Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme
March 15th, 2018
Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.
Bu deneyin genel amacı, dendritlerde iki fotonlu kalsiyum görüntülemeye paralel olarak nöronal somada tam hücre yama-klemp kayıtlarını kullanarak farklı stimülasyon paradigmalarına yanıt olarak nöronal dendritlerdeki kalsiyum yükselmelerini incelemektir. Bu yöntem, küçük dendritik bölmelerde kalsiyum sinyalini izlemek için kullanılabilir ve sinaptik girdilerin entegrasyonu sırasında dendritik dallarda meydana gelen süreçlerin yakından gözlemlenmesine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, kalsiyum sinyal modellerinin yüksek uzay-zamansal çözünürlük ve özgüllükte gözlemlenmesini sağlamasıdır.
Fare beynini sürekli oksijenli, soğuk ACSF-sakaroz içeren bir Petri kabına yerleştirin. Çıkarılan beyinden hipokampal dilimler hazırlamak için beynin yaklaşık iki dakika soğumasına izin verin. Daha sonra, buzla dolu bir Petri kabına bir parça filtre kağıdı yerleştirin ve beyni filtre kağıdına aktarın.
Ardından, beyni iki yarım küreye ayırın. Kesilmiş yarım küreleri bir vibratom kesit platformuna yapıştırın ve buz gibi soğuk oksijenli ACSF-sükroz ile doldurulmuş kesit tepsisine daldırın. Daha sonra, bir vibratom soğutucusu kullanarak veya buzu vibratom tepsisinin etrafına yerleştirerek bir santigrat derecede 300 mikrometre kalınlığında dilimler oluşturun.
Bir boya fırçası kullanarak, hipokampus içeren dilimleri 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış oksijenli ACSF geri kazanımı banyosuna aktarın. Bu adımda, bir hipokampal dilimi lazer taramalı iki fotonlu bir mikroskop hedefi altında bir banyoya aktarın. Banyoyu oksijenli ACSF-normal ile sürekli olarak perfüze edin.
Ardından, boyutunu, şeklini ve konumunu kullanarak ilgilenilen bir hücreyi bulmak için kızılötesi diferansiyel girişim kontrast mikroskobunu kullanın. Bundan sonra, uyarıcı bir pipeti kırmızı florofor içeren ACSF-normal bir çözelti ile doldurun. Dilimin üstüne, ucu ilgilenilen hücreyle aynı bölgede olacak şekilde indirin.
Bunu takiben, yama pipetini yama solüsyonu ile doldurun ve kafa aşamasına takın. Ucu doğrudan ilgilenilen hücrenin üzerinde olacak şekilde dilimin üzerine yerleştirin. Daha sonra, üç vanaya bir şırınga yerleştirin ve plastik bir tüp aracılığıyla yama pipetine bağlayın.
Yama pipetine sabit pozitif basınç enjekte edin ve vanayı yakın konumda tutun. Ardından, MultiClamp amplifikatör kontrol yazılımı modülünü açın ve VC düğmesine tıklayarak Voltage Clamp moduna geçin. Elektrofizyolojik sinyalleri kaydetmek için elektrofizyoloji Clampex veri toplama yazılımını açın ve pipet direncindeki değişiklikleri izlemek için sabit bir kare voltaj darbesi göndermek için Membran Testi simgesine tıklayın.
Şimdi, yama pipetini hedeflenen hücrenin tam üstüne gelene kadar indirin. Hücre zarı ile temas ettikten sonra, vanayı açık konuma getirerek basıncı kaldırın. Ardından, pipet direnci bir gigaohm'a ulaşana kadar vanaya takılı boş bir şırınga kullanarak yama pipetine hafif bir negatif basınç uygulayın.
Veri toplama yazılımının Membran Testi penceresinde, hücreyi eksi 60 milivoltta sıkıştırın. Pipet direnci düşene ve tüm hücre konfigürasyonu elde edilene kadar negatif basınç uygulamaya devam edin. MultiClamp amplifikatör kontrol yazılımı modülünde, IC düğmesine tıklayarak yama konfigürasyonunu akım kelepçesine ayarlayın ve hiperpolarize ve depolarize edici akımların somatik enjeksiyonlarına yanıt olarak membran özelliklerini kaydedin.
Hücrenin yama çözeltisinde bulunan göstergelerle dolması için en az 30 dakika bekleyin. Görüntüleri elde etmek için, kırmızı floresan sinyalini kullanarak ilgilenilen bir dendriti bulun. AP geri yayılımının verimliliği GABAerjik internöronlardaki mesafe ile önemli ölçüde azalabileceğinden, 50 mikrometreden daha kısa bir proksimal dendrit seçerek görünür bir yanıt sağlayın ve xt moduna geçin.
Lazer yoğunluğu kontrolörleriyle, fototoksisiteyi önlemek için iki fotonlu lazeri, temel yeşil floresansın çok az görünür olduğu minimum güç seviyesine ayarlayın. Daha sonra, Clampex elektrofizyoloji veri toplama yazılımında Protokol penceresi ve görüntü elde etme yazılımında, istenen genlikte somatik bir akım enjeksiyonu içeren istenen sürenin bir kayıt denemesini oluşturun. Bundan sonra, tıklayın Kaydı başlat düğmesine basın ve floresansı bir ila iki saniye boyunca sürekli olarak elde edin.
Görüntü alma işlemini üç ila 10 kez tekrarlayın. Foto hasarı önlemek için tek taramalar arasında en az 30 saniye bekleyin. Elektriksel stimülasyonla indüklenen dendritik kalsiyum geçişlerini kaydetmek için, kırmızı floresan sinyalini kullanarak ilgilenilen bir dendrit bulun.
Uyarıcı pipeti, ilgilenilen dendritin üzerindeki dilimin yüzeyine yerleştirin. Stimülasyon pipetini dendritten 10 ila 15 mikrometre uzağa yavaşça indirin ve tüm hücre konfigürasyonunu bozmamak için hareketi en aza indirin. Aspiny nöronlardaki sinaptik mikro alanların konumunu görselleştirmek için, görüntü elde etme yazılımında xt moduna geçin ve çizgiyi ilgilenilen dendritik dal boyunca konumlandırın.
Protokol penceresinde, stimülasyonu tetikleyen bir kayıt denemesi oluşturun. Edinme yazılımını kullanarak, dendrit boyunca bir ila iki saniye boyunca sürekli olarak tarayın. Foto hasarı önlemek için taramalar arasında 30 saniye bekleyerek alımı üç ila beş kez tekrarlayın.
Hücrenin morfolojisi hakkında ön bilgi edinmek ve stimülasyon pipetinin konumunun kaydını tutmak için, kırmızı kanaldaki hücrenin bir Z yığınını edinin. Edinme yazılımını xyz modunda kullanarak, tüm işlemler dahil olmak üzere tüm hücreyi görüntülemek için üst ve alt yığın sınırlarını ayarlayın. Ardından, adım boyutunu bir mikrometre olarak ayarlayın ve Kaydı Başlat düğmesini kullanarak yığın alımını başlatın.
Z yığını alımı tamamlandığında, yığının tüm odak planlarını üst üste bindirmek ve alımın kalitesini doğrulamak için yazılımdaki Maksimum Projeksiyon seçeneğini kullanın. Ardından, yama pipetini dilimden yavaşça geri çekin. Dilimi post hoc morfolojik tanımlama için sabitlemek için, dilimi bir boya fırçası kullanarak banyodan hızlı bir şekilde çıkarın ve ACSF dolgulu bir Petri kabındaki iki filtre kağıdı arasına yerleştirin.
ACSF'yi %4'lük bir paraformaldehit çözeltisiyle değiştirin ve tabağı gece boyunca dört santigrat derecede bırakın. Bu şekilde, iki fotonlu bir Z-yığınının maksimum projeksiyonu, Alexa-594 ile doldurulmuş yamalı bir internöronu göstermektedir. Beyaz ok uçları, piramidal tabaka içindeki aksonal terminallerin konumuna işaret eder ve bu da internöronun bir sepet hücresi olduğunu düşündürür.
Bu şekil, uyarıcı elektrotun yerleştirildiği dendritik dalı göstermektedir. Kesikli çizgi, çizgi taramasının konumunu gösterir. Buradaki görüntüler, kırmızı ve yeşil kanallarda yapılan bir çizgi taramasının sonucunu göstermektedir.
Stimülasyon sırasında yeşil floresanstaki artış, o bölgedeki kalsiyum konsantrasyonunda bir artış olduğunu gösterir. Görüntüler daha küçük segmentlere bölünebilir ve bu da yanıtın yayılımının analizine olanak tanır. Burada görülen izler, görüntüleme denemesi sırasında somatik düzeyde kaydedilen elektriksel stimülasyona yanıt olarak farklı segmentlerde ortaya çıkan kalsiyum geçişlerini göstermektedir.
Kalsiyum geçici akımlarının genliği, merkezi sıcak noktadan uzaklaştıkça azalır ve bu da yanıtın uzamsal olarak lokalize olduğunu gösterir. Bu prosedürü takiben, dendritik dallar içindeki bellek potansiyelindeki yerel değişiklikler veya belirli girdilerin entegrasyonu gibi ek soruları yanıtlamak için voltaja duyarlı boya görüntüleme veya optogenetik gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, dendritik girdi entegrasyonu ve plastisitenin inceliklerini keşfetmek için faydalı olacak optofizyolojik tekniklerin bir kombinasyonunu kullanarak nöronal dendritlerdeki aktiviteye bağlı kalsiyum dalgalanmalarının nasıl izleneceğini iyi anlamalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, akustik beyin dilimleri kullanılarak nöronal dendritlerde kalsiyum geçicilerini araştırmak için tüm-hücre patch-clamp kayıtlarını iki-foton görüntüleme ile birleştiren bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, sinaptik girdi entegrasyonu sırasında küçük dendritik bölmelerde kalsiyum sinyalleşmesinin izlenmesini sağlar. Yüksek uzamsal-zamansal çözünürlük, çeşitli stimülasyon paradigmalarına tepki olarak nöronal dinamiklerin ayrıntılı gözlemlenmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Elektrofizyoloji
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Kalsiyum sinyalleşmesi nöronal fonksiyon ve sinaptik entegrasyonda kritik bir rol oynar.
- Dendritlerdeki kalsiyum dinamiklerini anlamak nöronal işleme ve plastisite hakkında ışık tutabilir.
- Tüm-hücre patch-clamp kayıtları, nöronlarda voltaj ve akımın kesin ölçümüne izin verir.
- İki-foton görüntüleme, kalsiyum dinamiklerini yüksek çözünürlükte görselleştirme olanağını sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Farklı stimülasyon protokollerine tepki olarak nöronal dendritlerdeki kalsiyum yükselişlerini araştırmak.
- Gelişmiş gözlem için tüm-hücre patch-clamp ve iki-foton görüntülemeyi eşzamanlı kullanmak.
- Dendritik dallardaki sinaptik entegrasyonun ayrıntılı analizini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kullanılan platform, fare hipokampuslarından hazırlanan akustik beyin dilimlerini içerir.
- Tüm-hücre patch-clamp kayıtları nöronal soma üzerinde yapılırken iki-foton kalsiyum görüntüleme dendritik bölmelere hedeflenir.
- Kritik adımlar arasında beyin dilimlerinin hazırlanması, tüm-hücre konfigürasyonunun kurulması ve ardışık görüntü elde edilmesi bulunur.
- Metodoloji, görüntüleme sırasında hücre bütünlüğünün korunmasını ve fotohasarın en aza indirilmesini vurgular.
Ana Sonuçlar
- Bu yöntem, elektriksel stimülasyona tepki olarak kalsiyum geçicilerinin yüksek çözünürlüklü gözlemlenmesine izin vermiştir.
- Ana bulgular arasında dendritik dallardaki farklı kalsiyum sinyallemesi desenlerinin gösterimi bulunur.
- Bu teknik, sinaptik entegrasyon ve dendritik bölmelendirilmeye dair içgörüler ortaya koymuştur.
Sonuçlar
- Bu çalışma, nöronal dendritlerde kalsiyum dinamiklerini izlemek için güçlü bir yaklaşımı gösterir.
- Bulgular, dendritik düzeyde sinaptik entegrasyon süreçlerinin anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Metodoloji, nöronal plastisite ve diğer kalsiyum bağımlı mekanizmaların incelenmesi için daha geniş çaplı çıkarımlara sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Monitoring calcium signaling in neuronal dendrites provides mechanistic insights into synaptic integration and plasticity, which are critical for target validation in CNS drug discovery. The ability to resolve spatiotemporal dynamics in subcellular compartments supports de-risking of therapeutic hypotheses by linking molecular targets to functional neuronal outputs. This approach enhances predictive confidence in early discovery by enabling direct observation of target engagement effects on dendritic excitability and signal processing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking target modulation to dendritic calcium signaling patterns in GABAergic interneurons.
- Operational Value: Provides high-resolution functional readouts that clarify pathway involvement and reduce mechanistic ambiguity in target validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing whether compounds induce expected subcellular signaling responses in disease-relevant neuronal systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Combines electrophysiological confirmation of neuronal health with imaging-ready dendritic compartments for reliable compound screening.
- Quantitative Output: Generates spatially resolved calcium transient amplitudes and kinetics as measurable endpoints for dose-response analysis.
- Reproducibility: Standardized slice preparation and imaging parameters enable cross-run consistency essential for assay validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studying dendritic signaling in inhibitory interneurons implicated in epilepsy, schizophrenia, and cognitive disorders.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical models by preserving native dendritic architecture and synaptic physiology in acute brain slices.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether target engagement produces expected subcellular signaling changes before advancing to in vivo efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing functional validation of target modulation in neuronal dendrites prior to phenotypic screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how target modulation alters calcium signaling dynamics in dendritic branches during synaptic integration.
- Screening: Enables assay development with quantitative, spatially resolved calcium readouts that distinguish compound effects across dendritic compartments.
- Analytics: Delivers high-resolution temporal and spatial calcium flux measurements that allow comparison of stimulation paradigms and drug-induced changes.
- Translational Research: Maintains physiological relevance through acute brain slice preparation, supporting continuity to preclinical validation of target effects on dendritic function.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple targets across neuronal types using standardized electrophysiology-imaging integration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly observing target-mediated changes in dendritic calcium signaling linked to synaptic plasticity.
- Operational Value: Standardizes dual-modality readouts (electrophysiology + imaging) for consistent, reproducible data generation across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional validation of target engagement in subcellular neuronal compartments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on whether compounds produce expected dendritic signaling profiles in disease-relevant interneurons.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, two-photon microscopy, and fluorescent calcium indicator handling.
- Dependent on laser-scanning two-photon microscope, patch-clamp amplifier, and perfusion system for slice viability.
- Necessitates standardization of slice preparation, imaging depth, and stimulation parameters across users and sites.
- Adaptation to different neuronal types may require optimization of dendritic targeting and indicator loading efficiency.
- Practical limitations include photodamage risk during prolonged imaging and technical challenge of maintaining whole-cell configuration in fine dendrites.
