Embriyonik maruz kalma düşük doz Toxicants uzun vadeli davranış ve üreme sonuçları

Bu prosedürlerin genel amacı, erken embriyogenezde düşük doz BPA maruziyetinin uzun vadeli etkilerini araştırmaktır. C.elegans embriyoları sınırlı bir süre için BPA'ya maruz bırakılır ve yetişkinliğe ulaştıklarında doğurganlık ve öğrenme davranışı için test edilir. Bu yöntem, bisfenoller ve diğer endokrin bozucu bileşikler gibi toksik maddelere maruz kalmanın uzun vadeli gelişimsel etkileriyle ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, kullanımı kolay bir omurgasız laboratuvar modelinde kantitatif davranışsal testler yoluyla toksik maddelerin gelişim üzerindeki uzun vadeli ve ince etkilerinin test edilmesine izin vermesidir. Bu tekniğin sonuçları, düşük dozlarda bile toksik maddelere maruz kalmanın zararlı sağlık etkilerinin gelişimsel ve sinirsel temelini anlamaya doğru uzanır. Bu deneyler için ilk olarak, bir dizi karmaşık veya çok faktörlü bozukluğun bazı veya diğer gelişimsel bileşene sahip gibi göründüğünü fark ettiğimizde aklımıza geldi.

Bu, kısmen kritik genlerin anormal ifadesi yoluyla etkisini gösterebilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü iç dokunma alışkanlığı adımlarının yalnızca metin tabanlı talimatlarla öğrenilmesi zor olabilir. Senkronizasyondan bir gün önce, N2 solucanlarını E.coli OP50 ile yayılmış NGM ortamı içeren 100 milimetrelik plakalara aktarın.

Yaklaşık bir santimetre karelik levhayı parçalayarak. Solucanların 20 santigrat derecede üç gün büyümesine izin verin. Üç gün sonra, plakalar görünür embriyolar içeren iyi beslenmiş, olgun yetişkinlerle doldurulduğunda, önce her bir plakayı beş milimetre M9 tamponu ile yıkayarak ve sıvıyı steril bir 15 mililitre konik santrifüj tüpüne aktararak senkronizasyona başlayın.

Oda sıcaklığında dört dakika boyunca yerçekiminin 3.000 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. Sertrifugasyonun ardından, süpernatanı yetişkin solucanların her gevşek peletinden dikkatlice çıkarmak için on mililitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra her bir solucan peletine 5 mililitre taze hazırlanmış hipoklorit çözeltisi ekleyin ve yavaşça karıştırın.

Dört dakika boyunca oda sıcaklığında 3.000 kez yerçekiminde santrifüjleyin. Senkronize popülasyonlar elde etmek çok önemlidir. Taze bir hipoklorit çözeltisi hazırlamak, kontaminasyonun ve senkronize olmayan hayvanların önlenmesine yardımcı olur.

Ardından, süpernatanı çıkarmak için on mililitrelik bir pipet kullanın ve yedi mililitre M9 tamponunu yıkayın. Bu adımı iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra yumurtalara yaklaşık 100 mikrolitre M9 tamponu ekleyin.

Daha sonra yaklaşık 50 mikrolitre yumurtayı S tamponunda seyreltilmiş BPA içeren iki mililitrelik mikrofüj tüplerine aktarın. Tabloda gösterildiği gibi, tüp başına doğru nihai BPA konsantrasyonunu sağlamak için S tamponu miktarını ayarlayın. Tüpleri, dakikada 25 eğimde veya 25 santigrat derecede dört saat boyunca 20 RPM'de hareket eden sallanan veya döner bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.

Dört saat sonra, tüpleri tüp tutuculara yerleştirin ve solucanların yerleşmesine izin verin. Süpernatanı atın ve solucanları OP50 E.coli ile tohumlanmış NGM plakalarına aktarın. Solucanların 20 santigrat derecede 60 saat büyümesine izin verin.

Plakaları her gün kontaminasyon açısından inceleyin. Kontamine NGM plakaları genellikle renksizdir ve bireysel koloniler eşlik eder. Mikroskop altında solucanları aşırı kalabalık olup olmadığını kontrol edin.

İlk olarak, yaklaşık on senkronize genç yetişkin solucanı yeni tohumlanmamış NGM plakalarına aktarmak için ateşle sterilize edilmiş 30 gauge platin tel kıracağı kullanın. Yeni tabağa alışmaları için zaman tanımak için solucanları beş dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Daha sonra tahta bir şiş veya kürdanın ucuna tutturulmuş bir kaş kılını %70 etanole batırarak sterilize edin.

Temiz, tüy bırakmayan bir mendille silin ve etanolün buharlaşması için bir dakika bekleyin. Kaş kıllarını kullanarak kafadaki solucana hafifçe dokunun. Solucanın iyileşmesine izin vermek için dokunuşlar arasında on saniye bırakarak dokunuşları tekrarlayın.

Dokunmaya devam edin, solucan artık geriye doğru hareket etmeyene kadar on saniyelik uyaranlar arası aralıklara izin verin. Bu alışkanlığın gerçekleşmesi için gereken dokunuş sayısını kaydedin. Dokunuşlar arasında on saniyelik bir aralığa izin vermek önemlidir, çünkü bu, hayvanın iyileşme süresine izin verir ve tutarlı alışkanlık davranışı tahlilleri elde etmeye yardımcı olur.

Embriyonik olarak bir mikromolar veya daha yüksek konsantrasyonda BPA'ya maruz kalan yetişkin hayvanlar, yatay çizgi ile temsil edilen kontrole kıyasla önemli ölçüde daha az yumurta bıraktı. 0.1 mikromolar kadar düşük BPA konsantrasyonlarına maruz kalan embriyolardan türetilen yetişkin hayvanlar, alışmaları için gereken ön dokunuş sayısının artmasına bağlı olarak ilişkisel olmayan eksiklikler gösterir. Embriyoları BPA maruziyeti için hazırlarken, yeterli örneklem büyüklüğüne sahip olmak için diseksiyon mikroskobu altında görülebilen olgun yumurtaları olan iyi beslenmiş C.elegans erginlerinin bulunduğu bir plak seçmek önemlidir.

Bu teknik, çevresel toksikoloji alanındaki araştırmacıların toksinlerin ve diğer endokrin bozucu bileşiklerin davranış üzerindeki etkilerini değerlendirmelerinin ve mekanik deneyler tasarlamalarının önünü açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, erken evre C.elegans embriyolarının BPA'ya nasıl maruz bırakılacağını ve BPA'ya maruz kalan embriyolardan elde edilen yetişkinlerde alışkanlık davranışının nasıl test edileceğini iyi anlamalısınız.