Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme

Bu prosedürün genel amacı, partikül bombardımanı ile arpa aleurone hücrelerine sokulduktan sonra raportör yapılarından gen ekspresyonunu ölçmektir. Bu yöntem, spesifik sinyal moleküllerinin absisik asidi arpa kaynaklı genlere dönüştürmek için nasıl hareket ettiği gibi bitki hormonu regüle edilen gen ekspresyonundaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, önceki yöntemlere göre daha yüksek verim sağlaması, çok sayıda gen yapısının ve inkübasyon koşullarının test edilmesine izin vermesidir.

Protokolü göstermek, laboratuvarımda bir öğrenci olan Grace olacak. İlk olarak, 20 mililitre emme solüsyonu ve 20 mikrolitre kloramfenikol içeren 90 milimetrelik plastik bir petri kabının kapağına birkaç embriyosuz tahıl yerleştirin. Steril forseps kullanarak, şeffaf tohum kabuğunu her bir tanecikten nazikçe çıkarın.

Arpa tanesinden tohum kabuklarının soyulması kritik bir adımdır. Tohum kabukları tamamen çıkarılmazsa, altın mikro taşıyıcıların aleurone hücrelerine girmesi engellenecektir. Ancak soyma çok kaba yapılırsa, aleurone hücreleri zarar görebilir.

Tohum kabuğunu tüm tahıllardan soyduktan sonra, bunları petri kabından bir vermikülit plakasına aktarın. Daha sonra soyulmuş embriyosuz taneleri 16-20 saat boyunca 24 santigrat derecede bir inkübatöre koyun. Şimdi, bombardıman deneyine dahil edilecek her tedaviden bir nokta beş mililitrelik bir tüp etiketleyin.

Her tüpe iki nokta beş mikrogram UBI lusiferaz iç kontrol plazmidi, iki nokta beş mikrogram bir GUS raportör plazmidi ve istenen miktarda bir efektör plazmid ekleyin. Toplam hacmi beş mikrolitreye çıkarmak için her tüpe ultra saf su ekleyin. Her tedavi için,% 50 gliserol içinde süspanse edilmiş 50 mikrolitre mikro taşıyıcıları, plazmit DNA içeren her bir nokta beş mililitrelik tüpe ekleyin.

Mikro taşıyıcı kodlama prosedürünün son adımında, beş makro taşıyıcının her birine sekiz mikrolitre asılı mikro taşıyıcı pipetleyin ve havayla kurumaya bırakın. Vakum pompasını açarak, helyum valfini açarak ve ardından parçacık dağıtım sistemini açarak parçacık bombardımanı aparatını kurun. Tutma kapağına 1550 psi'lik bir kopma diski yerleştirin ve partikül dağıtım sistemine monte edin.

İstenen plazmit kombinasyonunu içeren bir makro taşıyıcıyı, bir durdurma ekranı ile mikro taşıyıcı başlatma düzeneğine yerleştirin. Düzeneği bombardıman odasının üst yuvasına yerleştirin. Daha sonra, sekiz embriyosuz taneyi, 90 mililitrelik bir petri kabının kapağına düz bir şekilde bantlanmış bir filtre kağıdı çemberi üzerinde daha ince uçları içe bakacak şekilde sıkı bir radyal düzende düzenleyin.

Tahıllarla birlikte tabağı, durdurma ekranından altı santimetre uzakta bombardıman odasına yerleştirin. Kapıyı kapatın ve bombardıman odasını 95 kilopaskal'a boşaltmak için vakum anahtarına basın. Vakum anahtarını hızlı bir şekilde tutma konumuna çevirin.

Ardından numuneyi bombardımana tutmak için yangın anahtarını basılı tutun. Vakumu serbest bıraktıktan sonra, bombardımana tutulan taneleri, mililitre kloramfenikol başına bir miligram ile dört mililitre emme çözeltisi içeren etiketli 60 milimetrelik bir petri kabına aktarın. Tüm bombardımanlar tamamlanana kadar tekrarlayın.

Ardından, bombardımana tutulan taneleri 24 saat boyunca 24 santigrat derecede 100 rpm'de çalkalanan bir platformda kuluçkaya yatırın. Forseps kullanarak, bombardımana tutulan sekiz taneyi 60 milimetre petri kabından çıkarın ve bir kağıt havlu üzerinde kurulayın. Taneleri, her biri 800 mikrolitre öğütme tamponu ve beş milimetre paslanmaz çelik boncuk içeren iki etiketli iki mililitrelik tüpe bölün.

Bombardımana tutulan tüm tahıllar için önceki adımı tekrarladıktan sonra, bir boncuk homojenizatörünün iki rafına 48 adede kadar iki mililitrelik tüp yerleştirin. Ardından rafları homojenizatöre monte edin ve numuneleri 30 hertz'de üç dakika çalkalayın. Bittiğinde, rafları homojenizatörden çıkarın ve numuneleri yeniden soğutmak için beş dakika boyunca buzun üzerine koyun.

Şimdi, rafları homojenizatöre ters yönde monte edin. Örnekleri tekrar 30 hertz'de üç dakika çalkalayın. Rafları homojenizatörden çıkardıktan sonra, numuneleri yeniden soğutmak için beş dakika boyunca buzun üzerine koyun.

Bunu takiben, tahıl ekstraktlarını 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 16.000 G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden hemen sonra, berrak süpernatanları ikinci bir mikrosantrifüj tüpü setine boşaltın. Her tüpü kısaca girdap haline getirin ve buz üzerinde saklayın.

Süpernatanı aktardıktan sonra, paslanmaz çelik boncukları peletlerden geri kazanın, böylece yıkanabilir ve yeniden kullanılabilirler. Şimdi 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 mikrolitre GUS tahlil tamponu ekleyin. Her bir tahıl ekstraktından 50 mikrolitre çukurlardan birine yerleştirin ve pipet ucu ile karıştırın.

Ardından, plakanın üst kısmını sızdırmazlık filmi ile kapatın. 96 oyuklu plakayı karanlıkta 37 santigrat derecede 20 saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyonun ardından, 96 oyuklu plakayı 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 4.000 G'de santrifüjleyin.

Bittiğinde plakayı buzun üzerine yerleştirin. Şimdi, 96 oyuklu siyah bir plakanın her bir oyuğuna 250 mikrolitre sıfır nokta iki molar sodyum karbonat ekleyin. Siyah plakanın her bir oyuğuna her bir santrifüjlenmiş GUS tahlil karışımından altı nokta iki beş mikrolitre ekleyin ve pipet ucu ile karıştırın.

Standart olarak 100 mikromolar'da altı nokta iki beş mikrolitre 10-40, dört metilumbelliferon içeren kuyuları dahil edin. Siyah plakayı bir plaka florometresine yerleştirin. Altı nokta iki beş mikrolitre 40 mikromolar, dört metilumbelliferon ve 250 mikrolitre sıfır nokta iki molar sodyum karbonat içeren bir kuyu 100 floresan biriminin okunmasını sağlayacak şekilde, cihazın kazancını ayarlayan metilumbelliferonun floresansını okuyun.

Bu deneyde, bir HVA1 GUS raportör yapısı, bir UBI TaABF1 efektör yapısı ile birlikte aleurone hücrelerine tanıtıldı. Sadece sıfır nokta sıfır bir TaABF1 HVA1 oranı, ekzojenis absisik asit veya ABA'nın yokluğunda HVA1 raportör geninin üç kat indüksiyonuna neden olmak için yeterliydi. TaABF1 yapısının daha yüksek seviyeleri, doza bağlı bir şekilde giderek daha fazla HVA1 ekspresyonu ile sonuçlandı.

Hem ekzojenis ABA hem de TaABF1, HVA1 GUS raportör yapısının ekspresyonunu güçlü bir şekilde indükleyebilir. Her iki durumda da, bir bütanolün varlığı HVA1 indüksiyonunu güçlü bir şekilde inhibe etti, bu da fosfolipaz D'nin TaABF1 yoluyla ABA tarafından HVA1 gen ekspresyonunun aktivasyonunda önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. ABA'nın, Amy32b GUS raportör yapısı için gibberellin ile indüklenen ekspresyonunu güçlü bir şekilde inhibe ettiği gösterilmiştir.

Ne hidrojen peroksit ne de sodyum nitroprussid önemli bir azalmaya neden olmadı. Bu nedenle, bu sonuçlar, aleurone hücresi ABA yanıtlarında nitrik oksit ve hidrojen peroksit için bir rolü desteklememektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, nispeten kısa bir süre içinde gen ekspresyonu için birçok farklı numunenin ölçülmesine izin verebilir.

Örneğin, 200 farklı tahıl örneğinin bombardımanı iki araştırmacı tarafından birkaç saat içinde yapılabilir. Daha sonra, ertesi gün, tek bir araştırmacı tüm protein ekstraktlarını iki saat içinde hazırlayabilir. 96 oyuklu plakalarda gerçekleştirilen modifiye GUS testi, gelecekteki tüp tahlillerinde kullanılan diğer protokollere göre çok daha az işçilik gerektirir.