Nicel Dot Blot tahlil AAV titrasyon ve virüs Adeno ilişkili derleme etkinleştirme işlev değerlendirmesi için kullanımı için proteinler

Bu yöntem, hem saflaştırılmış hem de saflaştırılmamış AV aşı titrelerini belirleyebilir ve AAV AAP'nin aynı kökenli ve heterolog AV serotip-kapsis montajını teşvik etme yeteneğini değerlendirebilir. Bu tekniğin temel avantajı, diğer AAV titrasyon yöntemlerinin dezavantajlarını ortadan kaldıran basit ve ucuz bir yöntem olmasıdır. Bu yöntem AAV vektör kantitasyonu için yaygın olarak kullanılmış olsa da, bu protokolde gösterildiği gibi AAV biyolojisi ile ilgili çeşitli temel soruları ele almak için de uygulanabilir.

Sıfırıncı günde, HEK 293 hücrelerini% 90 birleşime kadar kültürledikten sonra, plazmitleri steril 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinde kalsiyum veya magnezyum içermeyen 96 mikrolitre PBS içinde karıştırarak transfeksiyon reaktifini hazırlayın. Bu tabloda belirtildiği gibi, toplam DNA miktarı kuyucuk başına iki mikrogramdır. PBS plazmid DNA karışımına dört mikrolitre PEI çözeltisi ekleyin.

Nihai hacim yaklaşık 100 mikrolitre veya kültür ortamının %5 hacmidir. Tüpleri kısaca vorteksleyin ve DNA PEI karışımını oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, sıvıyı dibe toplamak için tüpleri bir mikro santrifüjde kısa bir süre döndürün.

Ve DNA PEI karışımını, HEK 293 kültür plakasının her bir oyuğundaki kültür ortamına damla damla ekleyin. Daha sonra plakaları nazikçe çalkalayın ve% 5 CO2 içeren 37 santigrat derecelik bir inkübatöre geri koyun. HEK 293 hücresinin transfeksiyonu, yüksek titreli virüs üretimi için bu protokolün kritik bir bileşenidir.

Sağlıklı, düşük geçiş sayılı hücreler kullanılmalı ve hücrelerin tek tabakasının bozulmamasına özen gösterilmelidir. Birinci ve ikinci günlerde, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu altında, transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için PCMVGFP plazmidi ile transfekte edilen hücreleri gözlemleyin. Beşinci günde, hücreleri ve virüs içeren ortamı yukarı ve aşağı pipetleyin veya tüm hücreleri kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Ardından, süspansiyonu 15 mililitrelik polipropilen konik tüplere aktarın. Numuneleri kullanana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Viral partikülleri geri kazanmak için, donmuş tüpleri 37 santigrat derece su banyosunda hızla çözün.

Ardından, AAV'nin hücrelerden geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için tüpleri bir dakika boyunca kuvvetlice girdaplayın. Hücre kalıntılarını 10 dakika boyunca 3, 700 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile peletleyin. Daha sonra, her tüpten 200 mikrolitre süpernatanı, nokta leke tahlili için vidalı kapaklı etiketli mikro santrifüj tüplerine aktarın.

Numuneleri Serratia marcescens endonükleaz ile muamele etmek için karışım A'yı hazırlayın ve B reaktiflerini karıştırın. Her numune tüpüne her reaktiften 10 mikrolitre ekleyin. Numuneleri beş saniye boyunca vorteksleyin ve sıvıyı tüplerin dibine toplamak için kısaca döndürün.

Daha sonra tüpleri en az bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Numuneleri kısa bir süre döndürdükten sonra, karışım C reaktifi hazırlayarak ve her tüpe 180 mikrolitre ekleyerek proteinaz K işlemini gerçekleştirin. Daha sonra girdaplama ve tüpleri tekrar kısa bir süre döndürdükten sonra, bir saat boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin.

Numuneler oda sıcaklığına döndüğünde, 200 mikrolitre fenol-kloroform ekleyin ve tüpleri bir dakika boyunca girdaplayın. Daha sonra numuneleri 16, 100 kez G ve oda sıcaklığında en az beş dakika boyunca bir mikro santrifüjde döndürün. Sulu tabakanın 320 mikrolitresini veya sulu sıvı hacminin% 80'ini yeni bir standart mikro santrifüj tüpüne aktarın.

AAV kantitasyonunun doğruluğunu korumak için numuneden aynı hacmin alınması gerektiğinden, bu transfer adımı kritik derecede önemlidir. Sulu tabaka çıkarılırken organik fazdan kaçınmak için özen gösterilmelidir. Karışım D reaktifini hazırlayın ve her numune tüpüne 833 mikrolitre ekleyin.

Tüpleri girdapladıktan sonra, eksi 80 santigrat derecede en az 20 dakika inkübe edin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dökün ve tüpleri temiz bir kağıt havlu üzerinde bir kez kurulayın. Her tüpe yaklaşık 500 mikrolitre% 70 etanol pipetleyin ve tüpleri beş saniye boyunca girdap haline getirin.

Numuneleri tekrar döndürdükten sonra, süpernatanı dökün ve tüpleri temiz bir kağıt havlu üzerinde bir kez kurulayın. Daha sonra peletleri TE tamponunda yeniden süspanse etmeden önce 65 santigrat derecede kurutun. Nokta leke tahlilini gerçekleştirmek için, AAV vektörlü genom plazmit DNA'sını su veya Tris-HCL tamponu içinde mikrolitre başına 10 nanograma seyrelterek plazmit DNA standartlarını hazırlayın.

Seyreltilmiş plazmit DNA'nın 25 mikrolitrelik bir alikotunu taze bir tüpe aktarın ve bir saat boyunca 50 mikrolitrelik bir reaksiyon hacminde uygun bir kısıtlama enzimi ile doğrusallaştırın. Sindirilmiş plazmit DNA standardını içeren tüpe 450 mikrolitre su veya TE ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra bu karışımın 70 mikrolitresini, seyreltilmiş bir plazmit standardı oluşturmak için 1.330 mikrolitre su veya TE içeren yeni bir 1.5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Nokta leke aparatını kurmak için makas kullanarak, lekeleme zarını numune sayısı ve standartlar için uygun bir boyutta kesin. Nokta leke aparatına yerleştirmeden önce membranı 10 dakika su ile ıslatın. Daha sonra kullanılmayan kuyuların üzerini örtün.

Numunelerin yükleneceği kuyulara su ekleyin. Bir vakum uygulayın, suyu kuyulardan çekin, hataları kontrol edin ve ardından vidaları yeniden sıkın. Gerekirse yeniden test edin.

Her bir oyuğa her seyreltilmiş plazmit DNA standardından 400 mikrolitre uygulayın ve dört şerit standart seyreltme çalıştırın. Standart özetin iki ayrı alikotunu kullanın ve her birini kopya olarak yükleyin. Daha sonra her viral DNA örneğinin kuyusu başına 200 mikrolitre uygulayın.

DNA çözeltilerini kuyucuklardan çekmek için hafif bir vakum uygulayın. Ardından tüm kuyular boşaldığında, üç vanayı ayarlayarak vakumu serbest bırakın. Her oyuğa 400 mikrolitre bir X alkali çözeltisi ekleyin.

Ardından, kuyuları boşaltmak için vakumu yeniden uygulamadan önce beş dakika bekleyin. Vakumu tekrar uygulayın ve nokta leke aparatını sökün. Ardından zarı çıkarın ve iki X SSC ile durulayın.

Fazla tamponu çıkarmak için zarı DNA'ya bağlı tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir kağıt havlu üzerine yerleştirin. Lekelenmiş DNA'yı zara UV çapraz bağlamak için uygun bir UV çapraz bağlayıcı kullanın. Membran artık hibridizasyon için hazırdır.

Membranı, DNA'ya bağlı tarafı yukarı bakacak şekilde bir hibridizasyon şişesine yerleştirin. Membranı beş ila 10 mililitre önceden ısıtılmış hibridizasyon tamponu ile durulayın ve tamponu atın. Daha sonra 10 mililitre önceden ısıtılmış hibridizasyon tamponu ekleyin ve şişeyi 65 santigrat dereceye ayarlanmış dönen bir hibridizasyon fırınına yerleştirin.

Şişeyi en az beş dakika döndürün. Denatüre sperm DNA'sını ve radyoaktif probu şişedeki hibridizasyon tamponuna hızlı bir şekilde ekleyin ve karıştırmak için 10 saniye çalkalayın. Şişeyi 65 derece fırına geri koyun ve en az dört saat boyunca 65 santigrat derecede döndürülerek inkübe edin.

Hibridizasyon tamamlandığında dönüşü durdurun. Hibridizasyon şişesini çıkarın ve ardından radyoaktif prob çözeltisini sızdırmaz tapa conta kapaklı 50 mililitrelik konik bir tüpe dökün. Membranı yıkamak için, hibridizasyon şişesine 20 ila 30 mikrolitre önceden ısıtılmış yıkama tamponu ekleyin ve beş dakika döndürün.

Bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Üçüncü yıkamadan sonra, zarı hibridizasyon şişesinden çıkarın ve kağıt havlularla fazla tamponu zardan çıkarın. Ardından zarı şeffaf plastik bir kağıt tutucuya yerleştirin.

Bir Geiger sayacı ile membran üzerindeki radyoaktif sinyalleri kontrol edin. Silinen fosfor görüntüleme ekranını zara maruz bıraktıktan sonra, bir fosfor görüntü tarama sistemi kullanarak ekranı tarayın ve her noktanın sinyal yoğunluğu hakkındaki verileri elde edin. Metin protokolüne göre veri analizi yapın.

AAV 2G9 vektör titrasyonu için bu kantitatif nokta lekesi, iki standart setine ve çift olarak 0,3, 0,1 ve 0,03 mikrolitre dahil olmak üzere üç farklı miktarda AAV vektör preparatına sahiptir. Leke üzerinde test edilecek miktarlar ampirik olarak veya bir ön tahlillere dayalı olarak belirlenir. AAV 2G9 vektörünün 0.3, 0.1 ve 0.03 mikrolitrelik alikotlarının ortalama olarak 5.16, 0.27 nanogram eşdeğer mikrolitre titresine sahip olduğu enterpolasyon ile belirlendi.

AAV5, AAV9 ve yılan AAV'den VP3 cas-pid ve AAP proteinlerinin tüm olası akraba ve heterolog serotip kombinasyonları, kantitatif bir nokta leke testi ile kapsid montajı için değerlendirildi. Bu grafiğin sonuçları, AAV5 VP3'ün, AAP'nin trans olarak sağlanıp sağlanmadığına bakılmaksızın bir araya geldiğini göstermektedir. Ek olarak, AAP5 ve AAP9, AAP9'dan daha az etkili çalışmasına rağmen, AAV9 VP3 kapsid montajını teşvik edebilir.

Ne AAP5 ne de AAP9, yılan AAV VP3 üzerinde aktiviteyi teşvik eden bir montaj sergilemez ve yılan AAP, yalnızca yılan AAV VP3'ün montajını teşvik eder. Hücre ve kültür ortamından türetilmiş safsızlıklar içeren optimize edilmemiş koşullar altında ticari olarak temin edilebilen üç nükleazın nükleaz aktivitesini değerlendirmek için bir nokta leke analizi uygulandı. Enzim A'nın diğer iki enzim kadar aktif olmadığı bulundu, bu da nükleaz seçiminin nokta leke testinin okunmasını önemli ölçüde etkileyebileceğini gösterdi.

Bu teknik, AAV vektör kantitasyonu için basittir ve aynı kökenli ve heterolog serotiplerden türetilen AAV kapsidlerinin montajını teşvik etmede AAP'nin rolünü değerlendirmede etkilidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, hücre kültürü deneylerinde tahlil örnekleri elde edildikten sonra uygun şekilde gerçekleştirilirse bir günde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kantitatif doğruluğu sağlamak için doğru sıvı hacmini dikkatli bir şekilde pipetlemeyi unutmamak önemlidir.

Geliştirilmesinden sonra, AAP'yi incelemek için kantitatif nokta leke testinin uygulanması, AAV biyolojisi alanındaki araştırmacıların AAV kapsid düzeneğinin mekanizmasını daha iyi anlamalarının yolunu açmıştır. İnsan hücreleri, viral ajanlar, fenol-kloroform ve radyoaktif maddelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini lütfen unutmayın. Ve maruziyeti sınırlamak için laboratuvar önlükleri, eldivenler ve gözlüklerin kullanılması gerekir.

Bu malzemeler yalnızca onaylanmış alanlarda kullanılmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, AAV kantitasyonu için nokta leke örneklerinin nasıl hazırlanacağı, nokta leke aparatının nasıl kurulacağı, AAV titresinin nasıl belirleneceği ve prosedürün AAV biyolojisi çalışmasına nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü takiben, nokta leke tahlili ile belirlenen fiziksel partikül titresine kıyasla vektörize fonksiyonel titre gibi ek soruları yanıtlamak için kültür hücrelerinde AAV vektör transdüksiyon tahlilleri gibi diğer tahliller gerçekleştirilebilir.