Name: Diseksiyon ve Explant kültür Allantoic eki Vitro analizi için fare Allantois ve (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Keşfedin fare allantois diseksiyonu ve explant kültürü yöntemiyle koryoallantoyik bağlanmayı in vitro modelleme. Bu teknik, plasenta oluşumunun ilk kritik adımını araştırmak için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (için A.G.) tarafından desteklenmiştir.

Fare üreme Regierung Unterfranken tarafından kabul edildi ve tüm analizler tüm Alman ve Avrupa Birliği yasalara ve yönetmeliklere bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı ile ilgili sıkı doğrultusunda gerçekleştirilmiştir.
1. Microtiter kaplama α4β1 Integrin ile Eski Utero Allantois Explant kültür için tabaklar
<ol><li>200 µg/mL steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), fare α4β1 liyofilize integrin sulandırmak. Önceden ısıtılmış (37 ° C) PBS 10 µg/mL nihai bir konsantrasyon oranında seyreltin. Pipet 20 µL/kuyu kuyu microtiter plaka (1 allantois/de) gerekli sayıda seyreltilmiş α4β1 integrin çözümde. Not: microtiter plaka kuyu kaplama hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek.</li>
	<li>37 ° C'de 60 dk microtiter plakaları bir oksijen doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirerek kuluçkaya.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant bir pipet ile Aspire edin. Pipet ucu iyi alt dokunmadan önlemek için plaka eğim ve yumuşak emici kullanın. İki kez Önceden ısıtılmış (37 ° C) kültür ortamının gibi Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) 50 µL ekleyerek Wells yıkama ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın.</li>
	<li>Kritik adım: ücretsiz siteleri 50 µL/kuyu %0,1 (w/v) sığır serum albumin (BSA) ekleyerek bağlama blok / DMEM ve oksijen doku kültürü kuluçka makinesine microtiter plakaları yerleştirerek ≥ 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. Not: Allantois explants varlığında serum çeşitli yüzeyler ekleyebilirsiniz. Bu nedenle non-spesifik bağlayıcı siteleri engellemek için şarttır, kaplama sonra kuyu integrin ile disseke allantois eklemeden önce serum içeren kültür explant orta (bkz. Adım 4.4).</li>
	<li>Kaplamalı wells adım 4.4 gerekinceye kadar 37 ° C'de engelleme çözümde tutun.</li>
</ol>2. rahim diseksiyon Dpc 8, hamile bir fareden
Not: ağırlık kazanç ayrımcılık15tarafından yanlış pozitif gebelik oranları azaltmak.
<ol><li>Fare tarafından servikal çıkığı kurban. Karın bölgesi kürkle % 70 (v/v) etanol ile püskürtülerek dezenfekte. Not: fareler işlerken eldiven. Ötenazi anestezi olmadan servikal çıkığı tarafından allantois eki ile girişime neden olabilir allantois kimyasal kirlenme engeller.</li>
	<li>Karın deri makasla orta hat küçük bir kesi yaparak dosyayı açtı. Cilt kesi altında ve üstünde tutmak için eldivenli parmak kullanmak ve cilt göğüs ve fare kuyruğu doğru ayır.</li>
	<li>Karın zarını Forseps ile kavramak. Diğer el ile yapmak bir V şeklinde kesi gelen ön arka doğru makas kullanarak ve karın boşluğu açıklamakla doku taşıyın. Forseps bağırsak rahim erişim kazanmak için bir kenara itmek için kullanırız.</li>
	<li>İki rahim korna bulun. Forseps ile serviks (Kaudal kesim) tutun ve ligament iyi makasla kesme. Sonra her iki rahim boynuzları makasla oviducts kesilmesinin tarafından bağlantısını kesin.</li>
	<li>Forseps oda sıcaklığında (RT) PBS içeren bir steril 10 cm çanak içine steril, rahim aktarmak için kullanın. Yağ dokusu, damarları ve sinirleri çevreleyen güzel forseps ve/veya makas (şekil 1A) ile rahim boynuzları kaldırın.</li>
</ol>3. embriyo diseksiyon
Not: bir 8:1 zum mesafesi ile donatılmış bir stereomicroscope altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
<ol><li>Embriyo implantasyonu siteler arasında keserek makas ile ayırın. Kas rahim astarı rahim tomurcukları Forseps ile tutun ve decidua (şekil 1B) ortaya çıkarmak için ayrı çekin.</li>
	<li>Forseps kullanarak, rahim tomurcukları RT PBS steril, içeren yeni bir 10 cm tabak içine aktarın.</li>
	<li>Decidua embriyo çevresinde forseps ipuçları ile düzeltmek.</li>
	<li>Bir kesik decidua anti-mesometrial tarafında iyi forseps (şekil 1 c) ile yapmak ve decidua peel away Forseps ile embriyo (şekil 1 d) ortaya çıkarmak için. Not: Decidua mesometrial pole son derece skarların ve embriyo içerir ve solgun görünür en anti-mesometrial kısmı, onun temel geniş olabilir.</li>
	<li>Embriyo forseps (şekil 1E, F) ile incelemek.</li>
	<li>Bir mikro-kaşık kullanarak, steril PBS bir steril 3.5 cm tabak içinde yer alan bir damla içine embriyo transfer.</li>
	<li>PBS bir mikro-kaşık kullanarak aynı 3.5 cm tabak taze bir damla içine embriyo transfer ve embriyo forseps (şekil 1G, H) kullanarak sarısı sac dan incelemek.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, (örneğin, Genotipleme Polimeraz zincir reaksiyonu tarafından için) gerekirse, sarısı sac steril tüpe bununla aspirating tarafından transfer ~ 5 µL PBS büyük delik 200 µL pipet ucu içine. -20 ° C'de mağaza Not: sarısı sac hazırlama kontamine anne doku (Yani, parietal sarısı Reichert'ın membran ve ectoplacental koni gibi sac) hatalı Genotipleme sonuçlara yol açabilir. Bu doku kaldırılması embriyo diseksiyon sarısı sac dan önce en kolay yoldur.</li>
</ol>4. allantois diseksiyon ve Eski Utero kültür immobilize α4β1 Integra üzerinde
<ol><li>Allantois iyi forseps (şekil 1 H) kullanarak embriyo posterior sonundaki Bazal ekleme sitesinden kesti.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, gelişimsel evreleme gerekiyorsa, embriyo somite çift faz kontrast optik ve 5 × ve 10 × amacı ile donatılmış bir mikroskop kullanarak görsel denetim tarafından saymak. Not: Embriyo somite sayma kolaylaştırmak için Forseps ile uzatılabilir. Chorioallantoic eki ve füzyon E 8.0 ve E 9.0 arasında embriyo ≥ 6 somite çiftleri ile oluşur. Dönüm embriyo 6-8 somite çiftleri ile başlar.</li>
	<li>Pipet 40 µL/kuyu % 10 (v/v) fetal sığır serum, L-glutamine ve önceden kaplanmış microtiter plaka wells (bkz. Bölüm 1) gerekli sayıda antibiyotik ile takıma DMEM.</li>
	<li>Bununla aspirating tarafından kayan allantois toplamak ~ 5 µL PBS 200 µL pipet ucu büyük bir delik içine. 1 allantois/iyi transfer.</li>
	<li>Örneğiniçin bir oksijen doku kültürü kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) microtiter tabak koyarak allantoides kuluçkaya 6, 12 ve 24 h. Allantois eki ile etkilenmemesi için microtiter plakaları bu zaman puan arasında hareket.</li>
	<li>Her zaman noktada allantois ek (örneğin, hiçbir eki/yüzer allantois kısmi veya tam olarak ekli allantois; tam yayılmış allantois) puan edinildi faz kontrast veya diferansiyel girişim kontrast optik ile donatılmış bir mikroskop kullanarak ve 5 × veya 10 × hedef (Şekil 2). Not: Taze izole ve tam olarak ekli allantoides temsilcisi örnekleri Şekil 2' de gösterilmiştir. Allantoides wildtype C57BL/6J fareler izole distal ucu rahim, verdiği 4-6 h (Bu adlandırılır allantois kısmi ek olarak) içinde ve tüm allantois tam eki içinde elde ~ kültür 12 h. Explant tarafından 18-24 h, basık ve dairesel bir şekil (tam olarak allantois yaymak için denir) ile bir CD31 pozitif vasküler pleksus9,16kabul.</li>
</ol>5. doğrulama Explanted Allantois endotel hücre işaretçisi CD31 için boyama
<ol><li>Tam yayılmış explants kültür orta Aspire edin ve hücreleri % 4 (w/v) paraformaldehyde/PBS 40 µL/kuyu ekleyerek düzeltmek. Not: Paraformaldehyde zehirlidir. Cilt ve göz teması önlemek için koruyucu gözlük ve eldiven giymek.</li>
	<li>RT, 10 min için kuluçkaya sonra süpernatant Aspire edin. PBS 40 µL/kuyu ekleyerek üç kez yıkama ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın.</li>
	<li>Hücreleri permeabilize ve non-spesifik bağlayıcı siteleri blok 40 µL/iyi % 0.1 (v/v) dik yıkama 30 dk için PBS içinde Triton X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) normal keçi serum ekleyerek iki kez PBS 40 µL/kuyu ekleyerek ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın. Not: Protokol gecede bu noktada duraklatılmış.</li>
	<li>Hücreleri 20 µL/iyi birincil anti-CD31 antikorların 1:50 % 0,1 (w/v) BSA/PBS içinde seyreltilmiş ekleyerek gecede 4 ° C'de leke PBS 40 µL/kuyu ekleyerek üç kez yıkama ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın.</li>
	<li>İlişkili birincil antikorlar %0,1 (w/v) BSA/PBS RT. koru microtiter plakaları ışık alüminyum folyo sarma veya yerleştirerek, 1 h için bir karanlık oda içinde ikincil keçi fluorescently etiketli Anti-sıçan antikorlar seyreltilmiş 1: 200 20 µL/kuyu ekleyerek algılamak. PBS 40 µL/kuyu ekleyerek üç kez yıkama ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın.</li>
	<li>Hücreleri 20 µL/iyi montaj orta ekleyerek gömün. İçin kuluçkaya ~ 1 h montaj orta katılaşmış kadar RT olarak. Microtiter plakaları RT veya ışıktan korunan 4 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Görüntü allantois vasküler pleksus 5 × veya 10 × objektif ve uygun floresan filtre ile donatılmış bir floresan mikroskop altında explants. Not: Tam yayılmış allantois CD31 pozitif vasküler pleksus temsilcisi görüntülerini şekil 3' te gösterilmektedir. Diğer işaretler için antikorlar gibi vasküler pleksus Flk-1 karşı Flt, yönetmen kravat-1 veya kravat-2 iyi16olarak kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
<li>Segerer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+developmental+function+for+murine+phosphoglycolate+phosphatase+in+safeguarding+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation.</a> Sci Rep. 6, 35160(2016).</li>
<li>Kane, S. V., Acquah, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+transport+of+immunoglobulins%3A+a+clinical+review+for+gastroenterologists+who+prescribe+therapeutic+monoclonal+antibodies+to+women+during+conception+and+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy.</a> Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).</li>
<li>Xu, X., Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+absorption%2C+distribution%2C+metabolism%2C+and+excretion+studies+of+therapeutic+biologics%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics.</a> AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).</li>
<li>Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origins+of+NAFLD%3A+a+womb+with+a+clue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).</li>
<li>Racicot, K., Mor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+associated+with+viral+infections+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Risks associated with viral infections during pregnancy.</a> J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).</li>
<li>Grandjean, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life-Long+Implications+of+Developmental+Exposure+to+Environmental+Stressors%3A+New+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives.</a> Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).</li>
<li>Inman, K. E., Downs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+allantois%3A+emerging+paradigms+in+development+of+the+mammalian+umbilical+cord+and+its+relation+to+the+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus.</a> Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).</li>
<li>Arora, R., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+allantois%3A+a+model+system+for+the+study+of+blood+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation.</a> Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).</li>
<li>Watson, E. D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+structures+and+transport+functions+in+the+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Development of structures and transport functions in the mouse placenta.</a> Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).</li>
<li>Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+events+mediated+by+alpha+4+integrins+are+essential+in+placental+and+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development.</a> Development. 121 (2), 549-560 (1995).</li>
<li>Gurtner, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+murine+VCAM1+gene%3A+essential+role+of+VCAM-1+in+chorioallantoic+fusion+and+placentation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation.</a> Genes & development. 9 (1), 1-14 (1995).</li>
<li>Kwee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+development+of+the+embryonic+and+extraembryonic+circulatory+systems+in+vascular+cell+adhesion+molecule+%28VCAM-1%29+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice.</a> Development. 121 (2), 489-503 (1995).</li>
<li>Downs, K. M., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+into+early+placental+ontogeny%3A+allantoic+attachment+to+the+chorion+is+selective+and+developmentally+regulated%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated.</a> Development. 121 (2), 407-416 (1995).</li>
<li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).</li>
<li>Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+murine+allantois+by+allantoic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Study of the murine allantois by allantoic explants.</a> Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).</li>
<li>Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+pre-placental+tissues+reveals+that+the+allantois+is+required+for+maintained+expression+of+Gcm1+and+Tpbpalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha.</a> Placenta. 47, 12-23 (2016).</li>
<li>Zeigler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allantois+and+chorion%2C+when+isolated+before+circulation+or+chorio-allantoic+fusion%2C+have+hematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential.</a> Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).</li>
<li>Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17671451">Functional atlas of the integrin adhesome.</a> Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yanlısı yapıştırıcı hücre dışı matriks moleküllerini fibronektin gibi zengin bir kaynağıdır, serum huzurunda allantois explants kolayca çeşitli plastik, cam veya filtre yüzeyler9,16eklemek olacaktır. Böylece, gerçekleştirilen tahlil amacı özellikle bir genetik değişiklik etkisini araştırmak için veya başka bir tedavi allantois eki için immobilize α4β1 ise, non-spesifik bağlayıcı siteleri (örneğin, sığır serum ile engellemek için kritik Albümin) integrin ...

Plasenta embriyonik gelişim ve rahim ortamı için vazgeçilmezdir. Endokrin ve bağışıklık organ oksijen, metaboliti ve maternal ve fetal dolaşım ve ayrıca işlevleri arasında besin alışverişini arabirimdeki oluşturmaktadır. Plasental geliştirme bozar endojen veya eksojen hakaret intrauterin büyüme geriliği, gebelik kaybı veya gebelik komplikasyonları, fareler ve insanlar1yol açabilir. Anormal plasental Fizyoloji neden hedeflenen fare mutasyonlar sayısı ile şu anda fare genom Bilişim (MGI) Web sitesinde listelenen 219 genotip2, artmaya devam ederken (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), bu fenotipleri birçoğu iyi mekanik açısından anlaşılmış değil. Genetik değişikliklere ek olarak, küçük molekül uyuşturucu, monoklonal antikorlar, toksinler, patojenler, aşırı metabolitleri veya çeşitli çevresel aracıları plasenta geliştirme ve işlev3,4,5 etkileyebilir , 6 , 7. henüz, plasenta geliştirme modeli eleştirel adımları azdır basit vitro deneyleri.
Allantois (göbek kordonu gelişimsel habercisi) embriyo posterior ucundan doğru koryon8büyür bir tomurcuk olarak ortaya çıkıyor zaman fare plasental geliştirme erken midgestation içinde başlatılır. Allantoic tomurcuk dış tabakası hücrelerde Chorioadhesive eki ve allantois koryon (chorioallantoic "füzyon") yüzeyi ile yayılan aracılık. Koryon villus içine Labirent, besin ve oksijen anne kan yakından bitişik sinusoids ve embriyonik damarları9 arasında değişen nerede iç plasental katman oluşturmak üzere allantois damarlara büyür içine daha sonra pas geçiyor ,10.
Allantois eki koryon için labirent oluşumu içinde belgili tanımlık ilk ve önemli adım, ve kusurları bu süreçte embriyonik ölümcül en sık karşılaşılan nedenleri arasında midgestation1'. Her ne kadar bir dizi fare mutantlar var nerede chorioallantoic eki10gerçekleşmesi başarısız olur ve MGI veritabanı şu anda anormal chorioallantoic füzyon (http:// tarafından karakterize 108 fare mutantlar listeler tarif edilmiştir www.informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), vasküler hücre adezyon molekülü-1 (VCAM-1, allantoic mesoderm ifade) ve (olan koryonik mesothelium ifade α4β1 integrin arasındaki hücreler arası etkileşimi extraembryonic mesoderm türetilmiş) chorioallantoic eki ve füzyon11,12,13için vazgeçilmez gibi görünüyor. İmmunohistokimyasal bütün Dağı yaban tipi embriyoların boyama olduğunu göstermiştir VCAM-1 yaklaşık embriyonik gününde (E) 7.5 distal üçte içinde allantoic SAP ifade edilir13 (1-4 somite sahne) ve onun ifade yüksek kalır chorioallantoic eki ve füzyon11,12sırasında-. Koryon allantoic eki başarısızlık genellikle rahim tomurcukları histolojik analizler tarafından algılanır. Ancak, allantois boyutları fizyolojik arasında ve aynı gelişimsel sahne14çöp içinde bile çok değişkendir ve fiziksel temas yapmak için yeterli bir boyuta ulaştığında allantois sadece için koryon ekleyebilirsiniz. Bu doğal değişkenlik yansıtan, chorioallantoic ek bir ara arasında gerçekleşir ~ E 8.0 ve E 9.0 rahim içindeve bu işlem Histoloji tarafından istatistiksel olarak güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi bağlıdır bu nedenle çok sayıda analizi conceptuses uygun gelişim aşamasında yeterli örnekler almak için.
Burada, biz daha az allantois boyutuna bağlıdır allantoic eki rahim değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz hamile fareler uteri fare embriyo ve onların allantoides diseksiyon göstermek ~ 8 gün coitum post (dpc; dpc 0,5 belirtir bir vajinal fiş tespiti), ve allantois sonraki kültür üzerinde immobilize α4β1 explants integrinler. Bu yöntem ekler ve birden çok allantois explants paralel ve farklı her başarılı zaman noktalarda davranışını yayılan bir hızlı, işlevsel değerlendirme sağlar. Protokol kullanılabilir için ekran allantois eki ex vivohedeflenen mutasyonlar, uyuşturucu veya çeşitli çevresel faktörlerin etkileri.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J vahşi tip fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>Stok No:&nbsp; </td><td></td>000664</tr><tr><td>%70 (h/h) Etanol</td><td>VWR Uluslararası</td><td>930031006</td><td></td></tr><tr><td>Standart desen forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11000-12</td><td>Forseps karın boşluğunu açmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Mikro diseksiyon forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11254-20</td><td>Dumont # 5 ince, keskin uçlu tıbbi biyoloji forcepts.</td></tr><tr><td>İnce makas&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14094-11</td><td>Düz bıçaklar.</td></tr><tr><td>Yaylı makas&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15012-12</td><td>Rahim tomurcuklarının diseksiyonu için 14 mm bıçaklı Noyes yaylı makas.</td></tr><tr><td>Mikrokaşık</td><td>Carl Roth</td><td>AT18.1</td><td>5 mm Kaşık çapı.</td></tr><tr><td>Mikrotitre plakaları</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>Kaplanmamış, steril anjiyogenez slaytları kullanıyoruz (iç hacim 50 & mikro; L) doku kültürü ile tedavi edilmemiş hidrofobik bir yüzeye sahip-&#945; 4&#946; 1 aracılı plastiğe bağlanma.</td></tr><tr><td>10 cm tabak</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Steril doku kültürü kapları.</td></tr><tr><td>3,5 cm</td><td>çanak Nunc</td><td>150288</td><td>Steril doku kültürü kapları.</td></tr><tr><td>Büyük delikli pipet uçları&nbsp;</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>Düşük bağlayıcı pipet uçları, 200 &L.</td></tr><tr><td>&#945; 4&#946; 1 entegre</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>6054-A4</td><td>Murin & # 945; 4&#946; 1 integrin, bir Çin hamster yumurtalık hücre hattından rekombinant olarak eksprese edilir ve saflaştırılır.</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>, Ca2 + ve Mg2 + olmadan.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td> <td>PAN Biotech</td><td>P04-03600</td><td>Formülasyon 4.5 g / L glikoz, 110 mg / L sodyum piruvat ve 3.7 g / L NaHCO3 ancak ayrı olarak eklenen L-glutamin içermez.</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td> <td>15140-122</td><td>100 x (10.000 U / mL Penisilin ve 10.000 &mikro; g / mL streptomisin) stok çözeltisi. Alikotları -20 ° C'de hazırlayın ve saklayın; Donmayı/çözülmeyi önlemek için C.</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>100 x (200 mM) Stok çözeltisi. Alikotları -20 ° C'de hazırlayın ve saklayın; Donmayı/çözülmeyi önlemek için C.</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>Isı ile etkisiz hale getirilmiş FBS kullanıyoruz (56 ° C'ye kadar ısıtılmış; Komplemanı etkisiz hale getirmek için karıştırarak 30 dakika boyunca C).</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>Proteaz ve yağ asidi içermeyen albümin kullanıyoruz. DMEM'de% 0.1 (a/h) bir çözelti hazırlayın. Steril filtre, çözeltiyi 0.22 & mikro ile tek kullanımlık bir hücre kültürü filtresinden geçirin; m gözenek boyutu ve düşük protein bağlayıcı zar ve alikotları -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>para-Formaldehit</td><td>Carl Roth</td><td>0335.2</td><td>PBS'de bir formaldehit çözeltisi yapmak için, havalandırmalı bir başlıkta para-formaldehit tozunu tartın ve önceden ısıtılmış PBS'ye ekleyin. Bir karıştırma plakası üzerinde bir beher içinde C. Çözelti temizlenene kadar damla damla 1 N NaOH ekleyin. Çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun ve 0,22 mm filtre şırıngasından süzün. Seyreltilmiş HCl ile pH'ı yaklaşık 6.9'a ayarlayın ve PBS ile son hacme ayarlayın. Çözeltiyi ayırıp donduruyoruz, ancak aynı zamanda 4 ° C'de de saklanabilir; Yaklaşık dört hafta boyunca C.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Seyreltilmemiş Triton X-100'ü işlemek için geniş delikli pipet uçları kullanın.</td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>İmmünofloresan analizlerinde antikorların spesifik olmayan bağlanmasını bloke etmek için.</td></tr><tr><td>&#945;-CD31 Antikorları</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>Saflaştırılmış sıçan anti-fare monoklonal antikorları, klon MEC 13.3.</td></tr><tr><td>İkincil keçi anti-sıçan antikorları</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11006</td><td>Keçi anti-sıçan IgG (ağır ve hafif zincirler), çapraz adsorbe edilmiş, Alexa Fluor 488 ile floresan olarak etiketlenmiştir. Diğer floresan etiketler de mümkündür.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>Sitokimya için montaj ortamı. MW ~ 31.000</td></tr><tr><td>Labovert&nbsp;</td><td>Leitz</td><td>Labovert&nbsp;</td><td>Somit çifti sayımı için 4 x ve 10 x objektif ile donatılmış ters faz kontrast mikroskobu. Diğer faz kontrast mikroskopları (doku kültüründe rutin olarak kullanılanlar gibi) de uygundur. &nbsp;</td></tr><tr><td>Embriyo ve allantois diseksiyonu için 8: 1 yakınlaştırma aralığına sahip (7,5 x ile 60 x arasında büyütme sağlar)</td> <td>M80</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td> Stereomikroskop.</tr><tr><td>DM4000B</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM4000B</td><td>LED aydınlatmalı histoloji için mikroskop sistemi. HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 ve HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objektifleri kullanıyoruz. Faz kontrastı ve floresan optiklerle donatılmış diğer mikroskoplar, allantoz ekini puanlamak için kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Dijital kamera</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>DM4000B LED mikroskobuna bağlı 3-CCD dijital yakalama kamerası. Hem mikroskobu hem de kamerayı çalıştırmak için Diskus yazılımını (Hilgers) kullanıyoruz.</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Allantois eksplantlarının vasküler pleksusunda endotelin daha yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için konfokal mikroskop. İmmünofloresan görüntüler 40 x objektif ile çekildi.</td></tr></tbody></table>

diseksiyon ve explant kültür allantoic eki vitro analizi için fare allantois ve

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Plasenta büyüme ve memeli embriyo gelişimi için önemlidir. Bu nedenle, çok sayıda genetik değişiklikler ve plasenta geliştirme veya işlev rahatsız büyük olasılıkla aynı zamanda çevre hakaret erken gebelik kaybı fareler ve insanlar neden olabilir. Yine de, basit vitro deneyleri plasenta oluşumu üzerindeki olası etkileri için ekran için eksik vardır. Burada, allantois ekin için koryon oluşur plasenta oluşumu ilk ve önemli adımda modelleme ele. Biz hızla allantoic explants chorio mimetic substrat hizmet vermektedir immobilize α4β1 Integra üzerinde eki değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu vitro yaklaşım eki ve birden çok allantois explants farklı ardışık zaman noktalarda davranışını yayılan nitel bir değerlendirme sağlar. Protokol hedeflenen fare mutasyonlar, uyuşturucu veya gebelik komplikasyonları veya fetal kayıp allantois eki ex vivoolarak bağlı çeşitli çevresel faktörlerin etkisini araştırmak için kullanılır.

Bu iletişim kuralı yalıtmak ve fare allantoides ex vivoexplant yöntemi açıklanır ve in vivo chorioallantoic füzyon sırasında α4β1 integrin allantois eki, kritik bir süreç değerlendirme nitel ayrıntıları. Şekil 1A-H temsilcisi sonuçlar allantois yalıtım hamile rahim başlayarak birbirini izleyen adımları göstermektedir. Rahim boynuzları, yağ dokusu ve gemiler (şekil 1A) gibi çevre...

Biz bir vitro tahlil modeli chorioallantoic ekte, plasenta oluşumu ilk adımda açıklanmaktadır. Protokol immobilize α4β1 Integra üzerinde fare allantoides diseksiyon ve explant kültür gösterir. Allantois ek olarak önceden belirlenmiş zaman noktalarda değerlendirilir.

Diseksiyon ve Explant kültür Allantoic eki Vitro analizi için fare Allantois ve

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

Bu prosedürün genel amacı, in vitro allantoik bağlanmanın analizi için murin allantois'in diseksiyonu ve eksplant kültürüdür. Bu yöntem, plasenta oluşumu için allantoik bağlanmanın kontrolü gibi memeli embriyo gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, plasenta oluşumundaki ilk ve kritik adımı in vitro olarak modellemesidir.Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir Teknisyen olan Kerstin Hadamek olacak. Plakaları ayarlamak için önce her bir oyuğa 20 mikrolitre taze yapılmış Alpha 4 / Beta 1 integrin solüsyonu ekleyin. Kuyu başına bir allantois için plan yapın.Düzgün kaplamayı önleyeceği için hava kabarcıkları ile herhangi bir çözelti bırakmayın. Kuyuları yükledikten sonra, plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, plakayı bir eğimde tutarken süpernatanı kuyulardan aspire edin, böylece pipet kuyu diplerine dokunmadan çözeltiyi nazikçe emebilir.Daha sonra, 50 mikrolitre ılık kültür ortamı kullanarak kuyuları iki kez yıkayın. Yıkama ortamını çıkarırken yumuşak emiş kullanın. Her kuyucuğa 50 mikrolitre blok çözeltisi uygulayın.Ardından, ihtiyaç duyulana kadar plakayı en az 30 dakika inkübe

dissection-explant-culture-murine-allantois-for-vitro-analysis

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Erken embriyonik akciğer organ kültürü epitelyal-mezenkimal etkileşimleri çalışmak için çok yararlı bir sistem. , Bu sistem içinde kolaylıkla manipüle edilebilir belirli koşullar altında epitelyal ve mezenkimal morfolojilerinden ilerler.

Fare Embriyonik Akciğer Kültür, Dallanma Moleküler Mekanizmalar değerlendirin Bir Sistem

Kranial mezenşimi muhtemel nöral kıvrımların yükselmesi için bir itici güç sağlar dramatik morfojenik hareketleri...

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

Primer hücre kültürü özellikle belirli gelişim aşamalarında transgenik fare embriyolardan, hücrelerin belirli nüfus analiz etmek için yararlı bir tekniktir. Burada, embriyonik ventriküller disseke ve ayrışmış ve antikor konjuge boncuk tanımak ve daha fazla analiz için endotel hücreleri ayırmak vardır.

Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu

Çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik nöral tepe hücre göçü potansiyelinin hassas miktar tayinine izin veren bir ex vivo hücre göçü deneyi mevcut.

Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

Biz fare embriyonik deri diseksiyonu ve ex vivo kültürünü açıklamak. Kültür sistemi doku yüzeyi boyunca bir hava-sıvı arayüz korur ve bir ters mikroskop görüntüleme sağlar. Melanoblastlardan, gelişmekte olan derinin bir bileşeni olarak, flüoresan olarak davranışları konfokal mikroskopi kullanılarak gözlemlenebilir izin etiketlenir.

Fare Embriyonik Cilt ve Melanoblast Göç Canlı görüntüleme ex vivo Kültür

Geliştirilmiş görüntüleme teknolojisi, gelişim sırasında organların üç boyutlu görüntülenmesine izin veriyor. Burada, fetal fare bağırsağında gelişmekte olan villusların canlı görüntülenmesine izin veren bütün bir organ kültürü sistemini tarif ediyoruz.

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi Ex vivo Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Ex vivo dik damlacık kültürü, mevcut in vitro ve in vivo deneysel tekniklere bir alternatiftir. Bu protokolün uygulanması kolaydır ve daha az miktarda reaktif gerektirirken, fetal vaskülarizasyon, morfogenez ve organogenezi manipüle etme ve inceleme yeteneğine izin verir.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Birincil insan plasental (villöz) ve plasental organ kültürleri oluşturmak için basit bir yöntem tarif edilmektedir. Villus ve desidual organ kültürleri, insan maternal-fetal arayüzünde patogenezinde eğitim için çok değerli araçlardır. Fakültatif hücre içi bakteri Listeria monocytogenes ile enfeksiyon gösterilmiştir.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

Biz fare Wolf kanalı (WD) izolasyonu ve kültürü için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlarla kültürlü / taze izole Wigner tüm montaj immün için detaylı bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte, bu teknikler WD geliştirme, sarma ve farklılaşma çalışma sağlar.

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Bu iletişim kuralı kültürlü aort-erbezi-Mesonephros ifade analizleri, koloni oluşturan birimlerinde kültür ve dalak ve uzun vadeli sulandırma için düzenleyici faktörler ve sinyal yolları hematopoetik kök üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılmasını açıklar hücre gelişimi. Bu hematopoetik kök hücre biyolojisi ve işlev çalışmak için etkili bir sistem olarak göstermiştir.

Aorta-erbezi-mesonephros Explant kültür gelişimsel Hematopoiesis sistemde uygulanması

Keşfedin fare allantois diseksiyonu ve explant kültürü yöntemiyle koryoallantoyik bağlanmayı in vitro modelleme. Bu teknik, plasenta oluşumunun ilk kritik adımını araştırmak için değerli bir araç sunar.

Diseksiyon ve Explant kültür Allantoic eki Vitro analizi için fare Allantois ve

Daha fazla video keşfet