Name: Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Öğrenin, akut beyin dilimlerinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme ve tam hücre patch-clamp kayıtları kullanarak nöronal dendritlerdeki kalsiyum sinyallerini yüksek çözünürlükle izlemeyi. Bu yöntem, sinaptik entegrasyon süreçlerini detaylı analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Kanada Sağlık Araştırma enstitüleri, Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC keşif Grant) ve Savoy Vakfı tarafından desteklenmiştir. OC NSERC bir Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneyler Université Laval, Hayvan Koruma Komitesi ve hayvan bakımı Kanada Konseyi ve hayvan refahı kuralları uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1. ön hazırlık (isteğe bağlı: 1 gün önceden hazırlamak)
<ol><li>Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözüm (Normal, sukroz ve kurtarma çözümleri, 1 L; bkz: Tablo 1) üç tür hazırlamak. 300 ± 10 mOsm25 çözümlerinize osmolalite ayarlamak ve ACSF-Sükroz yakınındaki-donma noktası aşağı serin (0-4 ° C). Not: Bir düşük sodyum kesme çözüm (ACSF-Sükroz) kullanımı akut dilimleri26yüzeysel katmanları nöronlarda canlılığı korunmasına yardımcı olur.</li>
	<li>0.75 mL kırmızı bir fluorophore (örneğin, Alexa-594) içeren yama çözeltisi hazırlamak ve yeşil sentetik kalsiyum göstergesi (örneğin, Oregon yeşil BAPTA-1; bkz: Tablo 1). Biocytin dahil (bkz. Tablo 1) yama-çözüm post hoc morfolojik tanımlama kaydedilen hücre gerekiyorsa.</li>
	<li>Osmolalite 280 ± 5 mOsm çözümü ve pH 7.35 ± 0.5 için ayarlayın. Çözüm her zaman buzdolabında veya buz üzerinde tutun. Not: Seçim kalsiyum göstergesinin dinamik menzili ve incelenen Ca2 + olayların niteliğine esas.</li>
	<li>Micropipette çektirme kullanarak, borosilikat cam kılcal damarlar ( Tablo malzemelerigörmek) dan yama Pipetler ≈ 2 µm bahşiş (3-5 MΩ pipet direnç) ve borosilikat teta-cam kılcal damarlar (bakınız tablo, gelen stimülasyon Pipetler ile hazır olun Malzemeler) 2-5 µm ipucu ile. Not: Pipetler belirli çapı ve şekil yapmak için çekici ayarı çektirme filaman türü ve rampa test sonuçlarını bir cam türü için tarafından belirlenecektir.</li>
</ol>2. Hipokampal dilim hazırlık
<ol><li>Fare anestezi (P13-20; zorlanma ve seks fare ele alınmaktadır deneysel soru tarafından belirlenir) bir inhalasyon narkoz odası içinde bir kağıt havlu üzerine yerleştirilen isoflurane 1 mL ile. Hayvan derinden, hareket ve yavaş solunum eksikliği kanıtlanan anestezi, narkoz odasından kaldırın ve bir Giyotin kullanarak başını kesmek.</li>
	<li>Kafatası kafatası arkasından makas burun için küçük bir çift ile deri kesim tarafından maruz. Mini kemik rongeurs küçük bir çift bregma düzeyde bir delik açmak için kullanın. Ardından makas sagittal dikiş boyunca Kaudal-için-rostral bir kesim yapmak için kullanın. Rongeurs ile her kafatası kapağı ve Asansör yukarı ve dışa doğru her hemisphere kapsayan kafatası kaldırmak için kavramak.</li>
	<li>Beyin tamamen maruz sonra görme sinirini küçük bir spatula ile kesme vuruşu. Beyin kafatasından kaldırmak ve sürekli oksijenli, soğuk ACSF Sükroz içeren bir Petri kabına koydum (sukroz konsantrasyon için bkz: Tablo 1 ).<ol>
<li>Büyük fareler dokudan gereklidir, İntrakardiyak bir perfüzyon kaliteli dilimleri elde etmek için önce beyin çıkarımı buz gibi ACSF Sükroz 20 mL ile dolu bir şırınga (25 G) kullanarak gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hipokampal dilimleri--dan hulâsa hayvan beyin hazırlayın.<ol>
<li>Bir filtre kağıt parçası üzerinde buz dolu bir Petri kabına yerleştirin, filtre kağıdı üzerine beyin transfer beyin chill yaklaşık 2 dakika süreyle izin. İki hemisferlerin incelemek.</li>
		<li>Disseke hemisferlerin (yönlendirmeyi koronal, enine veya yatay dilimler elde etmek için deneysel hedefi tarafından belirlenir) bir vibratome tablo tutkal ve buz gibi oksijenli ACSF Sükroz ile dolu vibratome tepsisine bırakın. 300-µm vibratome soğutucu kullanarak veya vibratome tepsi çevresinde buz yerleştirerek kalın dilim yaklaşık 1 ° C sıcaklıkta olun.</li>
		<li>Düz boya fırça kullanarak, 37 ° C'ye ısıtılmış oksijenli ACSF kurtarma içeren banyo hippocampus (6 dilim başına yarıküre) içeren dilimleri birikir</li>
		<li>Dilimleri için en az 45 dk. ACSF-kurtarma banyoda bırakın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları
<ol><li>Amaç altında konumlandırılmış bir banyoda yerde Hipokampal bir dilim ayarla (büyütme: 40 x, sayısal Diyafram: 0,8) lazer tarama iki fotonlu mikroskop. Sürekli banyo oksijenli ACSF-normal 2.5-3 mL/dk hızında 30-32 ° C'de ısıtılmış sıvı.</li>
	<li>Kızılötesi fark girişim kontrast (IR-DIC) veya Dodt-SGC mikroskobu bir hücre boyutunu, şeklini ve konumunu kullanarak ilgi bulmak için kullanın. Not: hedeflenen nöron nüfus bağlı olarak bir transgenik fare modeli kolayca ilgi hücreleri bulmak için kullanılabilir. Bu durumda, bu adımı Floresan ışık kaynağı kullanımı ile yedek olabilir.</li>
	<li>Stimülasyon pipet kırmızı fluorophore (örneğin, Alexa-594) içeren bir ACSF-Normal çözüm ile doldurun.</li>
	<li>(Bir elektriksel stimülasyon birimine bağlı) stimülasyon pipet faiz hücre olarak aynı bölgede yolgösterendir üstüne dilim ayarlayın.</li>
	<li>Böylece ucu doğrudan ilgi hücre yama pipet yama çözüm ile doldurma ve bir kafa Sahne Alanı'na eklemeyi sonra dilim üzerinde ayarlayın.</li>
	<li>Bir şırınga üçlü stopcock sığacak ve yama-pipet plastik tüp yoluyla bağlayın. Sürekli pozitif basınç yama pipet enjekte (≈ 0.1 mL) kullanarak. Stopcock "Kapat" konumda tutun.</li>
	<li>Amplifikatör kontrol yazilim modülü etkinleştirmek ve "VC" butonuna basarak gerilim tipi kelepçe moduna geçin. Elektrofizyoloji veri toplama yazılımı (örneğin, clampex) Elektrofizyolojik sinyalleri edinmesinin açın ve o sürekli olarak izlemek gerekli olan bir kare gerilim darbe (5 mV, 10 ms), göndermek için "Membran Test" simgesine tıklayın pipet direnç değişiklikler.</li>
	<li>Hedef hücrenin sağ üstteki kadar yama pipet indirin. Yapımı üzerine hücre membran ile iletişim, "açık" pozisyona stopcock kapatarak baskıyı kaldırmak. Not: Hücre zarı ile temas küçük bir artış zaman pipet direnç olarak algılanır (≈ 0,2 MΩ) görülür ve hücre üzerinde küçük bir girinti pozitif basınç tarafından neden olur.</li>
	<li>Hafif bir negatif basınç yazılım tarafından sağlanan pipet direnç 1 GΩ ulaşıncaya kadar stopcock monte boş bir Ģırınga kullanarak düzeltme eki pipet uygulanır. Veri toplama yazılımı 'Membran Test' penceresinde hücre -60, kelepçe mV.</li>
	<li>Hücre açılır ve hücre içi tüm yapılandırma elde kadar negatif basınç uygulayarak devam edin. Bu hücre durum tespiti (gelen 1 GΩ için 70-500 MΩ interneuron türüne bağlı olarak) pipet direnç ve büyük kapasitif geçişler 'Membran Test' penceresindeki görünümünü ani değişiklik üzerine kuruludur.</li>
</ol>4. İki fotonlu Ca2 + görüntüleme
<ol><li>Eksitatör postsinaptik yanıtlarında ilgilenen varsa, GABAA reseptör engelleyici gabazine (10 µM) ve GABAB reseptör engelleyici CGP55845 ekleyin (2 µM) ACSF banyoda.</li>
	<li>Amplifikatör kontrol yazilim modülü, "CC" butonuna basarak geçerli-kelepçe için yama yapılandırma kümesi ve yanıt olarak geçerli depolarize somatik enjeksiyonları hücrenin ateş deseni kaydetmek (0.8-1.0 nA, 1 s). En az 30 dk yama çözümde mevcut göstergeler ile doldurulacak hücre için bekleyin. Not: Hücrenin alt türü tanımlamak için hücre ateş desen ve etkin özellikleri kullanılabilir; örneğin, hücreleri hızlı yükseliyor. Kayıt ( Tablo 2 bkz: sorun giderme için) kediler başlamadan önce Difüzyon yoluyla stabilize etmek için gösterge konsantrasyon için önemlidir.</li>
	<li>AP uyarılmış kediler<ol>
<li>Görüntü alma yazılımı kullanarak görüntüleri alma başlatın. Bir dendrite ilgi kırmızı Floresans sinyal kullanarak bulun. Görünür bir yanıt sağlamak için AP backpropagation verimliliğini önemli ölçüde mesafe GABAergic interneurons22ile düşebilir gibi proksimal dendrite (≤ 50 µm) öncelikle, seçin.</li>
		<li>'Dikdörtgen Aracı' görüntü alma yazılımı kullanarak hedeflenen bölgesine yakınlaştırmak ve geçiş "xt" (Lınescan) modu. Pozisyon karşısında faiz dendritik Şubesi tarama. Lazer yoğunluğu denetleyicileriyle edinme yazılımında İki fotonlu lazer temel yeşil Floresans fototoksisite önlemek için sadece biraz görünür nerede en az güç düzeyinde ayarlayın.</li>
		<li>Elektrofizyoloji veri toplama yazılım 'Protokol' pencere ve görüntü alma yazılımı, istenen süre istenen genlik somatik bir geçerli enjeksiyon içeren bir kayıt deneme oluşturun.<ol>
<li>Görüntü alma yazılımı kullanarak, "kaydı Başlat" düğmesini tıklatın ve floresan sürekli olarak 1-2 s. tekrarı için resim alma 3 - 10 kez elde etmek. Bekle en az 30 s duyarlilik önlemek için tek taramalar arasında. Linescans bir dendrite boyunca birden çok noktalarda alınıyor, onları sipariş etkilerinden korunmak için rasgele sırada almak.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synaptically uyarılmış kediler<ol>
<li>Bir dendrite ilgi kırmızı Floresans sinyal kullanarak bulun.</li>
		<li>Stimülasyon pipet faiz dendrite yukarıda dilim yüzeyinde ayarlayın. Yavaş yavaş stimülasyon pipet yerine, tüm hücreli yapılandırma rahatsız edici önlemek için hareket en aza indirin. 10-15 µm dendrite üzerinden, pipet getirin.</li>
		<li>Görüntü alma yazılımı sinaptik microdomains aspiny dendrites konumunu görmek için geçin 'xt' (Lınescan) modu ve hat boyunca faiz dendritik dalı konumlandırın.</li>
		<li>'Protokol' penceresi (Toplam Elektrofizyoloji veri toplama yazılımı) ve görüntü alma yazılımı, stimülasyon birimi deneme başladıktan sonra tetikleyen bir kayıt deneme oluşturun.</li>
		<li>Satın alma yazılımı kullanarak 30 bekleyen 3 - 5 kat, 1-2 s. tekrar Alım için sürekli dendrite boyunca taramak için "kaydı Başlat" düğmesine tıklatın s duyarlilik önlemek için taramalar arasında. Not: Tarama uzunluğu uyarılmış etkinliğin Kinetik bağlı olarak ayarlanabilir, ancak duyarlilik önlemek için indirilmelidir ( Tablo 2 bkz: sorun giderme için).</li>
		<li>4.5.5 farklı koşullarda (örneğin, farklı yoğunluk/uzunluğu stimülasyon, giriş bir farmakolojik engelleyici, vb) bağlı olarak ele alınıyor sorularınıza arasındaki adımları yineleyin.</li>
		<li>Hücre sağlığı bozulan belirtileri gösterdiğinde satın durdurmak: -45 aşağıda depolarizasyon mV, temel Ca2 + düzeyi, dendrites (örneğin, blebbing, parçalanma; bkz: Tablo 2 morfolojik bozulma artış sorun giderme için).</li>
		<li>Hücre morfolojisi hakkında ön bilgi edinmek ve stimülasyon pipet konumunu kaydını tutmak için bir yığın Z -kırmızı kanalı hücreye alması. Satın alma yazılımı kullanarak 'xyz' modu, tüm işlemler dahil tüm hücreyi görüntüye yığın üst ve alt sınırları ayarlayın. 'Adım boyutu' 1 µm ayarla ve "Start kayıt" düğmesini kullanarak yığın alma işlemini başlatın.</li>
		<li>Ne zaman Z-yığın alma tamamlandığında, tüm odak planları yığının üst üste ve alım kalitesini doğrulamak için yazılımda "Maksimum projeksiyon" seçeneğini kullanın. Sonra yavaş yavaş dışarı dilim yama pipet geri çek.</li>
		<li>Post hoc morfolojik tanımlama için dilim düzeltmek için hızlı bir şekilde dilimi bir düz boya fırça kullanarak banyodan kaldırın ve arasında iki filtreyi bildiri, ACSF dolu bir Petri kabına yerleştirin. ACSF % 4 paraformaldehyde (PFA) çözüm ile değiştirin ve 4 ° C oda veya buzdolabı bulaşık gece bırakın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. immünhistokimya Post Hoc morfolojik tanımlama kaydedilen hücre için
Not: PFA fiksasyonu 1 geceden sonra dilimi fosfat tampon (PB) sodyum azid (%0,5) ile ilâ 1 ay depolanabilir.
<ol><li>Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik çözüm (TBS) Triton X-100 (% 0.3) ile dilim koyun ve 4 yıkama (5-10 dk her) gerçekleştirin.</li>
	<li>TBS-Triton içinde dilimi koymak % 0,3 ile % 10 normal keçi serum (NGS) 1 h için.</li>
	<li>Dilimi koymak TBS-Triton içinde % 0,3 ile % 1 NGS bir Streptavidin Birleşik fluorophore (örneğin, Alexa Fluor 546 Birleşik Streptavidin, 1: 200) için kuluçka gecede.</li>
	<li>4 yıkama TBS. içinde kez (5-10 dk)</li>
	<li>Dilimleri mikroskop slaytlar ve görüntü confocal mikroskop kullanarak bağlayın. Tam hücre yeniden sağlamak için bir Zelde-yığın (adım boyutu: 1 µm) 20 x amacı istimal. Alexa-546-Birleşik bir etiket görüntüleme için kullanım 543 nm lazer ve 515-560 nm algılama filtre ayarlayın.</li>
</ol>6. kedi analizi
<ol><li>Kırmızı ve yeşil kanallardan Lınescan görüntülerde faiz (ROIs) bölgelerinden Floresans verileri ayıklar ve gürültüyü azaltmak her koşul için birden fazla yinelenen değerlerin ortalamasını. Not: Lınescan Alım dendrite gerçekleştirildiğinde, dendritik microdomains (2-5 µm) karşılık, birden çok ROIs veri ayıklamak mümkün olduğunu ve böylece Ca2 + sinyal Bölünebilme çalışma izin.</li>
	<li>Her yatırım Getirisi için Ca2 + genlik değişimler hızlı: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> Not: Burada G yeşil kanaldan; Floresans değerdir G0 temel floresan yeşil kanal öncesi stimülasyon döneminde değerdir; R kırmızı kanal18floresan değerdir. İki fotonlu uyarma son derece lokalize ve önemli bir arka plan oluşturmaz, arka plan Floresans çıkarma gerekli değildir.</li>
</ol>

<ol><li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li>
<li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+upmanship%3A+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li>
<li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li>
<li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li>
<li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li>
<li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li>
<li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li>
<li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li>
<li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2%2B+signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li>
<li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2%2B+signaling+in+hippocampal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li>
<li>Camiré, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li>
<li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thespread+of+Na%2B+spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2%2B+entry+into+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li>
<li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+release+of+Ca2%2B+from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li>
<li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca%282%2B%29+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li>
<li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites%3A+contribution+of+Ca2%2B-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li>
<li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones%3A+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li>
<li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li>
<li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5(2004).</li>
<li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10777761">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li>
<li>Camiré, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/225093837_Functional_compartmentalisation_and_regulation_of_postsynaptic_Ca2_transients_in_inhibitory_interneurons">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li>
<li>Guet-McCreight, A., Camiré, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+semi-automated+strategy+to+develop+multi-compartment+models+that+predict+biophysical+properties+of+interneuron-specific+3+%28IS3%29+cells+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus.</a> eNeuro. 3, 1-26 (2016).</li>
<li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2%2B+signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li>
<li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li>
<li>Camiré, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons%3A+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259(2012).</li>
<li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+RevNeurosci%22%5BJournal%5D)">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li>
<li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li>
<li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+two-photon+uncaging%3A+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li>
<li>Salomé, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li>
<li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çıkar çatışması var.

Burada gösterilen yöntem nöronal dendrites akut beyin dilimleri içinde sinyal dendritik Ca2 + eğitimi için iki fotonlu Ca2 + görüntüleme ve yama-kelepçe Elektrofizyoloji ile birlikte nasıl kullanılacağını gösterir. Bu yöntem dendritik kesimleri ve somatik hücrenin tepkisinde elektrik stimülasyon veya backpropagating AP tarafından uyarılmış her iki yerel Ca2 + çizimleri izlenmesi için izin verir. Bu çalışma dendritik ağacının nasıl çeşitli yerlerinde girişleri entegre ve soma ile iletişim ...

Ağ etkinliği için bir neuron katkısı büyük ölçüde aldığı sinaptik girişleri dinamik yapısı tarafından belirlenir. Geleneksel olarak, nöronlar sinirsel aktivite karakterize baskın yöntemi somatik hücre içi bütün yama-kelepçe kayıtların postsinaptik akıntılarının aksonlar geçiş elektriksel stimülasyon tarafından uyarılmış dayanıyordu. Ancak, proksimale yer sinapslarda tek faaliyet truthfully bu durum1' bildirdi. Buna ek olarak, sinaps özgü mekanizmaları değerlendirmek için kayıtları çiftinden nöronların ve dendrites belirli bir konumda sinapslarda ilgi ve dendritik Tümleştirme, mekanizmaları sırasıyla hedeflemek için kullanılmaktadır. Sinaptik fizyolojisi alanında büyük bir atılım optik ve Elektrofizyolojik teknikleri bir evlilik yoluyla elde edildi. Ca2 + görüntüleme ve optogenetic araçları ile birlikte mikroskobu (2PLSM) tarama iki fotonlu uyarma lazer beyin dilim belirli nöronal Connections sinirsel aktivite dinamik organizasyon muazzam ayrıntıları açığa in vitro ve in vivo.
Birkaç önemli avantajlar yapılan geleneksel, bir foton uyarma mikroskobu2den öne 2PLSM: (1) İki fotonlu uyarma doğrusal olmayan doğası nedeniyle, Floresans sadece odak biriminde oluşturulur ve tüm verilmiş fotonlar temsil yararlı sinyalleri (iğne deliği için gerek yoktur); (2) daha uzun dalga boylarında, 2PLSM içinde kullanılan saçılma doku daha verimli bir şekilde nüfuz; Buna ek olarak, dağınık fotonlar İki fotonlu uyarma ve arka plan Floresans üretmek için çok seyreltik; (3) odak düzlemi duyarlilik ve fototoksisite sınırlıdır. Bu nedenle, 2-Foton sistemleri ile karşılaştırıldığında geleneksel confocal mikroskoplar yüksek maliyet rağmen 2PLSM yönteminin seçimi nöronal yapıyı ve kalın canlı dokuya işlevinde yüksek çözünürlüklü incelenmesi için kalır.
Yapısı ve fonksiyonu dendritik dikenleri3görüntüye saçılma doku 2PLSM ilk uygulama oldu. 2PLSM Ca2 + görüntüleme ile birlikte bu dikenleri fonksiyonu izole biyokimyasal bölmeleri ortaya koymuştur. Beri birçok nöronal türlerinde dikenleri ve bireysel sinapslarda4arasında bire bir ilişkiyi, yakında Imaging İki fotonlu Ca2 + oldu, sağlam doku5bireysel sinapslarda Etkinlik bildirimi yararlı bir araç 6,7,8. Ayrıca, 2PLSM tabanlı Ca2 + görüntüleme başarıyla tek kalsiyum kanalları ve içsel ve sinaptik conductances arasındaki doğrusal olmayan etkileşimleri etkinliğini izlemek için hem de devlet ve etkinlik bağımlı değerlendirmek için kullanıldı düzenleme, nöronal dendrites5,6,7,8,9,10,11' sinyal Ca2 + .
Kalsiyum olduğu her yerde birden bulunan hücre içi ikinci haberci ve hücre altı kronolojik zamanmekansal kuruluşu değişikliği iyon düzenlenmesi için sinaptik gücü'nden fizyolojik tepkiler yönünü belirler kanalları, büyüme, dendrite ve omurga olarak hücre ölümü ve hayatta kalma iyi. Dendritik Ca2 + yükselmeler birden çok yolları aktivasyonu ile oluşur. Aksiyon potansiyelleri (APs), backpropagating dendrites için voltaj kalsiyum kanal12 açık ve nispeten genel Ca2 + geçişler (kedi) dendrites ve dikenleri13' te üretmek. Sinaptik iletimi postsinaptik Ca2 +harekete geçirmek ile ilişkili-geçirgen reseptörleri (NMDA, Ca2 +-geçirgen AMPA ve kainate), sinaptik tetikleme CaTs6,14,15. Son olarak, belirli koşullar11,12,13,16altında dendrites supralinear Ca2 + olaylar oluşturulabilir.
İki fotonlu Ca2 + görüntüleme yama-kelepçe Elektrofizyolojik kayıtlar ile birlikte istihdam sentetik Ca2 +-yama elektrot ile bütün hücreli kayıtları sırasında genellikle teslim hassas floresan göstergeleri . Miktar Ca2 + dinamiği için standart bir yol üzerinde ikili gösterge yöntemi17,18temel alır. İki fluorophores de ayrılmış emisyon spectra ile kullanır (örneğin, birleşiminden oluşan bir kırmızı Ca2 +-duyarsız boya ile yeşil Ca2 + göstergeleri, Oregon yeşil BAPTA-1 veya Fluo-4 gibi) ve zaman göre birçok avantajı vardır Tek göstergesi yöntemi. Önce bir Ca2 +-büyük küçük harf duyarlı boya küçük yapılar ilgi (dendritik şube ve dikenleri) Ca2 + görüntüleme yapılacağı yeri bulmak için kullanılır. İkinci olarak, yeşil ve kırmızı Floresans (ΔG/R) değişikliği arasındaki oran, [Ca2 +], [Ca2 +]017 dalgalanmalar nedeniyle temel Floresans değişimler büyük ölçüde duyarsız olan ölçütü olarak hesaplanır , 18. Ayrıca, Floresans değişikliklerimutlak Ca 2 + konsantrasyonları19açısından kalibre edilmesi.
İki fotonlu Ca2 + görüntüleme deneyler akut dilimler halinde çalışırken bir genel resim alma genellikle kullanılan yüksek lazer gücü nedeniyle kararlılığını ve hücre sağlık husustur. Ayrıca, Ca2 + görüntüleme deneyler, işte pertürbasyon ve önemli tahmindi hücre altı Ca2 + dinamikleri hakkında endişe gerçeğini Ca2 + göstergeleri son derece mobil eksojen Ca2 + hareket nedeniyle arabellekleri. Bu nedenle, Ca2 + göstergesi ve onun konsantrasyonu seçimi nöronal türü, kediler beklenen genliği ve deneysel soru bağlıdır.
Biz iki fotonlu Ca2 + görüntüleme yöntemi Ca2 + dalgalanmalar dendrites GABAergic interneurons9,10,11,20,21 incelenmesi için uyarlanmış , 22. asıl nöronlarda erken Ca2 + görüntüleme çalışmaları toplu bitmiş ise inhibitör interneurons alanındaki bu piramit hücreleri20 farklı olan fonksiyonel Ca2 + mekanizmaları çeşitli vitrin , 23 , 24. bu interneuron özgü mekanizmaları (örneğin, Ca2 + geçirgen AMPA reseptör) hücre etkinlik düzenlenmesinde belirli rol oynayabilir. İnterneurons içinde sinyal dendritik Ca2 + daha fazla araştırma yapılması için cazip bir hedef olmakla birlikte, bu hücreler dendrites içinde görüntüleme İki fotonlu Ca2 + dendrites daha ince çapı ve dikenleri için eksikliği ek sorunlar sunar özellikle yüksek endojen Ca2 + Bağlama kapasitesi. Hipokampal interneurons çalışmanın odak araştırma ilgi gibi aşağıdaki iletişim kuralı geçerli olsa da farklı nöron popülasyonları, bu sorunlarla başa çıkmak için uyarlanmıştır.
Bu iletişim kuralı ile iki dış, Sigara descanned dedektörleri (NDDs), elektro-optik modülatör (EOM) ve degrade kontrast (SGC) tarama bir Dodt ile donatılmış ve optik bir tablo üzerinde yüklü bir ticari confocal İki fotonlu mikroskop, idam edildi. Mikroskop Ti:Sapphire multiphoton lazer modu kilitli-800 ile birleştiğinde nm (> 3 W, 140 fs bakliyat, 80 Hz tekrarlama oranı). Görüntüleme sistemi ile sıcaklık kontrolü, iki micromanipulators ile çeviri bir platform, bilgisayar kontrollü elektrot amplifikatör, bir çizim tablası, bir uyarı bir perfüzyon odası dahil olmak üzere bir standart Elektrofizyoloji teçhizat ile donatılmıştır birimi ve veri toplama yazılımı.

<table><tbody><tr><td>Hayvan Suşu: Fare CD1</td><td>Charles Nehri</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 hidroklorür</td><td>Abcam</td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür & nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit tozu, %95</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum glukonat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma tabanı&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hidroklorür ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik dihidrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td> Sodyum fosfat monobazik monohidrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biyosit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hidrazid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazin)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td> Adenozin trifosfat (ATP)-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td> Guanozin (GTP)-Na+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877<</td><td></td></tr><tr><td>br/> Oregon Yeşili BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td> Fosfokreatin di(tris) tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin konjuge Alexa-546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td> Yama Borosilikat Cam Kılcal Damarlar</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td> Teta Borosilikat Cam Kılcal</td><td>Damarlar Sutter Aleti</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td> P-97 Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Aleti</td><td></td><td></td></tr><tr><td> TCS SP5 Konfokal Çoklu Foton Mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chameleon Ultra II Ti: Safir multifoton lazer ve nbsp;</td><td>Tutarlı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Görüntüleme Edinme Yazılımı</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık Kontrol Cihazı TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> MultiClamp 700B Amplifikatör</td><td>Moleküler Cihazları</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digidata 1440A Sayısallaştırıcı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Konfokal Çevirmen</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> mikromanipülatör</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> pClamp Veri Toplama Yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td> A365 Sabit Akım Uyaran İzolatörü</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vibraplane Optik</td><td>Masa Kinetik Sistemleri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nöronal dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Kalsiyum (Ca2 +) görüntüleme intrasellüler Ca2 + sinyaller nöronal dendrites de kronolojik zamanmekansal dinamikleri araştırmak için güçlü bir araçtır. CA2 + dalgalanmaları membran ve hücre içi mekanizmaları çeşitli aracılığıyla ortaya ve sinaptik plastisite indüksiyon ve dendritik uyarılabilirlik düzenlenmesi önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, farklı tipteki Ca2 + sinyalleri dendritik dallarında kaydetmek için yetenek nasıl dendrites bilgi entegre eğitim grupları için değerlidir. İki fotonlu mikroskobu gelişiyle böyle çalışmaları önemli ölçüde canlı doku, ışık saçılma ve duyarlilik gibi görüntüleme için içsel sorunları çözerek kolaylaştırdı. Ayrıca, geleneksel Elektrofizyolojik teknikleri ile görüntüleme İki fotonlu Ca2 + arada yoluyla, yerel Ca2 + dalgalanmalar nöronal dendrites kayıtları ile paralel olarak sinaptik faaliyete araştırmak mümkün olduğunu Soma. Burada, GABAergic inhibitör interneurons dendrites içinde yerel Ca2 + geçişler (kediler) dinamiklerini incelemek için bu yöntemi kullanmak nasıl açıklar. Yöntem aynı zamanda akut beyin dilimleri farklı nöronal türleri içinde sinyal dendritik Ca2 + eğitim için uygulanır.

Burada sunulan iletişim kuralını kullanarak, somatik geçerli enjeksiyon ve Hipokampus CA1 alanında oriens/alveus interneurons dendrites içinde elektrik stimülasyonu tarafından uyarılmış CaTs elde edilen. Sonra belirlenen bir nöron, yama, şekil ve konumunu temel alarak, biz linescans proksimal dendrite birden çok noktalarda karşısında alınan verilen mesafeler soma (şekil 1A). Soma (azaltılmış AP genlik veya kalsiyum kanal dağıtım, şekil 1B...

Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Bu deneyin genel amacı, dendritlerde iki fotonlu kalsiyum görüntülemeye paralel olarak nöronal somada tam hücre yama-klemp kayıtlarını kullanarak farklı stimülasyon paradigmalarına yanıt olarak nöronal dendritlerdeki kalsiyum yükselmelerini incelemektir. Bu yöntem, küçük dendritik bölmelerde kalsiyum sinyalini izlemek için kullanılabilir ve sinaptik girdilerin entegrasyonu sırasında dendritik dallarda meydana gelen süreçlerin yakından gözlemlenmesine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, kalsiyum sinyal modellerinin yüksek uzay-zamansal çözünürlük ve özgüllükte gözlemlenmesini sağlamasıdır.Fare beynini sürekli oksijenli, soğuk ACSF-sakaroz içeren bir Petri kabına yerleştirin. Çıkarılan beyinden hipokampal dilimler hazırlamak için beynin yaklaşık iki dakika soğumasına izin verin. Daha sonra, buzla dolu bir Petri kabına bir parça filtre kağıdı yerleştirin ve beyni filtre kağıdına aktarın.Ardından, beyni iki yarım küreye ayırın. Kesilmiş yarım küreleri bir vibratom kesit platformuna yapıştırın ve buz gibi soğuk oksijenli ACSF-sükroz ile doldurulmuş kesit tepsisine daldırın. Daha sonra, bir vibratom soğutucusu kullanarak veya buzu vibratom tepsisinin etrafına yerleştirerek bir santigrat derecede 300 mikrometre kalınlığında dilimler oluşturun.Bir boya fırçası kullanarak, hipokampus içeren dilimleri 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış oksijenli ACSF geri kazanımı banyosuna aktarın. Bu adımda, bir hipokampal dilimi lazer taramalı iki fotonlu bir mikroskop hedefi altında bir banyoya aktarın. Banyoyu oksijenli ACSF-normal ile sürekli olarak perfüze edin.Ardından, boyutunu, şeklini ve konumunu kullanarak ilgilenilen bir hücreyi bulmak için kızılötesi diferansiyel girişim kontrast mikroskobunu kullanın. Bundan sonra, uyarıcı bir pipeti kırmızı florofor içeren ACSF-normal bir çözelti ile doldurun. Dilimin üstüne, ucu ilgilenilen hücreyle aynı bölgede olacak şekilde indirin.Bunu takiben, yama pipetini yama solüsyonu ile doldurun ve kafa aşamasına takın. Ucu doğrudan ilgilenilen hücrenin üzerinde olacak şekilde dilimin üzerine yerleştirin. Daha sonra, üç vanaya bir şırınga yerleştirin ve plastik bir tüp aracılığıyla yama pipetine bağlayın.Yama pipetine sabit pozitif basınç enjekte edin ve vanayı yakın konumda tutun. Ardından, MultiClamp amplifikatör kontrol yazılımı modülünü açın ve VC düğmesine tıklayarak Voltage Clamp moduna geçin. Elektrofizyolojik sinyalleri kaydetmek için elektrofizyoloji Clampex veri toplama yazılımını açın ve pipet direncindeki değişiklikleri izlemek için sabit bir kare voltaj darbesi göndermek için Membran Testi simgesine tıklayın.Şimdi, yama pipetini hedeflenen hücrenin tam üstüne gelene kadar indirin. Hücre zarı ile temas ettikten sonra, vanayı açık konuma getirerek basıncı kaldırın. Ardından, pipet direnci bir gigaohm'a ulaşana kadar vanaya takılı boş bir şırınga kullanarak yama pipetine hafif bir negatif basınç uygulayın.Veri toplama yazılımının Membran Testi penceresinde, hücreyi eksi 60 milivoltta sıkıştırın. Pipet direnci düşene ve tüm hücre konfigürasyonu elde edilene kadar negatif basınç uygulamaya devam edin. MultiClamp amplifikatör kontrol yazılımı modülünde, IC düğmesine tıklayarak yama konfigürasyonunu akım kelepçesine ayarlayın ve hiperpolarize ve depolarize edici akımların somatik enjeksiyonlarına yanıt olarak membran özelliklerini kaydedin.Hücrenin yama çözeltisinde bulunan göstergelerle dolması için en az 30 dakika bekleyin. Görüntüleri elde etmek için, kırmızı floresan sinyalini kullanarak ilgilenilen bir dendriti bulun. AP geri yayılımının verimliliği GABAerjik internöronlardaki mesafe ile önemli ölçüde azalabileceğinden, 50 mikrometreden daha kısa bir proksimal dendrit seçerek görünür bir yanıt sağlayın ve xt moduna geçin.Lazer yoğunluğu kontrolörleriyle, fototoksisiteyi önlemek için iki fotonlu lazeri, temel yeşil floresansın çok az görünür olduğu minimum güç seviyesine ayarlayın. Daha sonra, Clampex elektrofizyoloji veri toplama yazılımında Protokol penceresi ve görüntü elde etme yazılımında, istenen genlikte somatik bir akım enjeksiyonu içeren istenen sürenin bir kayıt denemesini oluşturun. Bundan sonra, tıklayın Kaydı başlat düğmesine basın ve floresansı bir ila iki saniye boyunca sürekli olarak elde edin.Görüntü alma işlemini üç ila 10 kez tekrarlayın. Foto hasarı önlemek için tek taramalar arasında en az 30 saniye bekleyin. Elektriksel stimülasyonla indüklenen dendritik kalsiyum geçişlerini kaydetmek için, kırmızı floresan sinyalini kullanarak ilgilenilen bir dendrit bulun.Uyarıcı pipeti, ilgilenilen dendritin üzerindeki dilimin yüzeyine yerleştirin. Stimülasyon pipetini dendritten 10 ila 15 mikrometre uzağa yavaşça indirin ve tüm hücre konfigürasyonunu bozmamak için hareketi en aza indirin. Aspiny nöronlardaki sinaptik mikro alanların konumunu görselleştirmek için, görüntü elde etme yazılımında xt moduna geçin ve çizgiyi ilgilenilen dendritik dal boyunca konumlandırın.Protokol penceresinde, stimülasyonu tetikleyen bir kayıt denemesi oluşturun. Edinme yazılımını kullanarak, dendrit boyunca bir ila iki saniye boyunca sürekli olarak tarayın. Foto hasarı önlemek için taramalar arasında 30 saniye bekleyerek alımı üç ila beş kez tekrarlayın.Hücrenin morfolojisi hakkında ön bilgi edinmek ve stimülasyon pipetinin konumunun kaydını tutmak için, kırmızı kanaldaki hücrenin bir Z yığınını edinin. Edinme yazılımını xyz modunda kullanarak, tüm işlemler dahil olmak üzere tüm hücreyi görüntülemek için üst ve alt yığın sınırlarını ayarlayın. Ardından, adım boyutunu bir mikrometre olarak ayarlayın ve Kaydı Başlat düğmesini kullanarak yığın alımını başlatın.Z yığını alımı tamamlandığında, yığının tüm odak planlarını üst üste bindirmek ve alımın kalitesini doğrulamak için yazılımdaki Maksimum Projeksiyon seçeneğini kullanın. Ardından, yama pipetini dilimden yavaşça geri çekin. Dilimi post hoc morfolojik tanımlama için sabitlemek için, dilimi bir boya fırçası kullanarak banyodan hızlı bir şekilde çıkarın ve ACSF dolgulu bir Petri kabındaki iki filtre kağıdı arasına yerleştirin.ACSF'yi %4'lük bir paraformaldehit çözeltisiyle değiştirin ve tabağı gece boyunca dört santigrat derecede bırakın. Bu şekilde, iki fotonlu bir Z-yığınının maksimum projeksiyonu, Alexa-594 ile doldurulmuş yamalı bir internöronu göstermektedir. Beyaz ok uçları, piramidal tabaka içindeki aksonal terminallerin konumuna işaret eder ve bu da internöronun bir sepet hücresi olduğunu düşündürür.Bu şekil, uyarıcı elektrotun yerleştirildiği dendritik dalı göstermektedir. Kesikli çizgi, çizgi taramasının konumunu gösterir. Buradaki görüntüler, kırmızı ve yeşil kanallarda yapılan bir çizgi taramasının sonucunu göstermektedir.Stimülasyon sırasında yeşil floresanstaki artış, o bölgedeki kalsiyum konsantrasyonunda bir artış olduğunu gösterir. Görüntüler daha küçük segmentlere bölünebilir ve bu da yanıtın yayılımının analizine olanak tanır. Burada görülen izler, görüntüleme denemesi sırasında somatik düzeyde kaydedilen elektriksel stimülasyona yanıt olarak farklı segmentlerde ortaya çıkan kalsiyum geçişlerini göstermektedir.Kalsiyum geçici akımlarının genliği, merkezi sıcak noktadan uzaklaştıkça azalır ve bu da yanıtın uzamsal olarak lokalize olduğunu gösterir. Bu prosedürü takiben, dendritik dallar içindeki bellek potansiyelindeki yerel değişiklikler veya belirli girdilerin entegrasyonu gibi ek soruları yanıtlamak için voltaja duyarlı boya görüntüleme veya optogenetik gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, dendritik girdi entegrasyonu ve plastisitenin inceliklerini keşfetmek için faydalı olacak optofizyolojik tekniklerin bir kombinasyonunu kullanarak nöronal dendritlerdeki aktiviteye bağlı kalsiyum dalgalanmalarının nasıl izleneceğini iyi anlamalısınız.

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem.

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Nöron ağları geliştirme spontan aktivite, kalsiyum duyarlı göstergesi boyalar AM ester formları kullanarak ölçülebilir. Nöronal aktivasyon gösteren hücre içi kalsiyum değişiklikler, bir veya iki foton görüntüleme göstergesi floresan geçici değişiklikler olarak algılanır. Bu protokol, gelişimsel bağımlı nöron ağları bir dizi için adapte...

Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

Bu protokol, biz görüntüleme Ca son gelişmeleri...

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Alt-mikrometre mekansal ve alt milisaniyelik zamansal çözünürlüğe sahip membran potansiyeli değişiklikleri izleme için bir görüntüleme tekniği tarif edilmiştir. Gerilim karşı hassas boyaların lazer uyarma göre yöntem, aksonların ve akson kollateral, terminal dendritik dalları, ve bireysel dendritik omurga sinyallerin ölçümleri sağlar.

Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı

Bu video, beyin hipokampal dilimlerinde tam hücre yama klemp kaydı ve iki fotonlu kalsiyum görüntüleme için bir protokolü göstermektedir. Bu yöntem, akut beyin dilimlerindeki farklı nöronal tiplerdeki dendritlerdeki yerel Ca2+ geçici akımlarının (CaT'ler) dinamiklerini incelemeye izin verir.

Beyin Dilimlerinin İki Fotonlu Kalsiyum Görüntülemesi için Tam Hücre Konfigürasyonunun Oluşturulması

Prosedürler, membran potansiyelinin veya akımının eşzamanlı kayıtlarını ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri gerçekleştirmek için tanımlanır. Suprakiazmatik çekirdek nöronları, tüm hücre yama kelepçesi konfigürasyonunda bir yama kelepçe elektrodu kullanılarak kalsiyum indikatörü bis-fura-2 ile doldurulur.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Canlı hayvanda hızlandırılmış görüntüleme, sağlam beyindeki yapısal yeniden yapılanma hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, canlı fare korteksindeki floresan etiketli sinaptik yapıların iki foton mikroskobu ile transkraniyal görüntülenmesine izin veren inceltilmiş bir kafatası preparatını tanıtıyoruz.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

Bu tam hücre patch-kelepçesi ve fare beyin, akut doku dilimleri dendrit ve hipokampal nöronlar dikenler Hücre içi sodyum transient çoklu foton görüntüleme ile, nöro-aktif bileşiklerin fokal UV uyarımlı foto-aktivasyon kombinasyonunu tarif eder.

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Öğrenin, akut beyin dilimlerinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme ve tam hücre patch-clamp kayıtları kullanarak nöronal dendritlerdeki kalsiyum sinyallerini yüksek çözünürlükle izlemeyi. Bu yöntem, sinaptik entegrasyon süreçlerini detaylı analiz etmenizi sağlar.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Daha fazla video keşfet