19 Mart 2018
Bu iletişim kuralı beyin-omurilik sıvısı (bos) kan yok kirlenme ile bol topluluğu için geliştirilmiş bir teknik anlatılmaktadır. Daha fazla örnek toplama ve saflık ile daha fazla analiz anlayışımız beyin ve omurilik etkileyen hastalıkların daha fazla için CSF kullanarak gerçekleştirilebilir.
Bu prosedürün genel amacı, kandan kontaminasyon olmadan farelerden beyin omurilik sıvısının toplanmasını iyileştirmektir. Bu yöntem, nöral hastalıkların biyobelirteçlerini izlemek için BOS toplamanın kolay ve güvenilir bir yolunu sağlar. Bu tekniğin ana avantajı, farelerden BOS toplanmasına yardımcı olmak için mikromanipülatör ile ilavenin, toplama sırasında kanın kirlenmesini azaltmasıdır.
Bir mikromanipülatöre sıkıca monte edilmiş bir kılcal tutucuya çekilmiş bir cam kılcal yerleştirerek başlayın. Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu ile bakarken, keskinleştirilmiş kılcal damarın ucunu kırmak için düz forseps kullanın, böylece kırık ucun iç çapı yaklaşık 10 ila 20 mikron olur. Daha sonra kılcal tutucunun diğer ucuna ince bir tüp ve bir şırınga takın, ince tüpü ve şırıngayı üç bir vana ile bağlayın ve üç vanayı açmak için kaydırın.
Ardından, herhangi bir kirletici maddeyi dışarı atmak ve kılcal boruda pozitif basınç oluşturmak için şırıngayı daldırın. Şırıngayı üç vanaya ayırıp yeniden bağlayarak bunu birkaç kez tekrarlayın. Ardından, şırınganın üç valf ile son yeniden bağlanmasından önce 100 ila 200 mikrolitreye kadar hava çekin.
Cerrahi işlem sırasında hasarı önlemek için mikromanipülatörü cam kılcal damar ile yana doğru hareket ettirin. Ameliyata başlamadan önce, dört uzvu da sıkıştırarak ve bir reaksiyon olmadığını gözlemleyerek farenin tamamen uyuşturulduğundan emin olun. Ardından, farenin başının arkasındaki saçları, gözlerin üstünden, kulakların arasından boynun altına kadar kesmek ve kesmek için diseksiyon makası kullanın.
Stereotaksik çerçeve fare adaptörü kullanarak farenin başını sabitleyin. Farenin başını nazikçe aşağı doğru iterek başın hareket etmediğinden ve adaptöre sıkıca sabitlendiğinden emin olun. Fare derisini boynun arkasından ve ardından kafatasının ortasından farenin kulakları ve gözleri arasından kesmek için makas ve kavisli forseps kullanın.
Cildi ve dokuyu birbirinden ayırın ve cisterna magna üzerindeki alandan dışarı çekin. Diseksiyon mikroskobu ile bakarken, forseps kullanarak kafatasının tabanı üzerindeki son ince kas katmanlarını dikkatlice inceleyin ve bu kas katmanlarını ilgilenilen alanın dışına ve yana doğru hareket ettirin. Cisterna magna üzerindeki dura açığa çıktığında, zarı temizlemek için ıslak bir pamuklu çubuk kullanın ve ardından alanı kurutmak için kuru bir pamuklu çubuk kullanın.
Cisterna magna, bölgeden geçen bir ila iki büyük kan damarı ile üçgen şeklinde görünür. Kan damarlarının her iki tarafı veya arası, kılcal damar yerleştirme ve BOS toplama için idealdir. Cisterna magna açığa çıktığında, cam kılcal damarı fare kafasının arkasına hizalamak için mikromanipülatörü kullanın, böylece keskinleştirilmiş nokta 30 ila 45 derecelik bir açıyla zarın hemen arkasında olur.
Ardından, şırıngayı bir veya birkaç kez daldırın ve ardından kirletici madde olmadığından ve cam kılcal damarda negatif basınç olduğundan emin olmak için pistonu 100 ila 200 mikrolitre geri hareket ettirin. Daha sonra kılcal ucu, direnç görülene kadar, ancak zarı delmeden zara yaklaştırın. Kılcal boruyu zardan nazikçe geçirmek için mikromanipülatör kontrollerini vurun.
Açıklık delindikten sonra BOS otomatik olarak kılcal boruya çekilmelidir. BOS'u yavaşça toplamak için kılcal damarı yerinde bırakın. BOS akışı durduysa, kılcal damarda daha fazla negatif basınç oluşturmak için şırıngayı yavaşça yaklaşık 50 mikrolitre yukarı çekin.
10 ila 30 dakika içinde on ila 15 mikrolitre BOS toplanır. İstenilen hacimde BOS toplandıktan sonra, boruya bağlı şırıngayı kapatmak ve çıkarmak için üç vanayı kaydırarak boruyu kapatın. Kılcal damarda, boruda ve kılcal damarın dışındaki alanda eşit basınç oluşturmak için boruyu açın ve ardından kapatın.
Ardından, mikromanipülatör kullanarak cam kılcal damarı fareden nazikçe çıkarmadan önce şırıngayı yeniden bağlayın. Ardından, bir mikrolitre 20X proteaz inhibitörü içeren toplama tüpünü cam kılcal damarın keskinleştirilmiş noktasının altına yerleştirin. Hortumu açın ve şırıngayı yavaşça daldırın.
BOS kılcal damardan dışarı ve toplama tüpüne akmalıdır. Toplama işleminden sonra, numuneyi toplama tüpünün altındaki proteaz inhibitörü ile karıştırmak için BOS'u darbeli santrifüjleyin. BOS numuneleri ayrıştırılabilir ve daha sonra eksi 80 santigrat derecede daha fazla analiz için saklanabilir.
APP / PS1 farelerinden toplanan BOS, 12 aylıkken insan A beta 42 seviyelerinde önemli bir artış gösterdi. Yabani tip farelerde, insan A beta 42 tespit edilmedi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür uygun şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir.
Bu prosedürü denerken, kılcal damarları yerleştirirken kan damarlarından kaçınmayı ve kanla kontaminasyonu önlemek için BOS toplama sırasında mikromanipülatör ile sadece küçük ayarlamalar yapmayı unutmamak önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Bu protokol, minimal kan kontaminasyonu ile farelerden beyin omurilik sıvısı (BOS) toplamak için geliştirilmiş bir yöntemi özetlemektedir. Mikromanipülatör kullanan bu teknik, numune saflığını ve hacmini artırarak sinir hastalıklarındaki biyobelirteçlerin daha iyi analizini sağlar.
Reliable cerebrospinal fluid (CSF) collection is essential for biomarker discovery in neurodegenerative disease research, where sample purity directly impacts data quality and target validation confidence. This method addresses a critical bottleneck in murine neuroscience workflows by enabling higher-yield, low-contamination CSF extraction, supporting more robust mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. Improved CSF accessibility enhances translational continuity from target identification to preclinical biomarker monitoring.
The method integrates into early discovery workflows by providing a reliable upstream sample source for biomarker analysis, bridging target validation and lead optimization phases.