Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli

Bu prosedürün genel amacı, insan embriyonik türevli retinal pigment epitel hücrelerini göze nakletmek ve optik koherens tomografi kullanarak donör hücre entegrasyonunu değerlendirmek için büyük gözlü bir coğrafi atrofi hayvan modeli oluşturmaktır. Bu yöntem, dejeneratif hastalıklar için kök hücre bazlı tedavi gibi rejeneratif tıp alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu cerrahi ortamın ana avantajı, sınırsız sağlıklı hücre kaynağı ve hastaya yönelik bir prosedürle birçok benzerliği olan subretinal enjeksiyon için cerrahi ortamdır.

Bu tekniğin etkileri, insan embriyonik kök hücrelerinden türetilen retinal pigment epitel hücrelerinin gösterişli olması yoluyla yaşa bağlı makula dejenerasyonunun tedavisine kadar uzanır. Hayvan teknisyenimiz Monica Aronsson, optik koherens tomografi ile retinayı görselleştirebilmemiz ve görüntüleyebilmemiz için tavşanı pozisyonda tutuyor. Metin protokolüne göre bir tavşanı uyuşturduktan sonra, tavşanı başı cerraha bakacak şekilde cerrahi mikroskobun altına yerleştirin.

Ardından, göz kapaklarını çıkarmak için bir kapak ekartörü ve nictitans zarını çıkarmak için steril bir bez kullanın. Mikrocerrahi için, mikrocerrahi aletlerin yerleştirilmesi için valfsiz trokarlarla iki portlu veya isteğe bağlı üç portlu 25 gauge transvitreal pars plana tekniği kullanın. Çok fonksiyonlu vitrektomi makinesi, bir infüzyon kanülü, endoillüminasyon, bir vitrektör ve bir endolazer bağlamak için bağlantı noktalarına sahiptir.

Subretinal enjeksiyonlar için sadece endolülüminasyon zorunludur, bu da iki portlu bir kurulumu yeterli kılar. Konjonktivayı tutmak ve yerinden çıkarmak için pıhtı forseps kullanarak, yerleştirme bölgesinin üzerini çizin. İki üst trokardan birini, limbustan bir ila iki milimetre uzakta, otuz ila kırk beş derecelik bir limbus paralel açıyla transskleral olarak yerleştirin.

Trokarı ucun ortasına yerleştirmeye devam edin. Ardından, trokarı doksan derece çevirin ve arka kutbu hedefleyerek göze doğru ilerletin. Bu, bu sklerotomiden ameliyat sonrası sızıntıyı önleyecek ve ayrıca endoftalmi riskini azaltacaktır.

İkinci üst trokar ile tekrarlayın. Trokarı yerleştirirken, enfeksiyon, vitreus kanaması, retina dekolmanı ve lens teması riskini en aza indirmek için yerleştirmeyi tünellemek ve arka kutba nişan almak için limbustan bir ila iki milimetre uzakta olmak önemlidir. Korneaya kasılma jeli olarak sentetik gözyaşları uygulayın, ardından retinayı görselleştirmek için kornea üzerine tek kullanımlık düz bir kontakt lens yerleştirin.

Daha sonra, bir asistan tarafından çalıştırılan bir uzatma tüpüne ve cerrah tarafından çalıştırılan 38 gauge çok uçlu bir kanüle bağlı bir mililitrelik şırıngaya beş yüz mikrolitre Sodyum iyodat bırakın. Endolülüminasyon probunu sol üst trokardan geçirin. Ardından, enjeksiyon kanülünü sağ üst trokardan yerleştirin ve kanülü vitreus boşluğundan retinaya doğru ilerletin, optik sinir başının hemen altındaki alanı hedefleyin.

Fokal bir beyazlama görünene kadar kanülün ucunun retinaya yavaşça temas etmesine izin verin. Kanülün retinaya nüfuz etmesine izin vermeyin çünkü bu kanamaya neden olabilir. Şimdi, iğne ile retinaya nüfuz ederek, beş saniyelik bir süre boyunca subretinal olarak elli mikrolitre Sodyum iyodat enjekte edin.

Retina ile alttaki koroid arasında doğal bir bölünme düzlemi olduğundan, enjeksiyon sırasında yavaş yavaş açıkça görülebilen yarı saydam bir kabarcık oluşmalıdır. Enjekte ederken, iğneyi yavaşça geri çekin, ancak reflüyü en aza indirmek için ucun kabarcık içinde tutulduğundan emin olun. Endolülüminasyon ve enjeksiyon kanülünün çıkarılmasının ardından, trokarları çıkarmak için pıhtı forsepsleri kullanın.

Ardından, yumuşak sızdırmaz dikişsiz sklerotomiye otuz saniye boyunca hafif basınç uygulamak için forsepsin ucunu veya künt ucunu kullanın. İyileşme sırasında, metin protokolüne göre hayvana katılın ve nakil için yedi gün bekleyin. Sodyum iyodat enjeksiyonundan yedi gün sonra ve intravitreal Triamsinolon uygulamasını takiben, metin protokolüne göre, hücre farklılaşma ortamını yirmi dört iyi birleşmiş hESC-RPE tek tabakasından çıkarın ve her bir kuyuyu yıkamak için kalsiyum ve magnezyum içermeyen beş yüz mikrolitre PBS kullanın.

Hücreleri tripsinledikten sonra, plakayı eğin ve hücrelerin plakaya bağlı kalmasını sağlamak için tripsini dikkatlice çıkarın. Hücreleri, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için hafifçe pipetleyerek veya hatta gerekirse kazıyarak sekiz yüz mikrolitre taze otuz yedi santigrat derece önceden ısıtılmış farklılaşma ortamında toplayın. Sıfır nokta yüzde iki tripan mavisi kullanarak, bir hemositometre odasındaki hücreleri üreticinin talimatlarına göre sayın.

Daha sonra hücre süspansiyonuna beş mililitre farklılaşma ortamı ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca üç yüz kez g santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti, mikrolitre başına bin hücrelik bir nihai konsantrasyonda taze filtreyle sterilize edilmiş PBS'de yeniden askıya alın. Önceki hücre süspansiyonunu altı yüz mikrolitrelik alikotlara ayırın ve ameliyat sırasında ve ameliyat sırasında buz üzerinde tutun.

Tavşanı uyuşturduktan ve göz bebeklerini metin protokolüne göre genişlettikten sonra, tavşanı başı cerraha bakacak şekilde yerleştirin. Göz kapaklarını çıkarmak için kapak ekartörü ve nictitans zarını çıkarmak için steril bir bez kullanın. Mikrocerrahi için, bu videoda daha önce gösterildiği gibi aynı pozisyonlara yerleştirilmiş trokarlarla iki portlu veya isteğe bağlı üç portlu 25 gauge transvitreal pars plana tekniği kullanın.

Önceki sklerotomiler görülebiliyorsa, ameliyat sonrası sızıntı riskini en aza indirmek için bu yerleştirme bölgelerinin hemen bitişiğinde, ancak bu yerleştirme bölgelerinden değil, trokar yerleştirilmesi gerçekleştirin. Daha önce olduğu gibi göze sentetik gözyaşları uygulayın ve retinayı görselleştirmek için kornea üzerindeki solüsyonun üzerine tek kullanımlık düz bir kontakt lens yerleştirin. Ucu düzgün bir şekilde konumlandırdıktan ve karakteristik bir metalik endolülüminasyon refleksi ile ayırt edilen Sodyum iyodat ön işlem görmüş alanın merkezini hedefledikten sonra, hafifçe karıştırılmış bir hESC-RPE süspansiyonunun elli mikrolitresini subretinal olarak enjekte edin.

Nörosensoriyel retina kolayca ayrılmalı ve açıkça görülebilen bir kabarcık oluşturmalıdır. Enjeksiyon sırasında iğneyi yavaşça geri çekin, ancak reflüyü en aza indirmek için ucun kabarcık içinde tutulduğundan emin olun. Endolülüminasyon ve enjeksiyon kanülünün çıkarılmasından sonra, trokarları çıkarmak için pıhtı forsepsleri kullanın ve forsepslerin künt ucunu daha önce olduğu gibi otuz saniye boyunca hafif basınç uygulamak için kullanın.

Üreticinin talimatlarına göre, tedavi edilen hayvanların kesitsel B taramalarını elde etmek için beraberindeki yazılımla birlikte bir spektral alan optik koherens tomografisi veya SD-OCT cihazı kullanın. Alet ışık kaynağından tavşan retinasına engelsiz bir yol elde etmek için anestezi uygulanmış ve göz bebeği genişlemiş hayvanı ayarlanabilir bir yuvaya yerleştirin. Görüntü bulanıklığını önlemek için, her otuz ila altmış saniyede bir topikal tuzlu su ile yıkayarak korneayı nemli tutun.

Enjekte edilen alanın üst, orta ve alt kısmını temsil eden eşzamanlı kızılötesi konfokal taramalı lazer oftalmoskopi veya konfokal SLO yansıma referans görüntüleri ile en az üç OCT taraması elde edin. Konfokal SLO mavi, yeşil, kızılötesi ve çok renkli lazer yansıması ile yüz fundus görüntülerinin aynı anda birden fazla lazer rengi elde edin. SD-OCT cihazının mavi ışık lazer özelliğini kullanarak mavi ışıklı otomatik floresan görüntüler yakalayın.

Normal bir albino tavşan retinasının BAF, IR-cSLO ve SD-OCT'nin temsili in vivo görüntüleri burada gösterilmektedir. SD-OCT görüntüsünün şişirilmiş bir görüntüsü, SD-OCT cihazı tarafından yakalanan farklı ışık yansıma seviyeleriyle farklı retina katmanlarını gösterir. Bu SD-OCT görüntüsünde gösterildiği gibi, elli mikrolitre bir milimolar Sodyum iyodat çözeltisinin enjeksiyonundan üç ay sonra çekilen, dış retinayı çözen ve aşamalı olarak dejenere eden bir kabarcık oluşturulur.

SD-OKT ve hipo-BAF alanlarındaki en dıştaki nöroretinal tabakaların incelmesi gözlenebilir, bu da RPE kaybına karşılık gelir ve böylece GA benzeri bir fenotip oluşturur. Hasar alanının belirlenmesinin ardından, elli bin hESC-RPE hücresi transplantasyon için yeniden enjekte edildi ve çözülen ikinci bir kabarcık oluşturuldu. Hafif ila orta derecede hiper-BAF alanları, doğal RPE'nin kronik stresinin göstergesi olarak, hasar alanının sınırında fokal olarak artmış bir hiper-BAF ile mevcuttur.

MC görüntüsünde pigmentli hücre yamaları ve SD-OCT taramasında iyi korunmuş retina yapıları gösteren önceden tedavi edilmemiş gözlerde hESC-RPE'lerin enjeksiyonuna karşılık gelen bleb karşılaştırma için gösterilmiştir. Subretinal enjeksiyon için bu güzel klinik yönteme hakim olmak, yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi durumlar için hücre bazlı tedavinin klinik transplantasyonunu kolaylaştıracaktır. Bu videoyu izledikten sonra, bir yaşam tipi modelde subretinal enjeksiyonların nasıl kurulacağı, subretinal enjeksiyonlar için insan embriyonik kök hücre türevi hücrelerin nasıl hazırlanacağı ve optik koherens tomografi kullanılarak donör hücrelerin entegrasyonunun nasıl görselleştirileceği hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.