izin verin.

15 dakika sonra, ortamı beş mililitre taze kültür ortamı ile değiştirin ve 28 santigrat derecede bir inkübatörde büyütün. Hücre büyümesine bağlı olarak, hücreleri her iki ila üç günde bir geçirin. Sf9 hücrelerini toplamadan önce, bakteri veya diğer mikroorganizmalar tarafından kontaminasyon olmadığından emin olmak için hücreleri ışık mikroskobu altında kontrol etmek önemlidir.

Sf9 hücrelerini hasat etmek için, hücreleri ayırmak için kültür şişesini sallayın ve ardından hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir P10 pipeti kullanarak, 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu bir hematitometreye aktarın ve ışık mikroskobu altında hücre sayısını sayın. 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 10 ila beşinci hücreyi üç kez plakalayın ve oda sıcaklığında 15 dakika bekletin.

15 dakika sonra, ortamı 0,5 mililitre kaplama ortamı ile değiştirin. Hücre transfeksiyon naibini hazırlayın. Her transfeksiyon için, sekiz mikrolitre hücre transfeksiyon reaktifini 100 mikrolitre serumsuz hücre kültürü ortamı ile seyreltin ve karıştırmak için bir saniye vorteksleyin.

Bu çalışmada, bakuloviral genin, apoptoz 3 inhibitörü veya IAP3'ün üç farklı kesilmesi, Drosophila ısı şoku 70 promotörünün, tam uzunlukta IAP3'ün, RING alanından yoksun bir kesmenin ve BIR alanından yoksun bir kesmenin kontrolü altında ifade edilecektir. Her bir plazmit DNA'sından iki mikrogramını 100 mikrolitre serumsuz hücre kültürü ortamına ekleyin ve bir saniye boyunca girdaplayarak karıştırın. Pozitif bir kontrol de hazırlayın.

Seyreltilmiş plazmit DNA'sını ve seyreltilmiş hücre transfeksiyon reaktifini birleştirin ve girdaplama ile karıştırın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bir P1000 pipeti kullanarak, hücrelerin üzerine damla damla her DNA transfeksiyon reaktif karışımından 210 mikrolitre ekleyin.

Beş saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Beş saat sonra, kaplama ortamını 0,5 mililitre hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve ardından 24 oyuklu plakayı bantla kapatın. 28 derecede inkübe edin.

Ertesi gün, plakayı 42 santigrat derece su banyosunda 30 dakika boyunca yüzdürerek protein ekspresyonunu indüklemek için ısı şoku. 30 dakika sonra, 24 oyuklu plakayı 28 santigrat derece inkübatöre geri koyun. Protein ekspresyonu daha sonra metin protokolünde tarif edildiği gibi Western blot ile doğrulanır.

Gen kaynaklı hücre apoptozunu incelemek için önce daha önce gösterildiği gibi Sf9 hücrelerini hazırlayın. Daha sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi transfekte edin, ancak her transfeksiyon reaksiyonunda bir apoptoz indükleyici geni içeren bir mikrogram plazmid ekleyin. Beş saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin, ortamı değiştirin ve 16 saat inkübe edin.

Transfekte edilmiş hücrelere 30 dakika boyunca 42 santigrat derecede ısı şoku uygulayın. Hücre canlılığı testini gerçekleştirmeden önce hücreleri beş saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Kimyasal kaynaklı hücre apoptozu için, altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna altı Sf9 hücresine bir kez 10 ila altı Sf9 yerleştirin.

Oda sıcaklığında 15 dakika bekletin ve ardından ortamı bir mililitre kaplama ortamı ile değiştirin. Hücreleri her bir plazmit DNA'nın dört mikrogramı ile transfekte edin. Beş saat sonra, kaplama ortamını bir mililitre hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve hücreleri 16 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra 30 dakika boyunca 42 santigrat derecede ısı şoku. Hücreleri, ısı şoku sonrası beş saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra apoptozu indüklemek için transfekte edilmiş hücreleri aktinomisin D ile tedavi edin.

Hücre canlılığı testini gerçekleştirmeden önce 28 santigrat derecede 16 saat inkübe edin. İşlem görmüş hücreleri yıkayarak bu işleme başlayın. Ortamı her kuyucuktan çıkarın, bir mililitre PBS ekleyin ve bir dakika bekletin.

Hücreleri bu şekilde PBS ile üç kez yıkayın. Her bir oyuktaki hücreleri% 04 tripan mavisi içeren bir mililitre PBS ile yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında üç dakika boyayın. Hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın.

10 mikrolitre tripan mavisi lekeli hücre süspansiyonunu bir hemasitometreye aktarın ve canlı sağlam hücreleri bir ışık mikroskobu altında sayın. Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi istatistiksel analiz gerçekleştirin. Lymantria xylina MNPV'den IAP3'ün tam uzunluğu ve iki kesilmesi Sf9 hücrelerinde aşırı eksprese edildi ve protein ekspresyonunu doğrulamak için hücre lizatları üzerinde Western blot yapıldı.

Anti-apoptotik protein Ac-P35 pozitif kontrol olarak dahil edildi. Tüm proteinler, transfekte edilmiş hücrelerde, ısı şokundan bir saat veya beş saat sonra, beş saatte daha yüksek bir ekspresyon ile tespit edilebilir. Bu sistem anti-apoptotik aktiviteyi değerlendirmek için uyarlanabilir.

Gen kaynaklı hücre apoptozu için, apoptoz indükleyicisi Drosophila Reaper, hedef gen plazmit yapıları ile Sf9 hücrelerine birlikte transfekte edildi ve daha sonra gen ekspresyonunu aktive etmek için ısı şoku verildi. Vektör Drosophila Reaper ile karşılaştırıldığında, pozitif kontrol, canlılık oranının% 80'ine ulaşan yüksek anti-apoptotik aktivite gösterdi. Diğer yapılar anti-apoptotik aktivite üzerinde çeşitli etkiler göstermiştir.

Kimyasal kaynaklı hücre apoptozu için, Sf9 hücrelerine sadece bir yapı transfekte edildi ve ısı şokundan beş saat sonra aktinomisin D eklendi. Pozitif kontrol veya negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, diğer yapılar anti-apoptotik aktivite üzerinde çeşitli etkiler göstermiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki ila üç gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, laminer akışta hücre kültürünün çalışma kurallarına uymayı unutmamak ve hücrelerin durumunu özenle kontrol etmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, böcek hücrelerinde birlikte eksprese edilen iki protein arasında herhangi bir etkileşim olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için ko-immünopresipitasyon gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, biyoteknoloji alanındaki araştırmacıların hayvan veya mikroorganizmalardaki protein fonksiyonlarını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, yabancı proteini eksprese etmek veya böcek hücrelerinde potansiyel olarak işlevsel olarak antagonistik proteinleri değerlendirmek için bu sistemin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Aktinomisin D gibi bazı kimyasallarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.