Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Bu deneyin genel amacı, dendritlerde iki fotonlu kalsiyum görüntülemeye paralel olarak nöronal somada tam hücre yama-klemp kayıtlarını kullanarak farklı stimülasyon paradigmalarına yanıt olarak nöronal dendritlerdeki kalsiyum yükselmelerini incelemektir. Bu yöntem, küçük dendritik bölmelerde kalsiyum sinyalini izlemek için kullanılabilir ve sinaptik girdilerin entegrasyonu sırasında dendritik dallarda meydana gelen süreçlerin yakından gözlemlenmesine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, kalsiyum sinyal modellerinin yüksek uzay-zamansal çözünürlük ve özgüllükte gözlemlenmesini sağlamasıdır.

Fare beynini sürekli oksijenli, soğuk ACSF-sakaroz içeren bir Petri kabına yerleştirin. Çıkarılan beyinden hipokampal dilimler hazırlamak için beynin yaklaşık iki dakika soğumasına izin verin. Daha sonra, buzla dolu bir Petri kabına bir parça filtre kağıdı yerleştirin ve beyni filtre kağıdına aktarın.

Ardından, beyni iki yarım küreye ayırın. Kesilmiş yarım küreleri bir vibratom kesit platformuna yapıştırın ve buz gibi soğuk oksijenli ACSF-sükroz ile doldurulmuş kesit tepsisine daldırın. Daha sonra, bir vibratom soğutucusu kullanarak veya buzu vibratom tepsisinin etrafına yerleştirerek bir santigrat derecede 300 mikrometre kalınlığında dilimler oluşturun.

Bir boya fırçası kullanarak, hipokampus içeren dilimleri 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış oksijenli ACSF geri kazanımı banyosuna aktarın. Bu adımda, bir hipokampal dilimi lazer taramalı iki fotonlu bir mikroskop hedefi altında bir banyoya aktarın. Banyoyu oksijenli ACSF-normal ile sürekli olarak perfüze edin.

Ardından, boyutunu, şeklini ve konumunu kullanarak ilgilenilen bir hücreyi bulmak için kızılötesi diferansiyel girişim kontrast mikroskobunu kullanın. Bundan sonra, uyarıcı bir pipeti kırmızı florofor içeren ACSF-normal bir çözelti ile doldurun. Dilimin üstüne, ucu ilgilenilen hücreyle aynı bölgede olacak şekilde indirin.

Bunu takiben, yama pipetini yama solüsyonu ile doldurun ve kafa aşamasına takın. Ucu doğrudan ilgilenilen hücrenin üzerinde olacak şekilde dilimin üzerine yerleştirin. Daha sonra, üç vanaya bir şırınga yerleştirin ve plastik bir tüp aracılığıyla yama pipetine bağlayın.

Yama pipetine sabit pozitif basınç enjekte edin ve vanayı yakın konumda tutun. Ardından, MultiClamp amplifikatör kontrol yazılımı modülünü açın ve VC düğmesine tıklayarak Voltage Clamp moduna geçin. Elektrofizyolojik sinyalleri kaydetmek için elektrofizyoloji Clampex veri toplama yazılımını açın ve pipet direncindeki değişiklikleri izlemek için sabit bir kare voltaj darbesi göndermek için Membran Testi simgesine tıklayın.

Şimdi, yama pipetini hedeflenen hücrenin tam üstüne gelene kadar indirin. Hücre zarı ile temas ettikten sonra, vanayı açık konuma getirerek basıncı kaldırın. Ardından, pipet direnci bir gigaohm'a ulaşana kadar vanaya takılı boş bir şırınga kullanarak yama pipetine hafif bir negatif basınç uygulayın.

Veri toplama yazılımının Membran Testi penceresinde, hücreyi eksi 60 milivoltta sıkıştırın. Pipet direnci düşene ve tüm hücre konfigürasyonu elde edilene kadar negatif basınç uygulamaya devam edin. MultiClamp amplifikatör kontrol yazılımı modülünde, IC düğmesine tıklayarak yama konfigürasyonunu akım kelepçesine ayarlayın ve hiperpolarize ve depolarize edici akımların somatik enjeksiyonlarına yanıt olarak membran özelliklerini kaydedin.

Hücrenin yama çözeltisinde bulunan göstergelerle dolması için en az 30 dakika bekleyin. Görüntüleri elde etmek için, kırmızı floresan sinyalini kullanarak ilgilenilen bir dendriti bulun. AP geri yayılımının verimliliği GABAerjik internöronlardaki mesafe ile önemli ölçüde azalabileceğinden, 50 mikrometreden daha kısa bir proksimal dendrit seçerek görünür bir yanıt sağlayın ve xt moduna geçin.

Lazer yoğunluğu kontrolörleriyle, fototoksisiteyi önlemek için iki fotonlu lazeri, temel yeşil floresansın çok az görünür olduğu minimum güç seviyesine ayarlayın. Daha sonra, Clampex elektrofizyoloji veri toplama yazılımında Protokol penceresi ve görüntü elde etme yazılımında, istenen genlikte somatik bir akım enjeksiyonu içeren istenen sürenin bir kayıt denemesini oluşturun. Bundan sonra, tıklayın Kaydı başlat düğmesine basın ve floresansı bir ila iki saniye boyunca sürekli olarak elde edin.

Görüntü alma işlemini üç ila 10 kez tekrarlayın. Foto hasarı önlemek için tek taramalar arasında en az 30 saniye bekleyin. Elektriksel stimülasyonla indüklenen dendritik kalsiyum geçişlerini kaydetmek için, kırmızı floresan sinyalini kullanarak ilgilenilen bir dendrit bulun.

Uyarıcı pipeti, ilgilenilen dendritin üzerindeki dilimin yüzeyine yerleştirin. Stimülasyon pipetini dendritten 10 ila 15 mikrometre uzağa yavaşça indirin ve tüm hücre konfigürasyonunu bozmamak için hareketi en aza indirin. Aspiny nöronlardaki sinaptik mikro alanların konumunu görselleştirmek için, görüntü elde etme yazılımında xt moduna geçin ve çizgiyi ilgilenilen dendritik dal boyunca konumlandırın.

Protokol penceresinde, stimülasyonu tetikleyen bir kayıt denemesi oluşturun. Edinme yazılımını kullanarak, dendrit boyunca bir ila iki saniye boyunca sürekli olarak tarayın. Foto hasarı önlemek için taramalar arasında 30 saniye bekleyerek alımı üç ila beş kez tekrarlayın.

Hücrenin morfolojisi hakkında ön bilgi edinmek ve stimülasyon pipetinin konumunun kaydını tutmak için, kırmızı kanaldaki hücrenin bir Z yığınını edinin. Edinme yazılımını xyz modunda kullanarak, tüm işlemler dahil olmak üzere tüm hücreyi görüntülemek için üst ve alt yığın sınırlarını ayarlayın. Ardından, adım boyutunu bir mikrometre olarak ayarlayın ve Kaydı Başlat düğmesini kullanarak yığın alımını başlatın.

Z yığını alımı tamamlandığında, yığının tüm odak planlarını üst üste bindirmek ve alımın kalitesini doğrulamak için yazılımdaki Maksimum Projeksiyon seçeneğini kullanın. Ardından, yama pipetini dilimden yavaşça geri çekin. Dilimi post hoc morfolojik tanımlama için sabitlemek için, dilimi bir boya fırçası kullanarak banyodan hızlı bir şekilde çıkarın ve ACSF dolgulu bir Petri kabındaki iki filtre kağıdı arasına yerleştirin.

ACSF'yi %4'lük bir paraformaldehit çözeltisiyle değiştirin ve tabağı gece boyunca dört santigrat derecede bırakın. Bu şekilde, iki fotonlu bir Z-yığınının maksimum projeksiyonu, Alexa-594 ile doldurulmuş yamalı bir internöronu göstermektedir. Beyaz ok uçları, piramidal tabaka içindeki aksonal terminallerin konumuna işaret eder ve bu da internöronun bir sepet hücresi olduğunu düşündürür.

Bu şekil, uyarıcı elektrotun yerleştirildiği dendritik dalı göstermektedir. Kesikli çizgi, çizgi taramasının konumunu gösterir. Buradaki görüntüler, kırmızı ve yeşil kanallarda yapılan bir çizgi taramasının sonucunu göstermektedir.

Stimülasyon sırasında yeşil floresanstaki artış, o bölgedeki kalsiyum konsantrasyonunda bir artış olduğunu gösterir. Görüntüler daha küçük segmentlere bölünebilir ve bu da yanıtın yayılımının analizine olanak tanır. Burada görülen izler, görüntüleme denemesi sırasında somatik düzeyde kaydedilen elektriksel stimülasyona yanıt olarak farklı segmentlerde ortaya çıkan kalsiyum geçişlerini göstermektedir.

Kalsiyum geçici akımlarının genliği, merkezi sıcak noktadan uzaklaştıkça azalır ve bu da yanıtın uzamsal olarak lokalize olduğunu gösterir. Bu prosedürü takiben, dendritik dallar içindeki bellek potansiyelindeki yerel değişiklikler veya belirli girdilerin entegrasyonu gibi ek soruları yanıtlamak için voltaja duyarlı boya görüntüleme veya optogenetik gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, dendritik girdi entegrasyonu ve plastisitenin inceliklerini keşfetmek için faydalı olacak optofizyolojik tekniklerin bir kombinasyonunu kullanarak nöronal dendritlerdeki aktiviteye bağlı kalsiyum dalgalanmalarının nasıl izleneceğini iyi anlamalısınız.