Name: Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Öğrenin, arpa aleuron hücrelerinde gen ifadesini yüksek verimli partikül bombardımanı ile ölçme yöntemini. Bu protokol, bitki hormonu düzenlemeli gen çalışmalarını hızlandırarak çok sayıda gen yapısını eşzamanlı test etme olanağı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Greyson Butler ve Margaret Barrett deneyler, tahıl homojenizasyon tavsiye için Judy taş ve Lynn Hannum tavsiye fluorometry için yürütmek yardım için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı tarafından (IOB 0443676), bir kurumsal geliştirme Ödülü (fikir) üzerinden Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri grant numarası P20GM0103423 altında ve gelen hibe tarafından desteklenmiştir Doğa Bilimleri Colby üniversite bölümü.

1. hazırlanması efektör ve muhabir gen yapıları
<ol><li>Kurucu organizatörü (örneğin Mısır Ubikuitin, UBI) istihdam efektör yapıları için sürücü ifade istenen açık okuma çerçevesi oluşturun. Örneğin, sürücü güçlü kurucu ifade TaABF15 UBI::TaABF1 içeren bir plazmid oluşturmak.</li>
	<li>Olan faaliyet ölçülebilir olmaktır, organizatörü içerir muhabir yapıları GUSgibi bir açık okuma çerçevesi, ters yönde yerleştirilir kurmak. Örneğin, ifade HVA1 organizatörü2,5ölçmek için HVA1::GUS içeren bir plazmid oluşturmak.</li>
	<li>Bir iç kontrol inşa inşa (örneğin UBI::luciferase).</li>
	<li>Silis bağlama sütun kullanarak ( Tablo malzemelerigörmek) protokol, yüksek kaliteli plazmid gerekli gen yapıları, her biri için hazırlamak. Morötesi Spektroskopi kullanarak ( Tablo malzemeleri, dikkatle bakınız) her plazmid hazırlık konsantrasyonu ölçmek.</li>
</ol>2. bombardıman için arpa taneleri hazırlanması
<ol><li>Bir e-tablo ayarlamak (bir örnek için bkz: şekil 1 ) bombardıman edilecektir plazmid, uygun hormon tedavileri ve deneyin bir parçası olacak her tedavi için diğer ilgili bilgileri gösteren.</li>
	<li>Bir kesme tahtası ve steril bir jilet kullanarak, tahıl Himalaya arpa (40 denemeye dahil her tedavi için) gelen embriyo kesti. Renksiz ya da ortalamadan daha önemli ölçüde daha küçük taneler hariç.</li>
	<li>Embryoless tahıl 50 mL tüp içine yerleştirin. Su ve rock 40 mL 10 dakika için ekleyin.</li>
	<li>40 mL % 10 çamaşır suyu ekleyin ve dikkatle (tahıl kaybetmemek için) suyu dökün. Kaya 20 dakikadır.</li>
	<li>Çamaşır suyu dökmek ve 40 mL steril su ekleyin. Rock 5 dakika. Bu steril su yıkama dört kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>40 mL Imbibing çözeltisi (20 mM sodyum süksinat, 20 mM Kalsiyum klorür, pH 5,0) ekleyin ve 40 μL kloramfenikol hisse senedi çözüm (10 mg/mL).</li>
	<li>Imbibing Çözümle (kloramfenikol) çoğunu tüp sizden bir vermikülit tabak aktarmak ( Tablo malzemelerigörmek). Ardından taneleri ıslak filtre kağıdı vermikülit plaka yüzeyi üzerine aktarın. Tahıl eşit yayılmış. Pour kısmen (ama tamamen değil) olduğu tohumlar tutmak için yeterli imbibing çözümde sular altında. Vermikülit plaka üzerine kapak koyun.</li>
	<li>48 h ile floresan lambalı aydınlatma için 24 ° C'de embryoless tahıl kuluçkaya. Ek Imbibing çözüm gerektiği gibi ekleyin.</li>
	<li>90 mm plastik petri kabına kadar açın ve çözüm Imbibing 20 mL çanak içine kendisi ve 20 mL ters kapağı dökün. Kloramfenikol (10 mg/mL) 20 μL her ekleyin. İyi noktası forseps iki çift alkol daldırma tarafından sterilize.</li>
	<li>Birkaç embryoless tahıl petri kabına kapağı yerleştirin. Forseps kullanarak, her tahıl (saydam) tohum kat yavaşça çıkarın. Tohum kat tahıl pürüzsüz kısmından kaldırılırken, altındaki (aleurone) hücreler zarar vermeyen. Soyulmuş tahıl Imbibing solüsyon içeren petri kabına aktarın.</li>
	<li>Tohum kat tüm taneleri soyma sonra onları vermikülit plakasına geri. Soyulmuş embryoless tahıl 24 ° c 16-20 saat boyunca kuluçkaya.</li>
	<li>Sadece tahıl bombardıman için kullanmadan önce yüzey nemi petri kabına gazetelerde filtre arasında sallayarak kaldırın.</li>
</ol>3. bombardıman için plazmid DNA hazırlanması
<ol><li>1.5 mL tüp bombardıman denemeye dahil edilecek her tedavi için etiket. Her tüpün UBI2,5 µg ekle::luciferase iç kontrol plazmid, 2,5 µg GUS muhabir Plazmid ve bir efektör plazmid istenilen miktarda (genellikle 0.025 µg 2,5 µg için). Toplam hacim için 5 µL getirmek için su ekleyin.</li>
	<li>(Bkz: Malzemeler tablo) 1.6 µm altın microcarriers hazırlamak aşağıdaki protokolleri6yayınlandı.</li>
	<li>Her tedavi için askıya alınmış microcarriers 50 µL plazmid DNA içeren 1,5 mL tüp içine ekleyin. Plazmid DNA ile microcarriers göre üreticinin iletişim kuralları6kat.</li>
	<li>Plazmid kaplı microcarriers 48 µL % 100 etanol, damlalıklı 8 μL her beş macrocarriers askıya alınmış microcarriers, askıya alınır ve hava için izin zaman son adımda, Kuru.</li>
</ol>4. partikül bombardımanı Embryoless arpa taneleri
<ol><li>(Bkz: Malzemeler tablo) partikül bombardımanı aparatı ayarla6.</li>
	<li>1550 psi rüptürü disk istinat kap yerleştirin ve araç üzerinde monte edin.</li>
	<li>(Birlikte bir durdurma ekran) istenen plazmid kombinasyonu içeren bir macrocarrier microcarrier denize indirmek derleme yerleştirin. Derleme bombardımanı odası en iyi yuvasına takın. Kap ve macrocarrier kapak kapak standart uzaklık (6 mm) istinat rüptürü disk arasındaki mesafeyi ayarlamak ve durdurma ekran desteği sağlayan bir macrocarrier seyahat etmek mesafe 11 mm (şekil 2A) (Standart) orta konumda yer.</li>
	<li>8 embryoless tahıl sıkı bir Radyal desen aşağı düz'e 90 mm petri kabına kapağı bantlanmış bir filtre kağıdı daire (içe dönük ince uçları) ile düzenlemek (bkz. şekil 2B).</li>
	<li>Durdurma ekranından 6 cm mesafeden bombardımanı odası taneleri ile çanak yerleştirin.</li>
	<li>Bombardıman odası için 95 kPa tahliye ve örnek ile bombardıman.</li>
	<li>Vakum bırakmadan sonra alı tahıl 4 mL Imbibing 1 mg/ml kloramfenikol içeren çözeltisi içeren bir etiketli 60 mm petri kabına aktarın.</li>
	<li>Tüm bombardımanları tamamlayıncaya kadar yineleyin. (Bir platformda sallayarak 100 rpm) 24 ° C'de 24 saat boyunca kuluçkaya.</li>
</ol>5. çıkarma çözünür protein alı tahıl
<ol><li>Forseps kullanarak, 60 mm petri kabına 8 alı tahıl kaldırmak ve onları bir kağıt havlu üzerinde leke. Taneleri her 800 μL içeren iki etiketli 2.0 mL tüpler (tüp başına 4 tahıl) içine bölmek taşlama arabellek (100 mM Na fosfat pH 7.2, 5 mM DTT, 10 µg/mL leupeptin, % 20 gliserol) ve 5 mm paslanmaz çelik boncuk. Tüm alı tahıl için bu adımları tekrarlayın.</li>
	<li>(48) 2.0 mL tüpler boncuk homogenizer iki rafları yerleştirin (bkz. Tablo malzeme). Raflar üzerinde homogenizer bağlayın.</li>
	<li>Örnekleri 30 Hz'de 3 dakika çalkalanır.</li>
	<li>Homogenizer raflar homogenizer kaldırmak ve yeniden örnekleri soğuması için buza (5 dk) koyun.</li>
	<li>Rafları geri homogenizer - ters yönde bağlama. Örnekleri daha 30 Hz'de 3 dakika çalkalanır.</li>
	<li>Raflar on Ice, serin o tekrar adımları 5.3 5.5 için. Bu sallayarak 12 dakika toplam için eklemek olacaktır.</li>
	<li>16.000 x g 4 ° c de tahıl özler 10 dakika santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>
Hemen sonra Santrifüjü dikkatle boşaltmak açık supernatants microcentrifuge tüpler ikinci bir dizi içine. Her tüpün hızlı bir girdap verin. Tüpler buza saklayın.</li>
	<li>Bu yüzden onlar yıkanmış ve yeniden süpernatant aktardıktan sonra çelik boncuk çökeltilerini kurtarmak.</li>
</ol>6. ölçüm tahıl özler Luciferase etkinliği
<ol><li>12 x 75 mm cam 200 μL Luciferase tahlil karışımı içeren tüp bebek denetlesinler için tahıl özü her tüp için hazırlamak (45 mM Tris pH 7,7, 15 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1.5 mM EDTA, 1 mM biyoluminesans, 1 mM ATP sülfat).</li>
	<li>İlk tahıl ekstresinin 100 μL ilk tahlil tüp ekleyin. Girdap hızla karıştırın. Hemen tüp luminometer tüp yuvasına yerleştirin ve kapıyı kapat. Ölçüm sona erdiğinde, tüp kapıyı sonraki tüp yerleştirilmesi için açık bırakarak luminometer – kaldırın.</li>
	<li>Tüm örnekleri ölçülen kadar bu işlemi yineleyin.</li>
</ol>7. ölçüm tahıl GUS etkinliği ayıklar
<ol><li>GUS tahlil arabelleği (50 mM Na fosfat pH 7.2, 2.5 mM 4-methylumbelliferyl - D-glucuronide, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µg/mL leupeptin, % 20 metanol, % 0.02 sodyum azid) 200 μL 96 iyi plaka her şey için ekleyin.</li>
	<li>Yer 50 μL her tahıl özü de buna karşılık gelen içine. Ucu ile ekledikten sonra karıştırın. Üst film mühürleme ile kapatın.</li>
	<li>96 iyi plaka karanlıkta 37 ° C'de 20 saat boyunca kuluçkaya.</li>
	<li>96 iyi plaka 4.000 x g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve buz üzerinde yerleştirin.</li>
	<li>250 μL 0.2 M Na2CO3 siyah 96 iyi plaka her şey için ekleyin.</li>
	<li>Her centrifuged GUS tahlil karışımı 6.25 μL karşılık gelen içine eklemek iyi (içeren 0.2 M Na2CO3) siyah 96 de plaka. Ucu ile ekledikten sonra karıştırın. Wells ile 10 mikron, 40 mikron ve 100 mikron 4-methylumbelliferone 6.25 μL standartları olarak içerir.</li>
	<li>Siyah plaka plaka yer yerleştirin ve methylumbelliferone floresan okuyun. 360 bir uyarma dalga boyu okumalar alıp nm ve emisyon dalga boyu 460 nm. Verir bir okuma 1000 Floresans birimlerinin 40 mikron 4-methylumbelliferone bir de içeren 6.25 μL ve 250 μL 0.2 M Na2CO3 kazanç enstrümanın ayarlayın.</li>
</ol>8. veri analizi
<ol><li>Değerleri luciferase ve GUS deneyleri için bir elektronik tabloya girin. Bu gen yapıları başarıyla aleurone hücrelere teslim değil anlamına gelir olarak dikkate herhangi bir örnek bir luciferase okuma ile 20.000 göreli ışıldama birimleri s-1, daha düşük hariç.</li>
	<li>(Dört embryoless tahıl grubu temsil eden) için başarıyla alı her tahıl özü, ham GUS ve luciferase veri normalleştirilmiş GUS ifadeden aşağıdaki gibi hesaplar: GUS normalleştirilmiş = [(GUS ifade - GUS boş) (2.000.000) x] / (luciferase ifade-luciferase boş). Not: Bu ne 2.000.000 bir luciferase okuma verdi bir bombardıman gözlenen için GUS etkinliğinin miktarı normalleştirir.</li>
	<li>Bir özel muhabir yapı efektör yapıları veya effectors veya hormon yokluğunda ifade seviyeye karşılaştırarak test edilen hormon tedavileri huzurunda ifade göreli düzeyini rapor.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, K., An, Y. Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+to+gibberellin+and+abscisic+acid+in+barley+aleurone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Integ.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone.</a> J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).</li>
<li>Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gibberellin+response+complex+in+cereal+alpha-amylase+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters.</a> Plant Cell. 4, 203-211 (1992).</li>
<li>Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+nature+of+abscisic+acid+%28ABA%29+response+complexes%3B+composite+promoter+units+that+are+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression.</a> Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).</li>
<li>Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibberellin%2Fabscisic+acid+antagonism+in+barley+aleurone+cells%3A+site+of+action+of+the+protein+kinase+PKABA1+in+relation+to+gibberellin+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules.</a> Plant Cell. 13, 667-679 (2001).</li>
<li>Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wheat+PKABA1-interacting+factor+TaABF1+mediates+both+abscisic+acid-suppressed+and+abscisic+acid-induced+gene+expression+in+bombarded+aleurone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells.</a> Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).</li>
<li>Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+TaABF1+during+abscisic+acid+and+gibberellin+signaling+in+aleurone+cells+of+cereal+grains%5BTitle%5D)+AND+%22Seed+Science+Res%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains.</a> Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).</li>
<li>Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+definition+of+ABA-response+complexes%3A+the+promoter+units+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression+in+barley+%28Hordeum+vulgare%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare).</a> Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).</li>
<li>Ritchie, S., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+signal+transduction+in+the+barley+aleurone+is+mediated+by+phospholipase+D+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).</li>
<li>Takemiya, A., Shimazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidic+acid+inhibits+blue+light-induced+stomatal+opening+via+inhibition+of+protein+phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1.</a> Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).</li>
<li>Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+WRKY+gene+from+creosote+bush+encodes+an+activator+of+the+abscisic+acid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).</li>
<li>Ishibashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+are+involved+in+gibberellin%2Fabscisic+acid+signaling+in+barley+aleurone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells.</a> Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).</li>
<li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li>
<li>Hong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-mediated+regulation+of+a+rice+ABA+responsive+element+binding+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor.</a> Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).</li>
<li>Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABI5+acts+downstream+of+ABI3+to+execute+an+ABA-dependent+growth+arrest+during+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination.</a> Plant J. 32, 317-328 (2002).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOS2-LIKE+PROTEIN+KINASE5%2C+an+SNF1-RELATED+PROTEIN+KINASE3-Type+protein+kinase%2C+is+important+for+abscisic+acid+responses+in+Arabidopsis+through+phosphorylation+of+ABSCISIC+ACID-INSESENSITIVE5%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5.</a> Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+of+ABA+signaling+and+biosynthesis+by+a+bZIP+transcription+factor+targets+drought-resistance-related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes.</a> Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Efektör gen getirilmesi yolu ile partikül bombardımanı oluşturur, geçici muhabir yapıları, deyimden GA/ABA sinyal ve ortaya çıkan hormon düzenlenir gen belirli aktörlerin rolü dissekan için değerli bir stratejidir ifade. Ancak, bu tür deneyleri arpa aleurone hücreleri2,3,4,5,6 taşımak için varolan çok emek yoğun iletişim kurallarıdır. Her grup alı zar zor t...

Arpa aleurone katman hormon düzenlenir gen ekspresyonu bitkiler1incelenmesi için köklü modeli sistemidir. Özellikle, stres yanıt ile ilişkili genlerin absisik asit (ABA) tarafından aktif hale gelir iken çimlenme veya erken fide gelişimi için gerekli genler bir dizi Giberellin (GA), tarafından etkinleştirilir. GA-aktive bazı genlerin ifade ABA ve ahlak bozukluğu-çok yönlü1tarafından inhibe gibi GA ve yolları sinyal ABA, iç içe geçmiş bulunmaktadır.
GA/ABA sinyal içinde belirli aktörlerin rolü efektör gen yapıları partikül bombardımanı, üzerinde oluşturduğu efekt izin muhabir yapıları, geçici ifade tarafından takip yoluyla getirilmesi olmuştur anlamak için değerli bir strateji aşağı akım gen ekspresyonu belirlenecek. Muhabir gen GUS (β-glucuronidase) veya Luciferase gibi özellikle efektör yapı almış hücrelerde gen ekspresyonu hassas ve nicel ölçüm sağlar. Örneğin, ABA kaynaklı genlerin HVA1 gibi Amy32b gibi GA kaynaklı genlerin ise TaABF1 tarafından indüklenir kodlama transkripsiyon faktörü TaABF15,6 bir efektör yapı getirilmesi kurulan baskı. Partikül bombardımanı deneysel bir strateji olarak GA/ABA sinyal çeşitli yönlerini incelemek için birden fazla Laboratuvarları tarafından kullanılmıştır. Bu iş yol organizatörü öğeleri2 GA kaynaklı ve ABA kaynaklı genlerin3aktivasyonu için önemli tanımlaması ve protein kinaz4 keşfi ve transkripsiyon faktörleri düzenleyen5 Bu genlerin ifade.
Varolan iletişim kuralları2,3,4,5,6 partikül bombardımanı ve geçici gen ekspresyonu sonraki ölçümü için oldukça emek yoğun, her kümesi, bombardıman olarak vardır güç bela taneleri bir harç ve havan Tokmağı elle homojenize ve enzim deneyleri ayrı ayrı yapılmaktadır. Bu el yazması kısmen otomatikleştirir ve homojenizasyon adım akıcılık, gelişmiş bir iletişim kuralını raporları ve GUS anlamlı olarak daha fazla işlem hacmi, izin vermek için aynı deneyde, test edilecek tedaviler daha çok sayıda izin deneyleri ve/veya Her tedavi daha istatistiksel olarak sağlam sonuçlar elde etmek için daha fazla çoğaltır eklenmesi. Temsilcisi sonuçları muhabir yapıları, HVA1 ve Amy32b de GA, ABA ve diğer düzenleyici molekül transkripsiyon faktörü TaABF1 tarafından düzenlenir, ifade için gösterilir.

<table><tbody><tr><td>GeneElute HP plazmid Maxiprep kiti</td><td>Sigma</td><td>NA0310-1KT</td><td></td></tr><tr><td>UV-vis spektrofotometresi</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Himalaya arpa taneleri</td><td>/</td><td>/</td> <td>Çeşitli hulless arpa (karanlıkta 4 ° C'de saklayın; C)</td></tr> <tr><td>sodyum süksinat</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td>Çözelti İçme Reaktifi</td></tr><tr><td>kalsiyum klorür (dihidrat)</td> <td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>İçme Çözeltisi</td></tr><tr><td>İçme Çözeltisi</td> için Reaktif <td>ev yapımı</td> <td>/</td> <td>20 mM sodyum süksinat, 20 mM kalsiyum klorür, pH 5.0. Kullanmadan önce otoklavlayarak sterilize edin.</td></tr><tr><td>kloramfenikol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>% 70 etanol içinde 10 mg / mL'lik bir stok çözeltisi hazırlayın.</td></tr><tr><td>vermikülit</td><td>Fisher</td><td>NC0430369</td><td>Vermikülit plakaları için kullanılır.</td></tr><tr><td>filtre kağıdı daireleri (90 mm)</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>Vermikülit ve bombardıman öncesi tahıl hazırlama için kullanılır</td></tr><tr><td>Vermikülit Plakalar</td><td>ev yapımı</td><td>/</td><td>Bir cam petri kabına 50 mL vermikülit ekleyin. Vermikülitin üzerine 90 mm'lik bir kağıt daire yerleştirin. Otoklav.</td></tr><tr><td>forseps (ince uçlu)</td><td>Fisher</td><td>13-812-42</td><td>Arpa tanelerinden tohum kabuğunu çıkarmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>forseps (ultra ince nokta)</td><td>Fisher</td><td>12-000-122</td><td>Arpa tanelerinden tohum kabuğunu çıkarmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Altın mikro taşıyıcılar (1.6 & mu; m)</td><td>BioRad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>makrotaşıyıcılar</td><td>BioRad</td><td>1652335</td><td></td></tr><tr><td>kalsiyum klorür (dihidrat)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>2,5 M'lik bir stok çözeltisi hazırlayın ve 1 mL alikotları -20°C'de saklayın.</td></tr><tr><td>spermidin</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td>100 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın ve 500 &u saklayın; L alikotları -20&deg; C (2 ay içinde kullanın).</td></tr><tr><td>Yırtılma diskleri (1550 psi)</td><td>BioRad</td><td>1652331</td><td></td></tr><tr><td>durdurma ekranları</td><td>BioRad</td><td>1652336</td><td></td></tr><tr><td>makrotaşıyıcı tutucular</td><td>BioRad</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>Biyolistik partikül dağıtım sistemi</td><td>BioRad</td><td>PDS-1000/He</td><td></td></tr><tr><td>sodyum fosfat monobazik monohidrat</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>1M sodyum fosfat pH 7.2</td></tr> <tr>için reaktif<td>sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma</td><td>S9763</td><td>1M sodyum fosfat pH 7.2 1M</td></tr><tr><td>sodyum fosfat pH 7.2</td><td>için reaktif</td><td></td>/<td>6.9 g sodyum fosfat monobazik monohidratı 7.1 g sodyum fosfat dibazik ile birleştirin. 100 mL'ye kadar su ekleyin. PH 7.2 elde etmek için NaOH ekleyin.</td></tr><tr><td>ditiothrietol (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>43819</td><td>Suda 1 M'ye kadar çözülür. -20 ° C'de; 1 mL alikotlarda saklayın.</td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Suda 10 mg / mL'ye kadar çözülür. -20 ° C'de saklayın; </td></tr><tr><td>C.glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Suda% 50'lik bir çözelti hazırlayın.</td></tr><tr><td>Öğütme Tamponu</td><td>ev yapımı</td><td>/</td><td>10 mL 1 M sodyum fosfat pH 7.2, 500 & mu'yu birleştirin; L 1 M DTT, 100 &mu; L 10 mg / mL leupeptin ve 40 mL% 50 gliserol. 100 mL'ye kadar su ekleyin.</td></tr><tr><td>paslanmaz çelik boncuklar (5 mm)</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>Bu özel tüp modelinin homojenizatör ile kullanılması önerilir.</td></tr><tr><td>boncuk homojenizatör (TissueLyser)</td><td>Qiagen</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>12mm x 75 mm cam test tüpleri</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>luciferin</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td>25 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın ve 1 mL alikotları -20°C'de saklayın.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td>100 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın ve 250 &u depolayın; L alikotları -20&deg; &nbsp;C.</td></tr><tr><td>1M Tris sülfat</td><td>pH 7.7 için Tris baz Sigma T1503 Reaktifi.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sülfürik asit</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td>1M Tris sülfat pH 7.7 için Reaktif.</td></tr><tr><td>1M Tris sülfat pH 7.7</td><td>ev yapımı</td><td>/</td><td>12.1 g Tris bazını 100 mL suda çözün. Sülfürik asit ile pH'ı 7.7'ye ayarlayın.</td></tr><tr><td>magnezyum klorür</td><td>Sigma</td><td>M9397</td><td>Suda 2 M'ye kadar çözülür.</td></tr><tr><td>Luciferaz Test Tamponu (LAB)</td> <td>ev yapımı</td> <td>/</td> <td>3 mL 1 M Tris sülfat pH 7.7, 500 & mu'yu birleştirin; L 2 M magnezyum klorür, 1 mL 1 M DTT ve 200 &mu; 0,5 m EDTA'nın L'si. 50&nbst'ye su ekleyin; Ml.</td></tr><tr><td>Lusiferaz Test Karışımı</td><td>ev yapımı</td> <td>/</td> <td>15 mL LAB, 800 & mu'yu birleştirin; L 25 mM lusiferin, 200 &mu; L 100 mM ATP ve 4 mL su. Bu yeterli tahlil karışımı yapar (20&nbsp; mL) 100 lusiferaz testi için.</td></tr><tr><td>luminometre (Sirius)</td> <td>Berthold</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>4-metilumbelliferil -&beta; -D-glukuronid (MUG)</td> <td>Goldbio</td><td>MUG1</td><td>DMSO'da 100 mM'ye kadar çözülür.</td></tr><tr><td>sodyum azid</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Suda% 2'lik bir stok çözeltisi hazırlayın ve 1 mL alikotları -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka (standart)</td><td>Fisher</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>GUS tahlil tamponu</td><td>ev yapımı</td><td>/</td><td>2.5 mL MUG, 5 mL 1 M sodyum fosfat pH 7.2, 400 & mu'yu birleştirin; L 0,5 M EDTA, 1 mL 1 M DTT, 100 &mu; L 10 mg / ml leupeptin, 20 mL metanol ve 1 mL% 2 sodyum azid. 100 mL'ye kadar su ekleyin.</td></tr><tr><td>TempPlate sızdırmazlık filmi</td><td>USA Scientific</td><td>2921-1000</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plakalar (siyah)</td><td>Costar</td><td>3916</td><td></td></tr><tr><td>sodyum karbonat</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td>Suda 200 mM'lik bir çözelti hazırlayın.</td></tr><tr><td>4-metilumbelliferon</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>100 & mu hazırlayın; Sudaki M çözeltisi. 1 mL alikotları -20 ° C'de dondurun; &nbsp;C.</td></tr><tr><td>mikroplaka fluouresence okuyucu</td><td>Bio-Tek</td><td>FLX-800</td><td></td></tr></tbody></table>

gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa aleurone katmanlarında ölçme

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Arpa taneleri aleurone tabakası bir hormon düzenlenir gen ekspresyonu tesislerinde önemli model sistemidir. Aleurone hücrelerdeki genler çimlenmesi için gerekli ya da stres yanıt ile ilişkili genlerin absisik asit (ABA) tarafından aktif hale gelir iken erken fide geliştirme Giberellin (GA), tarafından aktive. GA ve ABA sinyal verme mekanizmaları muhabir gen yapıları partikül bombardımanı, via aleurone hücreye enzim deneyleri kullanarak ölçülen elde edilen geçici ifadesi ile tanıtımı tarafından sorguya çekilmeyi. Gelişmiş bir iletişim kuralı bu kısmen otomatikleştirir ve tahıl homojenizasyon adım ve enzim deneyleri düzene bildirilmektedir varolan yöntemlerine göre önemli ölçüde daha fazla üretilen iş sağlar. Homojenizasyon tahıl örneklerinden bir otomatik doku homogenizer kullanarak gerçekleştirilir ve GUS (β-glucuronidase) deneyleri bir 96-şey plaka sistemi kullanılarak yapılmaktadır. Temsilcisi sonuçları iletişim kuralını kullanarak fosfolifaz D faaliyet HVA1 gen ekspresyonu ABA tarafından transkripsiyon faktörü TaABF1 aracılığıyla etkinleştirme önemli bir rol oynamaktadır öneririz.

Burada açıklanan teknik herhangi bir test gen yapısı arpa taneleri aleurone hücrelere tanıtmak için kullanılabilir. Test gen ifade düzeyini daha sonra olabilir uygun ölçülen (Şekil 2). Burada büyük ölçüde açıklanan yüksek üretilen iş Protokolü tohum öğütme ve enzim tahlil adımları verimliliğini artırır. Bu yöntem transkripsiyon faktörü TaABF15,6 ifade ABA kaynaklı gen HVA17<...

Gelişmiş bir iletişim kuralı muhabir yapıları arpa aleurone hücrelerdeki geçici gen ifadeden sonra partikül bombardımanı ölçümü için sunulmaktadır. Otomatik tahıl 96-şey plaka enzim deneyleri ile bileme yordamı için yüksek üretilen iş sağlar.

Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Bu prosedürün genel amacı, partikül bombardımanı ile arpa aleurone hücrelerine sokulduktan sonra raportör yapılarından gen ekspresyonunu ölçmektir. Bu yöntem, spesifik sinyal moleküllerinin absisik asidi arpa kaynaklı genlere dönüştürmek için nasıl hareket ettiği gibi bitki hormonu regüle edilen gen ekspresyonundaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, önceki yöntemlere göre daha yüksek verim sağlaması, çok sayıda gen yapısının ve inkübasyon koşullarının test edilmesine izin vermesidir.Protokolü göstermek, laboratuvarımda bir öğrenci olan Grace olacak. İlk olarak, 20 mililitre emme solüsyonu ve 20 mikrolitre kloramfenikol içeren 90 milimetrelik plastik bir petri kabının kapağına birkaç embriyosuz tahıl yerleştirin. Steril forseps kullanarak, şeffaf tohum kabuğunu her bir tanecikten nazikçe çıkarın.Arpa tanesinden tohum kabuklarının soyulması kritik bir adımdır. Tohum kabukları tamamen çıkarılmazsa, altın mikro taşıyıcıların aleurone hücrelerine girmesi engellenecektir. Ancak soyma çok kaba yapılırsa, aleurone hücreleri zarar görebilir.Tohum kabuğunu tüm tahıllardan soyduktan sonra, bunları petri kabından bir vermikülit plakasına aktarın. Dah

measuring-gene-expression-bombarded-barley-aleurone-layers-with

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Gen mikroarray'ler genom düzeyinde gen ekspresyonu güçlü araçlardır. Bu teknoloji, gelişim biyolojisi ve toksikoloji de dahil olmak üzere biyolojik disiplinlerin çeşitli uygulaması vardır. Bu video zebrafish için kapsamlı bir oligonükleotid mikroarray platformunu kullanarak küresel gen ekspresyon analizi için detaylı bir protokoldür.

Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Biz giriş, izleme ve bitki hücrelerinde GFP ifade kantitatif analizi için bir yöntem raporu. Bu yöntem, zaman içinde, çok sayıda örneklerin yarı-sürekli bir resim koleksiyonu için özel olarak tasarlanmış bir robotik sistem kullanır. Ayrıca görüntü serisi analizi için ImageJ ve ImageReady kullanımını göstermek.

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Bitki hücreleri arasındaki makromoleküler ticareti, geçici bir ilgi floresan etiketli protein ifade ve konfokal mikroskobu ile içi ve hücreler arası dağılımı analiz değerlendirilebilir.

-Cell Hücre makromoleküler Ulaştırma Testi Planta Biyolistik Bombardıman kullanımı

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Akış sitometrisi ve mikroskopiye dayanan iki yardımcı yöntem mayada bir MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan gen ekspresyonunun dinamiklerinin tek hücre düzeyinde miktarının, ki olanak sunulmaktadır.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

Bir enfeksiyon sırasında patojen gen ekspresyon profili oluşturmak için hızlı, hassas ve tekrarlanabilir bir protokol geliştirdik.

Dijital Çizgi-kodlama Platform&#39;u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

Burada, RNA-seq S. cerevisiae hücre hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri izlemek için bir iletişim kuralı'nı mevcut. Bu yöntem gen ekspresyonu herhangi bir hücresel yanıt sırasında analiz etmek için adapte edilebilir.

Maya S. cerevisiae hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri ölçme

Burada açıklanan protokolü yeni sentezlenmiş mRNA 4-thiouracil ile etiketli Maya hücrelerinden saf genom çapında miktar temel alır. Bu yöntem mRNA decay edilişi mRNA sentezi ölçmek için sağlar ve böylece, RNA polimeraz II transkripsiyon doğru bir ölçüm sağlar.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Tahılların transkripsiyon profilini çıkarmak için bir yöntem sunulmaktadır. Mikrodizi tabanlı gen ekspresyonu profilleme tahıl tanelerinden yüksek kaliteli toplam RNA izolasyon ile başlar ve cDNA üretimi ile devam eder. cRNA etiketleme ve mikrodizi hibridizasyonundan sonra sinyal tespiti ve kalite kontrolü için öneriler verilmiştir.

Gen Ekspresyonu Profilleme için Modifiye Yöntemi ile Tahıl Tohumlarından Yüksek Kaliteli Transkripsiyon Verilerinin Elde Edilmesi

Burada sunulan bitki dokularının lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) için bir protokoldür. LCM, doku alanlarını kontaminasyonsuz bir şekilde izole etmek için mikroskobik bir tekniktir. Prosedür doku fiksasyonu, parafin katıştırma, kesit, LCM ve RNA ekstraksiyon içerir. RNA, transkripsiyonların alt dokuya özgü, zamansal olarak çözümlenmiş analizinde kullanılır.

Bitkilerde Mekansal ve Zamansal Dokuya Özgü Gen Ekspresyonu Analizi için Lazer Yakalama Mikrodiszesi RNA-Dizileme

Öğrenin, arpa aleuron hücrelerinde gen ifadesini yüksek verimli partikül bombardımanı ile ölçme yöntemini. Bu protokol, bitki hormonu düzenlemeli gen çalışmalarını hızlandırarak çok sayıda gen yapısını eşzamanlı test etme olanağı sunar.

Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme

Daha fazla video keşfet