Transcriptionally düzenlenmiş uyku güzellik sistem entegrasyon arızalı Lentiviral vektör paketlenmiş bir verimli Vitro transpozisyonu yöntemle

Bu yöntemin genel amacı, ilgilenilen bir genin, entegrasyon kusurlu lentiviral vektörlere paketlenmiş transkripsiyonel olarak düzenlenmiş Uyuyan Güzel sistemi ile birincil hücrelerin insan genomuna kararlı bir şekilde entegrasyonunu sağlamaktır. Bu yöntem, Uyuyan Güzel sistemini kullanarak ilgilenilen genin birincil hücrelere entegrasyonu gibi gen terapisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajları, indüklenebilir hiperaktif Uyuyan Güzel sisteminin, çeşitli transfeksiyon yöntemlerine dirençli birincil hücreleri verimli bir şekilde vermesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Daniela Benati olacak. Transdüksiyon gününden önce, insan birincil keratinositleri metin protokolünde tarif edildiği gibi büyütülür. Kültürdeki subkonfluent keratinositleri ayırmak için, ortamı çıkarın, hücreleri 1X PBS ile yıkayın ve her oyuğa bir mililitre önceden ısıtılmış tripsin çalışma çözeltisi ekleyin.

Hücre kültürü inkübatöründe 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir kuyu hücrelerini iyice yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu iki mililitre serum içeren ortam içeren bir santrifüj tüpüne aktarın. Kuyuyu üç mililitre 1X PBS ile bir kez durulayın ve durulanan çözeltiyi hücre süspansiyonu ile santrifüj tüpüne ekleyin.

Beş dakika boyunca 580 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri beş mililitre 1X PBS ile yıkayın, beş dakika boyunca 580 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. 15 mililitrelik bir polipropilen tüpte, bir mililitre CFAD ortamında 1.6 kez 10 ila beşinci keratinositleri seyreltin.

Her koşul için bir seyreltme hazırlayın. Üç Entegrasyon Kusurlu Lentiviral veya IDLV vektörü, metin protokolünde açıklandığı gibi daha önce hazırlanmıştır. IDLVTKSB, TET tarafından düzenlenen hiperaktif SB100X transpozelerini taşır.

Modülatör için IDLVrtTA kodları ve IDLVT2 ilgilenilen geni taşır. Bu örnekte GFP, transpozon ters çevrilmiş tekrarlarla çevrilidir. Lentiviral vektörleri, bu tabloda belirtildiği gibi 20 mikrolitre polibren varlığında bir mililitre CFAD ortamında seyreltin.

Bir, iki ve üç, vektörleri olmayan negatif kontrollerdir. Dört ve beş, IDLVTKSB ve IDLVrtTA'yı içerir. Altı, yedi, sekiz ve dokuz, üç lentiviral vektörün tümünü içerir.

Her lentiviral vektör seyreltmesini karşılık gelen keratinosit süspansiyonuna ekleyerek süspansiyondaki hücreleri dönüştürün. Bir gün önce geri çekilen ölümcül şekilde ışınlanmış 3T3-J2 besleyici hücrelerden ortamı çıkarın ve transdüksiyona uğramış keratinositleri üzerlerine yerleştirin. Bir kuyuyu dönüştürdükten sonra bir sonrakine devam edin.

25 derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri altı saat boyunca 37 dereceye aktarın. Altı saat sonra, her kuyucuğa bir mililitre CFAD ortamı ekleyin.

Beş, sekiz ve dokuzuncu kuyulara bir mikromolar doksisiklin ekleyin. Hücreleri 37 santigrat dereceye getirin. Daha sonra, her bir kuyucuktaki hücreleri metin protokolünde açıklandığı gibi işleyin.

Sitoflorimetrik analiz için, üçüncü ve altıncı günde ayrılan transdüksiyonlu primer keratinositler, hücreleri fare monoklonal APC konjuge antifeeder antikoru ile etiketleyerek 3T3-J2 besleyici katmanından ayırt edilmelidir. %5 FBS, 500 milimolar EDTA ve 1X PBS'yi birleştirerek her numune için dört mililitre boyama tamponu hazırlayın. Ayrılan hücreleri bir mililitre boyama tamponu ile yıkayın.

Beş dakika boyunca 580 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Akış sitometrisi elde etmek için bir tüpte, 100 mikrolitre boyama tamponunda beş kez 10 ila dördüncü hücreleri yeniden süspanse edin. Bir ila 50 arasında bir seyreltmede iki mikrolitre antifeeder antikor ekleyin ve iyice karıştırın.

Karanlıkta buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın. 30 dakika sonra, iki mililitre boyama tamponu ile yıkayın. Beş dakika boyunca 580 kez g'de santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve 200 mikrolitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin. APC ve GFP sinyallerini elde etmek için mavi lazer, kırmızı lazer ve GFP ve APC floresansının tespiti için filtrelerle yapılandırılmış bir akış sitometresi kullanın. APC negatif hücre popülasyonunun GFP pozitif hücre fraksiyonu, transdüksiyonlu keratinositleri gösterir.

Gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek için, 25 mikrolitrelik bir son reaksiyon hacminde 96 oyuklu bir plakada üç kopya halinde reaksiyonlar ayarlayın. Her reaksiyon bir mikrolitre cDNA, 12.5 mikrolitre 2X ana karışım, 20X prob karışımında 1.25 mikrolitre primer ve 10.25 mikrolitre steril su içerir. Bu PCR programına göre gerçek zamanlı PCR çalıştırın, 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede bir döngü, ardından 15 saniye boyunca 95 santigrat derece 40 döngü ve bir dakika boyunca 60 santigrat derece ve dört santigrat derecede tutun.

Son olarak, gerçek zamanlı PCR verilerini metin protokolünde açıklandığı gibi analiz edin. Modülatör vektörleri artı veya eksi doksisiklin içinde artan dozlarda transpoz ile transdüksiyon yapılan HeLa hücrelerinin ekspresyon analizi, SB100X ekspresyonunu güçlü bir şekilde indüklemek için her iki IDLV'nin yüksek dozlarının gerekli olduğunu gösterdi. Modülatör vektörünün varlığında veya yokluğunda transpoze vektör ile transpoze edilen HeLa hücreleri üzerindeki SB100X ekspresyonunun kantitatif analizi, doksisiklin varlığında arka plan üzerinde sekiz kat aktivasyon ortaya çıkardı.

Transkripsiyonel olarak düzenlenen Uyuyan Güzel sistemi, birincil hücrelerde de kullanılabilir. Transpoze ve modülatör vektörleri ile transdüksiyona uğrayan keratinositler üzerindeki SB100X ekspresyonu, kapalı durum üzerinde 15 kat aktivasyon gösterdi. Üç IDLV vektörü artı veya eksi doksisiklin ile transdüksiyon yapılan keratinositlerde gerçekleştirilen transpozisyon deneyi, doksisiklin ile tedavi edilen hücrelerin %12'sinin genomlarına GFP'nin en az bir kopyasını stabil bir şekilde entegre ettiğini gösterdi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, birincil hücrelerdeki hayati transdüksiyon sekiz saatte, sitoflorimetrik analiz iki saatte ve uygun şekilde yapılırsa ekspresyon analizi üç saatte yapılabilir. Bu prosedürü denerken, birincil hücreleri dönüştürmek için kullanılan vektör doz kombinasyonunu optimize etmeyi ve indüklenebilir Uyuyan Güzel transpozlarının daha yüksek ekspresyon seviyesini elde etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücre başına transpozon kopya sayısı ve genomun dosyalanması için entegrasyon gibi ek soruları yanıtlamak için kantitatif PCR ve bağlayıcı aracılı PCR gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, gen terapisi alanındaki araştırmacının, Uyuyan Güzel sisteminin klinik ilgili hücrelerin mühendisliğinde uygulanmasını keşfetmesinin yolunu açtı. Videoyu izledikten sonra, birincil keratinositlerin IDLV vektörleri ile ilk olarak nasıl dönüştürüleceğini iyi anlamış olmalısınız. İkinci olarak, doksisiklin koşulu üzerine hiperaktif transpozların ekspresyonunu ölçün ve son olarak akış sitometrisi ile transpozisyonu takip edin.

Viral vektörlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle bu prosedürleri gerçekleştirirken seviyeyi ve tek kullanımlık kaynağı kontrol altına almak için BCL gibi önlemler her zaman yanınızda götürülmelidir.