Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Bu prosedürün genel amacı, kemik iliği stromal hücrelerini veya BMSC'leri izole etmek ve kültürlemektir. Bu yöntem, kemik ve adiposit alanlarındaki progenitör hücrelerle ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, BMSC'lerin nispeten hızlı, tekrarlanabilir ve ucuz bir şekilde izole edilebilmesidir.

Bu yöntemin görsel gösterimi yararlıdır, çünkü diseksiyon adımlarının yalnızca metinle açıklanması zor olabilir. Kemik toplama işlemine başlamadan önce, toplanacak her üç kemik için 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 100 mikrolitre kemik iliği kök hücre kültürü ortamı ekleyin. Ve ucu, mikrosantrifüj tüpü başına 200 mikrolitrelik bir pipet ucundan kesin, böylece her bir uç, kapaklar kapalıyken tek bir tüpe sığabilir.

Daha sonra, ilk 78 haftalık ötenazi faresini bir diseksiyon tahtası üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve hayvana% 70 etanol püskürtün. Karın üzerinde bir cilt çadırı oluşturmak için forseps kullanın ve yaklaşık bir santimetrelik bir cilt kesisi yapmak için steril diseksiyon makası kullanın. Alt karın ve bacakları ortaya çıkarmak için cildi geriye doğru soyun.

Femur başlarını pelvisten ayırmak için her kalçanın iliak tepesi boyunca kesin ve iliak kemikleri ayırmak için pelvisin orta hattından bir kesi yapın ve ayakları çıkarmak için ayak bileği eklemlerinin altından kesin. Daha sonra diz eklemini keserek kaval kemiğini uyluk kemiğinden ayırın. Ardından, kasları femurlardan, tibialardan ve iliak kemiklerden dikkatlice çıkarmak için tüy bırakmayan mendiller kullanın.

Tüm kemikler toplandığında, numuneleri PBS'ye buz üzerine yerleştirin ve numuneleri steril bir kültür başlığına aktarın. Steril teknik kullanarak, mikrosantrifüj tüplerindeki her modifiye mikropipet ucuna üç kemik yerleştirmeden önce her kemiğin hem proksimal hem de distal uçlarında bir ila iki milimetrelik kesi yapın. Kemik iliğini santrifüjleme yoluyla kemiklerden toplayın ve iliğin, dönüşün sonunda her bir mikrosantrifüj tüpünün dibine tamamen peletlenip peletlenmediğini doğrulayın.

İliğin tamamı toplanmışsa, kemikler beyaz görünecektir. Uygun biyogüvenlik imhası için mikropipet uçlarını ve kemikleri toplama tüplerinden çıkarın. Kemik iliği hücrelerini plakalamak için, önce peletleri yavaşça yeniden askıya almak ve herhangi bir kümeyi parçalamak için 25 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın ve numuneleri tek bir 15 mililitrelik konik tüpte toplayın.

500 mikrolitre numune başına 10 mililitre kemik iliği kök hücre kültürü ortamı ekleyin ve herhangi bir kemik parçasını çıkarmak için hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir filtreden 50 mililitrelik bir konik tüpe süzün. Saydıktan sonra, kemik iliği hücrelerini, 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 72 saatlik bir inkübasyon için taze kültür ortamında santimetre kare yoğunluğu başına 10 ila altıncı hücre arasında bir kez tohumlayın. Üçüncü günde, süpernatanı taze ortamla değiştirin ve daha sonra hücreler %80 ila %100 birleşmeye ulaşana kadar ortamı her iki günde bir değiştirin.

Bölünmüş bir kemik iliği hücre popülasyon kültürünü plakalamak için, bir fareden alınan hasat edilen kemik iliği hücrelerini, bir hücre kültürü inkübatöründe taze kültür ortamında 48 saat boyunca 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabına plakalayın. Kültürün ikinci gününde, yapışık olmayan hematopoietik kök hücre içeren süpernatanı çıkarın ve yapışık kemik iliği hücrelerini rahatsız etmeden plakayı PBS ile dikkatlice yıkayın. PBS'yi %0.25 tripsin ile değiştirin.

37 santigrat derecede bir ila üç dakika sonra, reaksiyonu taze hücre kültürü ortamı ile söndürün ve elde edilen hücre süspansiyonundaki hücreleri sayın. Kaplama için uygun sayıda hücreyi santrifüjleyin ve peleti istenen kaplama yoğunluğu için yeterli taze kültür ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, plakaları birleşene kadar hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Kemik iliği kök hücre osteoblast farklılaşmasını indüklemek için, hücreler makroskopik olarak gözlenebilen beyaz mineralizasyon nodülleri üretmeye başlayana kadar hücre kültürü ortamını her iki günde bir farklılaşma ortamı ile değiştirin. Kemik iliği kök hücre adiposit farklılaşmasını indüklemek için, birleşik bir kemik iliği hücre kültürünün hücre kültürü ortamını adiposit indüksiyon ortamı ile değiştirin. İki günlük kültürden sonra, süpernatanı taze adiposit indüksiyon ortamı ile değiştirin ve dördüncü günde adiposit baz ortamına geçin.

Yedinci günde, hücrelerin birikmiş lipid damlacıklarına sahip olduğunu ve olgun adipositlere benzer bir fenotip gösterdiklerini doğrulayın. Hematopoietik kök hücreleri osteoklastlara farklılaştırmak için, bir toplam kemik iliği hücre kültürü veya yapışık olmayan hücre kültürü yapışık hale geldiğinde, hücre kültürü ortamını osteoklast farklılaşma ortamı ile değiştirin. Ortamı her iki günde bir değiştirin ve osteoklastlar kaynaşana ve çok çekirdekli hücreler oluşturana kadar, tipik olarak farklılaşmanın yaklaşık beş ila yedi günü olan 10x büyütmede bir ışık mikroskobu altında günlük olarak osteoklast farklılaşmasını kontrol edin.

BMSC'lerin birleşik kültürleri, askorbik asit ve beta-gliserofosfattan oluşan osteojenik bir ortam kullanılarak osteoblastlara ayırt edilebilir. Birkaç günlük farklılaşmadan sonra, osteoblastlar alkalin fosfataz eksprese etmeye başlar. Ve daha fazla farklılaşma, osteoid matris üretimini ve nihayetinde bu matrisin mineralizasyonunu tetikleyecektir.

İlginç bir şekilde, hücrelerin sadece bir kısmı, kristal viyole boyama ile ortaya çıktığı gibi, in vitro osteoblastlara farklılaşacaktır. Karışık popülasyonlar veya bölünmüş kemik iliği hücre popülasyonları kullanılıp kullanılmadığı, hücrelerin sadece bir kısmı, yağ kırmızısı O boyası ile boyanabilen çoklu lipid vakuollerine sahip yuvarlak hücreler olarak görünen adipositlere farklılaşacaktır. Murin hücre uyarıcı faktör ve RANKL ile takviye edilmiş insan kök hücre kültürleri, TRAP için pozitif boyanan çok çekirdekli hücreler oluşturmak için hızla birleşecektir.

Bu osteoklastlar, in vitro mineral matrisi emebilir ve osteoklastik aktiviteyi değerlendirmek için kullanılabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, fare sayısına bağlı olarak uygun şekilde yapılırsa bir saatten daha kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, mümkün olduğunca hızlı ve aseptik olarak çalışabilmek için aletleri sterilize etmeyi ve ortamı önceden hazırlamayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, kemik iliği stromal hücrelerinin nasıl izole edileceğini ve kültürleneceğini iyi anlamış olmalısınız.