Endotel hedefleme için Functionalized 10-nm polimer kaplı altın parçacıkları ve ilaç dağıtım sentezi

Bu prosedürün genel amacı, 10 nanometre çapında, biyouyumlu, dolaşım süresi uzatılmış ve floresan mikroskobu ile görüntülenebilen işlevselleştirilmiş polimer kaplı altın nanokürelerin sentezlenmesidir. Bu yöntem, kardiyolojide hastalıklı koşullar altında endotel geçirgenliği ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, daha fazla özelleştirme için işlevsel gruplara sahip biyouyumlu ultra küçük parçacıklar oluşturmasıdır.

İlk olarak, bir mikro santrifüj tüpünde, 12 mikrolitre% 80 THPC'yi bir mililitre ultra saf su ile seyreltin. 100 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişeyi manyetik bir karıştırma plakasının üzerine sıkıştırın. Şişeye 45 mililitre su ve yumurta şeklinde küçük bir karıştırma çubuğu ekleyin.

Suyu 300 RPM'de karıştırmaya başlayın. Şişeye 0.5 mililitre bir molar sodyum hidroksit çözeltisi ve bir mililitre seyreltik THPC çözeltisi ekleyin. Reaksiyon karışımını beş dakika kuvvetlice karıştırmaya devam edin.

Daha sonra, karıştırırken reaksiyon karışımına iki mililitre 25 milimolar kloroaurik asit çözeltisi ekleyin. Sarı reaksiyon karışımının saniyeler içinde koyu kahverengiye döndüğünü onaylayın, bu da THPC kapaklı, negatif yüklü altın nanopartiküllerin oluşumunu gösterir. Karışımı 15 dakika karıştırmaya devam edin.

Karışım karışırken, sulu heterobifonksiyonel amin PEG tiyol, karboksimetil PEG tiyol ve tek fonksiyonlu metoksi PEG tiyol çözeltisi hazırlayın. Altın nanopartikül reaksiyon karışımı 15 dakika karıştırıldıktan sonra, karıştırma hızını 100 RPM'ye düşürün. Karıştırırken PEG çözeltilerini karışıma damla damla ekleyin.

Karışımı gece boyunca oda sıcaklığında hafifçe karıştırmaya devam edin. Ardından, 12-14 kilodalton MWCO selüloz membranının bir ucunu diyaliz klipsi ile kapatın. Reaksiyon karışımını membrana aktarmak için bir pipet kullanın.

Zarın diğer ucunu ikinci bir diyaliz klipsi ile kapatın. Nanopartikül karışımını 72 saat boyunca 60 RPM'de karıştırılan dört litre suya karşı diyalize edin. Suyu ilk altı saat boyunca her iki saatte bir ve daha sonra her altı ila 12 saatte bir değiştirin.

Daha sonra, yarı saflaştırılmış pegile altın nanopartikül karışımını 0.2 mikrometrelik bir şırınga filtresinden 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Saflaştırılmış nanopartikül çözeltisini yaklaşık beş saat boyunca eksi 80 santigrat derecede dondurun. Saflaştırılmış nanopartikülleri bir dondurarak kurutucu kullanarak liyofilize edin.

Floresan pegile altın nanopartikülleri hazırlamaya başlamak için, 100 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişeyi manyetik bir karıştırma plakası üzerine sıkıştırın. Şişeye 18 mililitre ultra saf su ve yumurta şeklinde küçük bir karıştırma çubuğu ekleyin ve 100 RPM'de karıştırmaya başlayın. Dört mililitrelik konik bir tüpte, iki miligram liyofilize pegile altın nanopartiküllerini iki mililitre su ile birleştirin.

Ardından, daha fazla sulandırma için nanopartikül çözeltisini yuvarlak tabanlı şişeye aktarın. Karıştırırken sulandırılmış nanopartiküllere bir mililitre pH 8.8, 0.1 molar karbonat tamponu ekleyin. Daha sonra, dimetil sülfoksit içinde mililitre başına 10 miligramlık bir floresan anhidroksisüksinim ester çözeltisinden beş mikrolitre ekleyin.

Işığı tamamen dışlamak için şişeyi folyoya sarın. Floresan nanopartikül karışımını gece boyunca oda sıcaklığında karıştırmaya devam edin. Daha sonra, pegile altın nanopartiküllerin hazırlanmasında açıklanan prosedürü kullanarak karışımı 72 saat boyunca dört litre suya karşı diyalize edin.

Diyaliz boyunca kabı folyo ile kapalı tutun. Karakterizasyon için saflaştırılmış floresan pegile nanopartiküllerin bir mililitresini bir kenara koyun. Kalan floresan nanopartikülleri dondurun, liyofilize edin ve dört santigrat derecede saklayın.

Altın nanoparçacık çekirdeğini transmisyon elektron mikroskobu ile görselleştirmek için, önce 10 mikrolitre saflaştırılmış floresan nanoparçacık çözeltisini karbon kaplı bir ağ TEM ızgarasına yerleştirin. Damlanın beş dakika oturmasına izin verin. Ardından, ızgarada yalnızca floresan nanopartiküllerin bir filmi kalana kadar TEM ızgarasının kenarından fazla sıvıyı dikkatlice emmek için filtre kağıdı kullanın.

Nanopartikülleri 80 kilovoltta, 50.000 ila 150.000 büyütme ile görüntüleyin. Hidrodinamik nanopartikül boyutunu ölçmek için, bir miligram liyofilize THPC kaplı altın nanopartikülleri bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Her tüpe bir mililitre su ekleyin ve çözeltileri bir mililitre şeffaf plastik küvetlere aktarın.

Her çözümü dinamik ışık saçılımı ile değerlendirin ve parçacıkların küresel hidrodinamik çaplarını ölçün. Ardından, floresan pegile altın nanopartikülleri içeren küveti bir spektroflorometreye aktarın. Ekzotasyon dalga boyunu 633 nanometreye ayarlayın ve 650 ila 800 nanometre arasındaki emisyon sinyallerini okuyun.

Daha sonra, 7 nanopartikül konsantrasyonunda biyouyumluluğu değerlendirmek için, önce DMEM'de 100 mikrolitre sıçan yağ pedi endotel hücre süspansiyonunu, 96 iyi berrak dip steril doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakanın 21 oyuğunun her birine pipetleyin. Birleşme sağlanana kadar hücreleri inkübe edin, daha sonra DMEM'de mililitre başına sıfır ila 1000 mikrogram arasında değişen konsantrasyonlarda yedi floresan nanopartikül çözeltisi elde edin. DMEM'i kuyulardan aspire edin.

Yedi nanopartikül çözeltisinin her birinden 100 mikrolitreyi ayrı oyukların her birine üç nüsha halinde yerleştirin. Hücrelerin ve nanopartiküllerin 16 saat boyunca birlikte inkübe etmesine izin verin. Daha sonra, DMEM'i aspire edin ve kuyucuklardan asılı veya gevşek bir şekilde bağlanmış nanopartikülleri aspire edin.

Her kuyucuğa 20 mikrolitre MTS / PES çözeltisi içeren 100 mikrolitre taze DMEM ekleyin. Hücreleri iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, plaka okuyucu ile 492 nanometrede klorometrik analiz ile hücre canlılığını değerlendirin.

Daha sonra, tohum sıçan yağ yastığı endotel hücrelerini, santimetre kare başına 10.000 hücrede steril 12 mililitrelik cam kapak üzerine kayar. Hücreleri %10 FBS ve %1 penisilin streptomisin ile takviye edilmiş DMEM ile besleyin. Tam birleşme sağlanana kadar hücreleri inkübe edin.

İstenirse endotelyal glikokaliksi modifiye edin, daha sonra hücreleri 16 saat boyunca mililitre floresan altın nanopartiküller başına 550 mikrogram ile inkübe edin. Hücreleri immünofloresan mikroskobu için hazırlayın. Her bir kapak kızağını, DAPI içeren solmaya karşı dayanıklı montaj ortamına sahip bir mikroskop lamına monte edin.

Kapak kayma kenarlarını oje ile kapatın. İmmünoyla boyanmış endotel hücrelerini konfokal mikroskopi ile görüntüleyin. Çekirdekleri, heparin sülfat glikokaliksini ve nanopartikülleri sırasıyla mavi, yeşil ve uzak kırmızı kanallarla görselleştirin.

THPC kaplı altın nanopartiküllerin TEM'i, iki ila üç nanometre partikül çapları gösterdi. Pegillenmiş nanoparçacıkların TEM'i, PEG TEM görüntülerinde görünmediği için yalnızca dağınık parçacıkların varlığını doğrulayabilir. THPC kaplı ve pegile nanopartiküllerin DLS'si, tepe partikül çapında 2.5 nanometreden 10.5 nanometreye bir kayma gösterdi.

Floresan emisyon, 633 nanometre ışıkla uyarıldığında maksimum 660 ila 672 nanometre arasındaydı, bu da kullanılan floresan prob için 665 nanometrede beklenen maksimum emisyon ile tutarlıydı. Sıçan yağ pedi endotel hücreleri, mililitre başına bir miligrama kadar konsantrasyonlarda floresan pegolasyonlu altın nanopartikülleri ile 16 saatlik birlikte inkübasyondan sonra benzer canlılık seviyeleri gösterdi ve bu da nanopartiküllerden önemli bir toksisite olmadığını gösterdi. Sağlıklı glikokalikslere sahip sıçan yağ yastığı endotel hücrelerinde minimal nanopartikül alımı gözlendi.

Nanopartiküllerden gelen kırmızı floresan sinyallerindeki artışla gösterildiği gibi, bozulmuş glikokalikslere sahip hücrelerde önemli ölçüde daha fazla alım meydana geldi. Bu prosedürü takiben, bir endotel bileşeninin spesifik hedeflemesi veya bir ilacın verilmesi için partikülleri modifiye etmek için açık fonksiyonel gruplar üzerine konjugasyon gibi daha fazla modifikasyon yapılabilir.