Toplama ve mesleki hava örnekleri çıkarma mantar DNA analizi için

Bu hava örneklemesi ve DNA ekstraksiyon metodolojisinin genel amacı, mesleki ortamlarda potansiyel mantar tehlikelerini belirlemek için amplifiye edilebilen, dizilenebilen ve taksonomik olarak yerleştirilebilen mantar genomik DNA'sı elde etmektir. Bu yöntem, mesleki maruziyet değerlendirme alanında, çalışanların hangi mantar tehlikelerine maruz kaldığı ve olumsuz sağlık etkilerine yol açabileceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kültür veya mikroskopi tabanlı yöntemler kullanılarak tespit edilmeden kalan mantar türlerinin, dizileme tabanlı yaklaşımlar kullanılarak aydınlatılabilmesidir.

Hava örnekleme filtre kasetini monte etmek için, taban parçasının ızgaralı yüzeyine bir selüloz filtre destek pedi yerleştirin, ardından filtre forsepsleri yardımıyla, toplama tarafı yukarı bakacak şekilde filtre destek pedinin üzerine bir filtre yerleştirin. Montajdan sonra, uzatma kapağını takarak ve manuel veya pnömatik bir presle sıkıca ve eşit bir şekilde bastırarak filtre kasetini kapatın. Ardından, monte edilmiş kaseti NIOSH aerosol örnekleyicinin üzerine yerleştirin ve mümkün olduğunca aşağı doğru itin.

Filtre kasetinin ve örnekleyicinin dışını sarmak için 19 milimetrelik bir bant parçası kullanın, filtre kasetini yerinde tutun ve sızıntıları önlemek için yedek conta görevi görün. Toplama tüplerini dibe vurana kadar numune alma cihazına sıkıca ve tam olarak vidalayın ve sızdırmazlık bandını sızıntıya karşı ikincil conta görevi görerek tüplerin etrafına sarın. Kişisel aerosol örneklemesi yapmak için, örnekleyiciyi kişinin solunum bölgesine yerleştirin.

Örnekleyiciyi yakaya, omuza veya göğse takın ve ardından örnekleme pompasını bel hizasında veya bir sırt çantasında tutun. Pompaları açın ve bir dakika sonra pompanın çalışıp çalışmadığını kontrol edin. Hava örneklemesini tamamladıktan sonra, hava örnekleyiciyi konudan alın.

Sızdırmazlık bandını çıkarın, tüpleri sökün ve ardından üzerlerine bir kapak takın. Filtre kasetinin üçüncü parçasını filtrenin üzerine yerleştirin. Önce numune alma kasetini %70 etanol ile silin, ardından Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde çalışırken numune alma kasetini açmak için bir kaset açma aleti kullanın.

Ardından, destek pedini kaldırmak ve yukarı doğru filtrelemek için bir filtre kaldırıcı kullanın. Ardından, filtreyi çıkarmak için filtre forsepslerini kullanın ve steril bir Petri kabına yerleştirin. Filtreyi steril bir neşter ile altı eşit parçaya kesin ve ardından 300 miligram 200 ila 500 mikrometre cam boncuk içeren iki mililitrelik güçlendirilmiş bir tüpe yerleştirin.

Filtre içeren tüpü 30 saniye boyunca sıvı nitrojene batırın ve ardından 30 saniye boyunca saniyede 4,5 metre hızında bir boncuk değirmeni homojenizatörüne hızlı bir şekilde yerleştirin. Kalan küçük bozulmamış filtre parçalarını içeren tüplere 0,5 mililitre lizis tamponu ekleyin, daha sonra 15 ve 1,5 mililitrelik hava örnekleyici toplama tüplerine 0,3 mililitre lizis tamponu ekleyin ve tüpleri sırasıyla 10 ila 15 saniye boyunca dik ve ters konumda girdaplayın. Lizis tamponunu her bir toplama tüpünden 300 miligram cam boncuk içeren iki mililitrelik takviyeli tüplere aktarın.

Tüpleri boncuk değirmeni homojenizatöründe 30 saniye boyunca işleyin, ardından numuneleri 22 santigrat derecede bir dakika boyunca yerçekiminin 20.000 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı steril 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve süpernatanı 22 santigrat derecede bir dakika boyunca yerçekiminin 20.000 katında tekrar santrifüjleyin. 30 mikrolitre lizis reaktifi ekledikten sonra, tüpleri 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra, tüpe 0.2 mililitre bağlayıcı tampon ve mililitre başına 100 mikrogram Proteinaz K ekleyin, daha sonra tüpleri 10 dakika boyunca 70 santigrat derecede bir blok ısıtıcıda inkübasyon için bırakın. Son olarak, her tüpe 100 mikrolitre izopropanol ekleyin. Daha sonra, 700 mikrolitre kapasiteli cam elyaf filtre tüplerini iki mililitrelik toplama tüplerine yerleştirin ve ekstrakt çözeltilerini içine aktarın.

Transferin ardından, toplama tüplerini 22 santigrat derecede 30 saniye boyunca yerçekiminin 20.000 katı santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, cam filtre elyafını yeni toplama tüplerine yerleştirin ve toplama tüpünü atın. Her tüpe 0.5 mililitre inhibitör çıkarma tamponu ekleyin ve 22 santigrat derecede 30 saniye boyunca yerçekiminin 20.000 katında santrifüjleme yapın.

Santrifüjlemeden sonra toplama tüpünü atın ve filtre tüplerini yeni toplama tüplerine yerleştirin. Daha sonra, her tüpe 0.5 mililitre yıkama tamponu ekleyin ve tekrar 22 santigrat derecede 30 saniye boyunca 20.000 kez yerçekiminde santrifüjlemeye tabi tutun. Toplama tüpünü atın ve santrifüjlemeden sonra yenileriyle değiştirin.

Yine, her tüpe 0.5 mililitre yıkama tamponu ekleyin ve 22 santigrat derecede 30 saniye boyunca yerçekiminin 20.000 katında santrifüjleyin. Kalan yıkama tamponunu çıkarmak için, son olarak toplama tüplerini 22 santigrat derecede bir dakika boyunca yerçekiminin 20.000 katı sıcaklıkta santrifüjleyin ve toplama tüplerini atın ve yenileriyle değiştirin. 100 mikrolitre ılık elüsyon tamponu ekledikten sonra, tüpleri laboratuvar tezgahında oda sıcaklığında bir ila iki dakika inkübe edin ve toplama tüplerini 22 santigrat derecede 30 saniye boyunca 20.000 kez yerçekiminde santrifüjleyin.

Filtre tüplerini steril 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve elüatları başka bir yuvarlak santrifüjleme için yeniden uygulayın. Her reaksiyon için beş mikrolitre önceden ekstrakte edilmiş DNA ile üç kopya halinde 50 mikrolitrelik reaksiyonlar oluşturmak için 0,5 mililitrelik PCR tüpleri kullanın, ardından termodöngüleyiciyi programlayın ve döngüyü başlatın. Üç PCR reaksiyonunu da steril 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde karıştırın.

750 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Toplama tüplerine yerleştirilen spin kolonlarına toplam karışımın 450 mikrolitresini ekleyin ve 30 saniye boyunca yerçekiminde 17.900 kez santrifüjlemeye başlayın, ardından süzüntüyü atın ve kalan 450 mikrolitreyi ikinci bir santrifüjleme turu için ekleyin. Yine, süzüntüyü atın ve spin kolonlarına 750 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve 22 santigrat derecede 30 saniye boyunca yerçekiminin 17.900 katında santrifüjleyin.

Son olarak, süzüntüyü atın ve boş sütunları 22 santigrat derecede bir dakika boyunca yerçekiminin 17.900 katı sıcaklıkta yeniden döndürün. Spin kolonlarını 1.5 mililitrelik steril mikrosantrifüj tüplerine aktardıktan sonra, 45 mikrolitre elüsyon tamponu pipetleyin ve tüpleri laboratuvar tezgahında oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, sütunları 22 santigrat derecede bir dakika boyunca yerçekiminin 17.900 katı sıcaklıkta santrifüjleyin.

% 1'lik bir agaroz jelini bir elektroforez odasında tek katlı TAE tamponuna daldırın, ardından iki mikrolitre beş katlı yükleme tamponunu sekiz mikrolitre amplifiye DNA ile karıştırın. Son olarak, numunenin 10 mikrolitresinin tamamını DNA merdiveni ile birlikte jel üzerine yükleyin. Jeli yaklaşık 90 dakika boyunca 75 voltta çalıştırın.

Temsili bir agaroz jeli, mesleki hava örneklerinden türetilen mantar genomik DNA'sının dahili kopyalanmış aralayıcı bölgelerinin amplifikasyonunu gösterir. En sol taraftaki şerit, DNA işaret şeridini temsil eder. Sağdaki bantlar, boyutları 750 ila 1.000 baz çifti arasında değişen farklı mesleki hava örneklerinden amplifiye edilmiş dahili kopyalanmış ara parça bölgelerini temsil eder.

Temsili bir Krona tablosu, kapalı bir ortamda çeşitli taksonomik mantar türlerinin varlığını gösterir. NIOSH biyo-aerosol siklon örnekleyicisi, mevcut mantar türlerini belirlemek için bir saat boyunca biyo-aerosolleri toplamak için evlerde kullanıldı. Tablo şeklindeki veriler, iç mekanlardaki mantar türlerinin çeşitlilik ve zenginlik indekslerini temsil eder.

Veriler, klimalı ve evaporatif soğutucu ortamlarda daha yüksek Chao-1 Zenginlik indeksleri, Shannon Çeşitlilik indeksleri ve Bray-Curtis farklılık katsayıları göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, mikrobiyal popülasyonların analizi için iç mekan ve mesleki hava örneklerinin nasıl toplanacağını ve genomik DNA'nın nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, numunelerin mikrobiyolojik kontaminasyonunu önlemek için en iyi aseptik yöntemleri kullanmayı unutmamak önemlidir.