Name: Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Öğrenin, ısı şoku indüksiyonu ile Sf9 böcek hücrelerinde yabancı proteinlerin anti-apoptotik aktivitesini değerlendirme yöntemini. Bu teknik, protein fonksiyonlarını kontrollü bir şekilde incelemek için biyoteknolojide kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr. Jian-Horng Leu, Enstitüsü deniz biyoloji, Ulusal Tayvan Üniversitesi okyanus 3 plazmid yapılar sağlamak için teşekkür ederiz. Bu araştırma tarafından Grant 106-2311-B-197-001 - Bakanlığı bilim ve Teknoloji (en) destek verdi.

1. hazırlıkları
<ol><li>Böcek hücre kültürü<ol>
<li>Hücre kültür ortamının 50 mL hazırlayın. Bunun için antibiyotik 500 µL ekleyin (Amfoterisin B 0,25 µg/mL, penisilin = 100 birim/mL, streptomisin = 100 µg/mL =) ve ısı inaktive fetal sığır serum serum serbest hücre kültür orta (olmadan FBS veya antibiyotik) 5 mL. Not: Fetal sığır serum için kullanmadan önce bir su banyosunda 30 dk 65 ° C'de ısı.</li>
		<li>Spodoptera frugiperda korumak (Lepidoptera: Noctuidae), sf9 böcek hücreleri. CA. 25 cm2 hücre kültür şişesi hücrelerinden % 80'i şişeye sallayarak bağlantısını kesin ve ışık mikroskobu altında kontrol edin. Sonra hücre süspansiyon % 50'si yeni 25 cm2 hücre kültür şişesi aktarmak ve hücreleri 15 dakika oda sıcaklığında takmak izin verir. Orta ile 5 mL taze hücre kültür orta yerine ve 28 ° C'de bir kuluçka büyümek Geçiş hücreleri hücre büyümesini bağlı olarak 2-3 günde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plazmid hazırlanması için hücre transfection<ol>
<li>Hedef DNA parçalarının (Örneğin, Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gen ve onun silme yapıları) PCR tabanlı klonlama yöntemi11tarafından pDHsp/V5-onun yerleştirin. Kontrol dönüştürülmüş kolonilerin koloni tarafından büyüme PCR PCR Master Mix (2 X) ve pDhsp-F2/Op-IE2R astar kullanarak ayarlayın. Plazmid dizileri ticari sıralama hizmeti tarafından onaylayın. Not: Tablo 1 PCR ve karşılık gelen yapıları için kullanılan astar listeler.</li>
		<li>200 mL LB orta içeren olarak anılan plazmid yapılar (Adım 1.2) içeren kültür tek sıralı bakteri kolonileri, antibiyotik (50 µg/mL), sırasıyla seçili.</li>
		<li>Plazmid MIDI plazmid seti üreticisinin yönergeleri12göre kullanarak kültürlü E. coli ayıklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kaplama orta 1,5 mL hücre kültür ortamının ve 8,5 mL serum serbest hücre kültür ortamının karıştırarak hazırlayın.</li>
	<li>Hücre kültür orta 10 mL (1 mg/mL) ActD stokunun 1,5 µL ekleyerek Actinomycin D (ActD) hücre kültür ortamı hazırlamak (son konsantrasyonu 150 ng/mL =). 4 ° C'de mağaza</li>
</ol>2. protein geçici ifade
<ol><li>Tohum hücre<ol>
<li>Kültür şişesi sallayarak sf9 hücre hasat, devirmek ve hücre süspansiyon 50 mL tüp için düşmek ve 10 µL P10 pipet tarafından hemasitometre için transfer. Hafif bir mikroskop altında hücre saymak.</li>
		<li>Her şey bir 24-şey plaka 15 dakika oda sıcaklığında5 sf9 hücrelere plaka 3 × 10. Orta orta kaplama 0.5 mL ile değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plazmid transfection<ol>
<li>Seyreltik hücre transfection reaktif: 8 seyreltik µL hücre transfection reaktif 100 µL serum serbest hücre kültür orta ve 1 için vortexing tarafından mix s.</li>
		<li>Plazmid DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-O'nun veya pDHsp70-Ly-IAP3/V5-O'nun veya pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-O'nun veya pDHsp70-Ly-IAP3-yüzük/V5-O'nun) 100 µL serum serbest hücre kültür orta ve karışımı içine 2 µg vortexing 1 için eklemek s (Şekil 2).</li>
		<li>Seyreltilmiş plazmid DNA ve seyreltilmiş hücre transfection reaktifi (210 µL) birleştirmek ve oda sıcaklığında 30 dk 1 s. Incubate için vortexing tarafından karıştırın.</li>
		<li>DNA transfection reaktif karışımdan dropwise hücreleri üzerine 210 µL P1000 pipet tarafından ekleyin. 28 ° c 5 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Kaplama Orta hücre kültür P1000 pipet kullanarak Orta 0.5 mL ile değiştirin. Bant ile 24-şey plaka mühür ve 16 h için 28 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isı şok transfected hücreleri: 42 ° C su banyosunda (su yüzeyinde yüzen) plaka koymak. 30 dk için ısı ve 24-şey plaka 28 ° C kuluçka dönmek.</li>
	<li>Protein ifade tespiti<ol>
<li>1 h veya 5 h ısı şok sonra 0.5 mL 1 x PBS arabelleği hücrelerle kısaca üç kez yıkayın. Not: 9 mL steril GKD2için O 1 mL 10 x PBS arabelleği ekleyerek 10 x 1 x için PBS arabellek PBS arabellek sulandırmak</li>
		<li>1 x SDS yükleme boya 40 µL hücrelerle yukarı ve aşağı pipetting tarafından parçalayıcı. Not: 4 x SDS yükleme boya 30 µL PBS arabellek x 1 ve 4 SDS örnek arabellek x 10 µL karıştırarak oranında seyreltin.</li>
		<li>Protein örnekleri için bir ısı blok 10 min 98 ° C'de ısı, 1 dk. için spin aşağı ve Western blot tahlil için buz koymak.</li>
		<li>Western blot tahlil Western blot tahlil eren ve Lujan13yordamı. SDS-sayfa14jelleri çalıştırın: Coomassie mavi (protein örnekleri her içinde yüklü miktarda de tutara eşit olduğunu kontrol etmek için yükleme denetimi) Boyama tabi bir jel ve diğer Batı tabi blot yöntemi, eren ve Lujan13 göre .</li>
		<li>V5 öğesini füzyon protein tavşan anti-V5 antikor (5 mg/mL) (1: 5000 seyreltme konsantrasyonu 1 µg/mL çalışmaya TBST arabelleği) ve keçi Anti-tavşan IgG-horseradish peroksidaz (HRP) eşlenik (0,8 mg/mL) (1:10000 seyreltme çalışma TBST arabelleğe ile tespit konsantrasyon 0,08 µg/mL). Not: Polyacrylamide %17.5 yüzdesini ayarlamak zaman olmak protein molekül ağırlığı < 17 kDa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. anti-apoptotik etkinliği tahlil
<ol><li>Gene indüklenen hücre apoptosis: 2.3 için 2.1 üzerinden yukarıda belirtilen yordamı yineleyin. Transfect pDHsp/D-rpr/bayrak-O'nun plazmid DNA (içeren apoptosis uyarıcı gen) 1 µg 1 µg plazmid DNA'sı ile birlikte [pDHsp70/V5-O'nun vektör (negatif kontrol), pDHsp70-Ac-P35/V5-O'nun (pozitif kontrolü), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-O'nun, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-O'nun veya pDHsp70-Ly-IAP3-yüzük/V5-O'nun, sırasıyla.]. 5 h sonrası ısı şok tedavisi hücre canlılığı tahlil (Şekil 2) kuralları.</li>
	<li>Kimyasal kaynaklı hücre apoptosis: 2.3 için 2.1 üzerinden yukarıda belirtilen yordamı yineleyin. 2.1.2. adımda 1 x 106 sf9 hücreleri bir 6-şey plaka her kuyuya plaka. Plazmid DNA 4 µg transfect [pDHsp70/V5-O'nun vektör (negatif kontrol), pDHsp70-Ac-P35/V5-O'nun (pozitif kontrolü), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-O'nun, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-O'nun veya pDHsp70-Ly-IAP3-yüzük/V5-O'nun, sırasıyla.]. 5 h sonrası ısı şok, ActD hücre kültür orta 16 h için 2mL sf9 hücrelerle tedavi ve hücre canlılığı tahlil (Şekil 2) kuralları. Not: 6-şey plaka bir şey kapsayacak şekilde en az 1 mL birimdir.</li>
	<li>3.1 ve 3.2 triplicates dahil olmak üzere yukarıda anti-apoptotik etkinliği tahlil deneyler, gerçekleştirin.</li>
</ol>4. hücre canlılığı tahlil
<ol><li>İşlem görmüş hücreleri 3 kez 1 mL 1 x PBS arabelleği için 1 dk ekleyerek yıkayın. Hücreleri %0,04 trypan mavi içeren 1 mL 1 x PBS arabellek pipetting tarafından resuspend ve 3 dakika oda sıcaklığında leke. Hücre süspansiyon 1.5 mL microtube aktarın. Not: %0,4 trypan mavi çözüm 9 mL 1 x PBS tamponu ve 1 mL %0,4 trypan mavi çözeltisi karıştırılarak sulandırmak.</li>
	<li>Hafif bir mikroskop altında uygun sağlam hücreleri saymak ve 10 µL trypan mavi lekeli hücre süspansiyon hemasitometre P10 pipet ile transfer.</li>
	<li>İstatistiksel analiz<ol>
<li>Kaydedilen verileri hesaplamak ve mevcut tüm saymak anlamına gelir ± SD olarak.</li>
		<li>Microsoft Excel ile öğrencinin iki kuyruklu t-testi ile kullanarak veri analiz. İstatistiksel olarak anlamlı veri Ptanımlamak-değeri < 0,05.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviruses+as+gene+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Baculoviruses as gene expression vectors.</a> Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).</li>
<li>Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheilmann%2C+DA+%22Virus+Taxonomy%3A+Eighth+Report+of+the+International+Committee+on+Taxonomy+of+Viruses%22">Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses</a>. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).</li>
<li>Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNai%2C+YS+%22Biological+Control+of+Pest+and+Vector+Insects%22">Biological Control of Pest and Vector Insects</a>. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).</li>
<li>Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFriesen%2C+PD+%22The+Baculoviruses%22">The Baculoviruses</a>. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).</li>
<li>Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).</li>
<li>Luckow, V. A., Summers, M. D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt0188-47">Trends in the development of baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).</li>
<li>Jarvis, D. L., Finn, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+the+insect+cell+N-glycosylation+pathway+with+immediate+early+baculovirus+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).</li>
<li>Clem, R. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+programmed+cell+death+by+the+baculovirus+genes+p35+and+iap%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap.</a> Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).</li>
<li>Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+characterization+of+an+inhibitor+of+apoptosis+protein+%28IAP%29+from+the+tiger+shrimp%2C+Penaeus+monodon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon.</a> Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).</li>
<li>Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+promoters+for+transient+gene+expression+in+cultured+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells.</a> Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).</li>
<li>Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13355-016-0403-x">Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay.</a> Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).</li>
<li>Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf">http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf</a> (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2017).</li>
<li>Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+reaper-induced+apoptosis+by+interaction+with+inhibitor+of+apoptosis+proteins+%28IAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Isı şok tabanlı pDHsp/V5-O'nun/sf9 hücre sistemi kavramı ilk Clem ve ark. 19948tarafından tanımlanmıştır. Drosophila hsp70 baculoviral gen Düzenleyici (IE1) ile karşılaştırması gösterdi o hsp70 daha yüksek bir verim sivrisinek hücreleri10dakika sonra vardı. Ayrıca, ısı şok indüksiyon nedeniyle protein ifade zamanlama tam olarak ısı şok tedavi sonrası kontrol. Bu sistem o zaman protein için karides ve nucleopolyhedrovirus (NBD) işlevsel te...

İki protein ifade sistemleri yaygın olarak kullanılan proteinler üretmek için: prokaryotlar protein ifade sistemleri (Escherichia coli gen ifade sistemi) ve ökaryot protein ifade sistemleri. Bir popüler ökaryot protein ifade baculovirus ifade vektör sistemi (BEVS)1sistemidir. Baculoviruses ilk dünya çapında biyolojik mücadele etmeni tarım kullanılmıştır ve orman zararlıları. Son birkaç on yıl içinde baculoviruses için protein ifade vektörel çizimler de Biyoteknolojik araçları olarak geliştirilmiştir. Baculoviruses genleri çift iplikçikli dairesel DNA ve saran nucleocapsids2oluşur. , Yetmiş sekiz baculovirus bugüne kadar fazla yalıtır sıralı3olmuştur. Baculoviral gen ifadeleri ana böcek hücrelerinde zamansal çağlayan dayanarak, gen transkripsiyonu gecikme-erken, geç ve çok geç genler4erken acil-dahil olmak üzere dört zamansal cascades sınıflandırılır olabilir.
Böylece çok geç gen rehberleri (Yani, polihedron veya p10 organizatörü) rekombinant baculovirus homolog rekombinasyon tarafından oluşturulan iken hedef genlerin sürücü için kullanılan BEVSs belirlenmiş. İfade içinde böcek hücreleri rekombinant baculovirus tarafından yabancı proteinlerin translasyonel modifikasyonlar (glikoprotein üretimi için uygun) memeli proteinlerin benzer. Böylece, baculovirus yaygın olarak kullanılan5,6,7oldu. Ancak, bir sınırlama böcek hücreleri7farklı N-glikozilasyon yolları varlığıdır.
Bu nedenle, yeni bir baculovirus ifade sistem geçici gen ifade sistem geliştirilmiştir. Bu sistem baculoviral erken hemen rehberleri (yani-1 organizatörü) böcek hücrelerinde sürücü altında yabancı genlerin ifade eder. Bu sistemi kullanarak, hedef protein hemen yani-1 düzenleyicinin kontrolü altında daha iyi N bağlı oligosakkaritler7' kaynaklanan N-glikozilasyon yolu böcek hücrelerinde değiştirirken ifade edilebilir. Ayrıca, baculoviral erken hemen genler konak hücre RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonu ve viral herhangi bir faktör harekete geçirmek4için gerek yoktur. Bu nedenle, yabancı proteinler kısa bir süre içinde böcek hücrelerinde ifade edilebilir. Bugüne kadar geçici gen ifade sistem baculovirus vitro hücre kültür sistemi içinde protein işlevsel testleri gerçekleştirmek için kullanılan en önemli teknolojileri biridir. Sistem işlevi ya baculovirus ya da yabancı proteinler, analiz etmek için uygulanır. Piyasada bulunan geçici gen ifade sistemlerinden birini Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 ve OpIE1 rehberleri) erken hemen gen (IE) Organizatör üzerinde temel alır.
Ancak, OpIE organizatörü tabanlı geçici gen ifade sistemi kullanılan8,9,10yaşındayken alt ifade düzeyinde böcek hücreleri yabancı genlerin hala bir sorun oldu. Böylece, başka bir geçici gen ifade sistem Drosophila ısı şok protein 70 (hsp70) gen8,9organizatörü dayalı inşa edilmiştir. Hsp70 organizatörü baculoviral IE organizatörü böcek hücreleri10şokta ısı çarpması çok daha etkili biçimde çalışır. Bu sistemde, Drosophila ısı şok 70 (Dhsp70) organizatörü sürücü altında hedef genlerin ifade edildi. Yabancı genlerin kolayca PCR tabanlı klonlama yöntemlerle geçici gen ifade plazmid kopyalanmış. Ayrıca, gen ekspresyonu için zamanlama kontrolünü ısı şok indüksiyon tarafından gerçekleştirilebilir.
Bu rapordaki yaklaşımı izleyin ve baculoviral gen (apoptosis 3 inhibitörü, Lymantria xylina MNPV dan iap3 ) üç farklı truncations ısı şok tabanlı geçici protein ifade sistemi kullanarak hızlı ve daha fazla ifade bu proteinler anti-apoptotik etkinlik analizi üzerinde uygulamak. Bu sistem de yabancı proteinler hızlı bir şekilde ifade edebilir ya da daha fazla protein anti-apoptotik faaliyet sf9 hücrelerdeki değerlendirilmesi de diğer protein etkinlik deneyleri için uygulanacak potansiyele sahip iken uygulanması.

<table><tbody><tr><td>Böcek hücre kültürü için</td> <td>Antibiyotik-Antimikotik, 100X</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td></tr><tr><td>Sertifikalı Fetal Sığır Serumu</td><td>Bioind</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10902096</td><td>serumsuz hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Sf9 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 hücre kültürü şişesi</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>Ters çevrilmiş ışık mikroskobu</td><td>WHITED</td><td>WHITED WI-400</td><td></td></tr><tr><td>RBC HIT Yetkili Hücre</td><td>Biyomanı</td><td>RH618-J80</td><td>Escherichia coli (DH5&alfa;)</td></tr><tr><td>L.B. Et Suyu (Değirmenci)</td><td>Bioman</td><td>LBL407</td><td></td></tr><tr><td>Agar, Bakteriyolojik Sınıf Bioman</td><td></td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Zeosin</td><td>İnvitrojen</td><td>ant-zn-1</td><td>seçimi antibiyotik</td></tr><tr><td>PCR Master Mix (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Geneaid Midi Plazmid Kiti (Endotoksin İçermez)</td><td>Geneaid</td><td>PIE25</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>SIGMA</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50 mL santrifüj tüpleri</td><td>SIGMA</td><td>CLS430829-500EA</td><td>50 mL tüpler</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Gizmo Tedarik Co</td><td>B-CNT-SLDE-V2</td><td></td></tr><tr><td>24 Kuyulu Çok Çanaklı</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>142475</td><td>24 oyuklu plaka</td></tr><tr><td>Cellfectin II Reaktifi</td><td>Thermo Fisher</td><td>10362100</td><td>hücresi transfektin reaktifi</td></tr><tr><td>PBS-Fosfat Tamponlu Tuzlu (10X) pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>4 kez; SDS Yükleme Boyası</td><td>Bioman</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (PVDF Lekeleme Membranları)</td> <td>Merck Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF membranları</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Hücre sistemi</td><td>BIO-RED</td><td>1703930</td><td>Kurutma cihazı</td></tr><tr><td>Ponceau S çözümü</td><td>SIGMA</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-V5</td><td>SIGMA</td><td>V8137</td><td>tavşan anti-V5 antikoru</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG-yaban turpu peroksidaz (HRP)</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>817072</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu Çok Tabaklı</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>145380</td><td></td></tr><tr><td>%0,4 tripan mavisi çözelti</td><td>AMRESCO</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>P10 pipetleyici</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetleyici</td><td>Gilson</td><td></td><td></td>F123602</tr><tr><td>Bant</td><td>Symbio</td><td>PPS7</td><td>24 kuyulu bant (19 mm ve kez; 36 M)</td></tr></tbody></table>

geçici ifade, yabancı genlerin protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Geçici gen ifade sistem baculovirus vitro hücre kültür sistemi içinde protein fonksiyonel analiz gerçekleştirmek için en önemli teknolojileri biridir. Bu sistem geçici ifade plazmid baculoviral düzenleyicinin kontrolü altında ifade yabancı genleri için geliştirilmiştir. Ayrıca, bu sistemin fonksiyonel testin kendisi baculovirus veya yabancı proteinler için uygulanabilir. En yaygın ve ticari olarak kullanılabilir geçici gen ifade sistem Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) erken hemen gen (IE) organizatörü göre geliştirilmiştir. Ancak, düşük ifade düzey böcek hücreleri yabancı genlerin gözlendi. Bu nedenle, bir geçici gen ifade sistemi protein ifade artırmak için inşa edilmiştir. Bu sistemde, rekombinant plazmid Drosophila ısı şok 70 (Dhsp70) düzenleyicinin kontrolü altında hedef sıra içerecek şekilde inşa edilmiş. Bu iletişim kuralı bu ısı şok tabanlı pDHsp/V5-O'nun (V5 epitop 6 histidin ile) uygulanması sunar /Spodoptera frugiperda hücre (sf9 hücre) sistemi; Bu sistem sadece gen ekspresyonu böcek hücrelerinde aday proteinlerin anti-apoptotik etkinliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, bu sistem de bir rekombinant plazmid ile transfected ya da iki potansiyel olarak işlevsel antagonistik rekombinant plazmid böcek hücrelerinde ortak transfected. Protokol bu sistemin verimliliği gösterir ve bu teknik pratik olgusu sağlar.

Tam uzunlukta ve diğer iki truncations (BIR ve yüzük etki alanları), Ly-IAP3 LyxyMNPV dan sf9 hücrelerinde ısı şok tabanlı pDHsp/V5-O'nun üzerinde dayalı overexpressed /Spodoptera frugiperda hücre (sf9 hücre) sistem. PDHsp/V5-O'nun hangi hücresel transkripsiyon faktörleri ve çeviri sistemi (şekil 1)8 kullanarak 42 ° C durumu bir ısıda aşağı akım gen ekspresyonu sürücüler bir Drosophila ısı şok protein organizatö...

Yabancı proteinler ifade veya anti-apoptotik etkinliğini potansiyel yabancı proteinler ve onların kesilmiş amino değerlendirmek için kullanılabilir bir ısı şok kaynaklı protein ifade sistemi (pDHsp/V5-O'nun/sf9 hücre), bu iletişim kuralını açıklar asitler böcek hücrelerinde.

Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Bu ısı şokunun neden olduğu protein ekspresyon sisteminin genel amacı, böcek hücrelerinde potansiyel olarak fonksiyonel olarak antagonistik iki proteinde protein anti-apoptotik aktivitesini değerlendirmektir. Bu yöntem, biyoteknoloji ve proteomikteki aday proteinlerin anti-apoptotik aktiviteleri ve protein etkileşimleri gibi işlevleri ve aktiviteleri hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gen ekspresyonunun zamanlamasının ısı şoku indüksiyonu ile kontrol edilmesidir.Dolayısıyla bu yöntem, proteinin fonksiyonel durumu hakkında fikir verebilir. Memeli protein ekspresyonu gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu protokolde kullanılan Spodoptera frugiperda veya Sf9 böcek hücreleri, 28 santigrat derecede 25 santimetre karelik hücre kültürü şişelerinde hücre kültürü ortamında büyütülür.Hücreleri şişeden ayırmak için hücre kültürü şişesini sallayın. Ardından, hücrelerin yaklaşık% 80'inin ayrıldığından emin olmak için ışık mikroskobu altında kontrol edin. Hücre süspansiyonunun% 50'sini 25 santimetre karelik yeni bir hücre kültürü şişesine aktarın ve hücrelerin oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bağlanmasına izin verin.15 dakika sonra, ort

transient-expression-foreign-genes-insect-cells-sf9-for-protein

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Alphavirus uyum sistemlerini kullanarak in vitro ve erişkin sivrisinek floresan gazetecilere ifade etmek için yöntemler açıklanmıştır. Bu teknik, yerine ya da ek olarak bir muhabir ilgi herhangi bir protein ifade etmek için adapte olabilir.

Alphavirus uyum Sistemi: Sivrisinek Vektörler Enfeksiyon görselleştirme için Araçlar

Burada böcek hücrelerinde yeni Çin H7N9 virüsünden türetilen doğru katlanmış ve işlevsel bir influenza virüsü yüzey antijenlerini eksprese etmek için bir yol tarif eder. Bu teknik, bir viral veya hücre yüzey proteinlerinin ektoalanlarının ifade etmek için uyarlanabilir.

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Bu çalışmada, hedef insan rekombinant proteininin farklı üretim platformlarındaki ekspresyonu karşılaştırıldı. Geleneksel fermentör bazlı kültürlere ve bitkilere odaklandık, her bir sistemin kurulumunu açıkladık ve rapor edilen sonuçlara dayanarak her platform için doğal sınırları ve avantajları vurguladık.

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Ökaryotik proteinlerin uygun translasyon sonrası modifikasyonla laboratuvar ölçeğinde üretimi önemli bir engel teşkil etmektedir. İşte bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak protein ekspresyonu için hızlı kuruluş ve geri dönüşe sahip sağlam bir protokol. Bu sistem, seçici amino asidi, proteinlerin seçici etiketlenmesini ve glikan bileşiminin küçük molekül modülatörlerini destekler.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Nonlytic böcek hücresi ifade sistemleri üretim, selüler trafik / lokalizasyonu ve rekombinant protein, fonksiyonel analiz için atıl edilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen bir lepidopteran hücresi çizgilerinde ifade vektörleri ve daha sonra geçici protein sentezlenmesinin üretilmesi için yöntemleri tarif eder. Hücre içi fluoresan işaretleyici proteinleri ile Bemisia tabaci aquaporins eş yerleşimi de sunulmuştur.

Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Burada, bir aracılı baculovirus böcek hücre ifade sistemi ile ev sinek carboxylesterase proteinler vitro üretmek ve daha sonra işlevsel olarak Permetrin, metabolize onların rolleri böylece, karakterize bir protokol pyrethroid veriyor mevcut rezistansının hücre tabanlı MTT tahlil ve vitro metabolik çalışmalar yürütmektedir.

Carboxylesterases böcek ilacı dayanıklı ev sinekleri, sinek Domestica içinde işlevsel karakterizasyonu

Burada, bitki salgılanan proteinler için protein kristalizasyon büyük miktarlarda üretmek için böcek hücre ve baculovirus protein ifade sistemi kullanan iletişim kurallarını mevcut. Bir baculovirus ifade vektör GP67 ya da böcek hemolin sinyal peptid bitki protein salgılanması ifade böcek hücrelerinde ile değiştirildi.

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

Baculovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVS), biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalarda kullanılacak protein arginin metiltransfenazlarının (PRMT) ekspresyon taraması ve üretimi için sağlam bir platformdur. Milligram miktarda malzeme, ökaryotik bir ifade platformu gerektiren PRMT'lerin ve diğer ilgi proteinlerinin çoğunluğu için üretilebilir.

Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

Sonbahar ordu kurdunda başarılı germline dönüşümü, Spodoptera frugiperda, hiperaktif piggyBac transposase mRNA kullanılarak elde edildi.

Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda

Öğrenin, ısı şoku indüksiyonu ile Sf9 böcek hücrelerinde yabancı proteinlerin anti-apoptotik aktivitesini değerlendirme yöntemini. Bu teknik, protein fonksiyonlarını kontrollü bir şekilde incelemek için biyoteknolojide kullanılır.

Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)

Daha fazla video keşfet