Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Bu prosedürün genel amacı, drosophila pupa yumurtalıklarını incelemek ve boyamaktır. Bu yöntem, model organizma drosophila'da kök hücre farklılaşması ve doku gelişimi ile ilgili olanlar gibi biyolojinin gelişimindeki kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, aksi takdirde izole edilmesi zor olan pupa yumurtalıklarının küçük boyutunu ve yarı saydam doğasını barındırmak için özelleştirilebilir araçların kullanılmasıdır.

Pupa drosophila gelişimi sırasında yumurtalıktaki kök hücre bölünmesini izlemek için zaman kursu deneyleri yaptığımızda onun yöntemini kullanma fikrimiz vardı. Protokole başlamak için, 10 erkek ve 15 dişi yetişkin drosophila sineğini, maya ile takviye edilmiş normal zengin sinek yemi şişesinde birleştirin. Yumurtaların oda sıcaklığında üç ila dört gün larva haline gelmesine izin verin.

Üç ila dört gün sonra, yumuşak kıllara sahip nemli ince bir fırça kullanarak, fırça ile şişenin duvarı boyunca yuvarlanma hareketi yapın, dolaşan üçüncü instar larvalarını şişeden bir cam kuyuya aktarın, ağzına kadar 1X fosfat tamponlu salin veya PBS ile doldurun. Larvalardaki yiyecek artıklarını 1X PBS ile doldurulmuş başka bir kuyuya aktararak yıkayın. Erkek ve dişi larvaları forseps ile ayırın.

Erkek larvaları, ön ucundan üçte ikisi aşağıda, yan taraftaki yağ gövdesine gömülü bir çift büyük, yuvarlak ve yarı saydam testis ile tanımlayın. Daha sonra kuyudan en az 10 dişi toplayın ve dişi larvaları 1X PBS ile doldurulmuş ayrı bir kuyuya yerleştirin. Dişi larvaları nazikçe maya ile takviye edilmiş yeni bir taze sinek yemi şişesine aktarmak için forseps kullanın.

Yumurtlamayı kolaylaştırmak için şişeyi dişi larvalarla birlikte karanlık bir yere yerleştirin. Gün boyunca larvaları yumurtlama açısından izleyin. Her larva lobalize olup bir pre-pupaya dönüşürken, pre-pupa'yı flakona karşı daire içine alın ve ilk kez bir pre-pupa haline geldiği yaklaşık zamanı kaydedin.

Bir pester pipetinin cam ucunu bir Bunsen brülörü üzerinde eritin. Cam erirken, daha ince bir uç oluşturmak için ucu pipetin geri kalanından yatay olarak çekmek için forseps kullanın. Soğuduktan sonra, düzgün dairesel bir açıklık oluşturmak için pipet ucunun küçük bir kısmını kırın.

Pipetin diğer ucuna bir ampul takın ve pipeti 1X PBS ile yükleyin. Şişenin duvarına yapıştırılmış pupaları hasat etmek için, pupa ve flakon arasındaki temas bölgesi boyunca küçük bir damla su uygulayın. Protein yapıştırıcısının bir ila iki dakika çözünmesine izin verdikten sonra, pupayı nemli ince bir fırça ile duvardan nazikçe kaldırın.

1X PBS ile doldurulmuş kuyucuk başına tek bir pupa aktarın. Pupa'nın arka ucunu bir çift forseps ile kavrarken, pupa kılıfının ön kısmını pupa'nın başı görünene kadar başka bir çift ile dikkatlice yırtın. Pupa başının en ön ucunu forseps ile kavrayın ve pupayı pupa kılıfından yavaşça dışarı çekin.

Daha sonra, pupanın ön yarısını, sadece karın kesesi kalana kadar arka yarısından ayırın ve atın. Bir elinizle forseps ile karın kesesini kuyunun dibine doğru kavrarken, diğer elinizle 1X PBS ile doldurulmuş ince cam pipeti tutun. İnce pipet ucunu kesenin açıklığına doğru tutun ve pupa yumurtalıklarını çevreleyen yağ vücut hücrelerini yıkamak için 1X PBS'yi yavaşça karın içine pipetleyin.

Yağ gövdesinin en az üçte ikisi gidene kadar veya karın kesesinin açıklığının yakınında yumurtalıklar görünene kadar yağ vücut hücrelerini yıkayın. Yumurtalıklar kuyu içinde görünmüyorsa, karın içinde kalmaları gerekirdi. Yumurtalıklar çıktıysa, kuyuya yeni bir pupa yerleştirin ve bu adımı tekrarlayın.

Karnı, sabitleme tamponu ile doldurulmuş şeffaf bir kapalı cam hazneye aktarın ve kapağı üstüne yerleştirin. Boyama ve montaj işleminde yeterli yumurtalığın durmasını sağlamak için gerekenden daha fazla yumurtalığı inceleyin. Boyama işlemi boyunca, yumurtalıkların tamamen antikor çözeltisine daldırıldığından emin olmak için yüzen yumurtalıkları kapalı camın dibine doğru nazikçe aşağı itmek için forseps kullanın.

Yeni titrenin düz yüzeyine çift taraflı bant şeritleri yerleştirin ve ardından yumurtalıkları ve sabitleme tamponunu içeren odacıklı kapak camını yapışkan yüzeye yerleştirin. Yumurtalıkları fiksasyon tamponunda oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, tam geçirgenlik sağlamak için yumurtalıkları sırasıyla beş, 10 ve 45 dakika boyunca %1 Triton X-100 veya %1 PBST ile 1X PBS'de üç kez durulayın.

Yumurtalıkları 30 dakika boyunca% 10 normal keçi serumunda% 0.5 PBST'de kilitleyin. Daha sonra yumurtalıkları gece boyunca %4 Celsius'ta% 0.5 PBST'de 600 mikrolitre primer antikor içinde inkübe edin. Ertesi gün, yumurtalıkları her biri% 0.5 PBST'de beş dakika boyunca üç kez durulayın.

Yumurtalıkları, oda sıcaklığında% 0.5 PBST ile seyreltilmiş 600 mikrolitre ikincil antikor içinde iki saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, yumurtalıkları% 0.5 PBST'de beş dakika boyunca iki kez ve 1X PBS'de beş dakika boyunca bir kez durulayın. Bir mikroskop lamına küçük bir damla 1X PBS yerleştirin.

Karın kesesini odacıklı kapak camından 1x PBS ile doldurulmuş bir bardağa aktarmak için forseps kullanın. Karın kesesini ve kalan yağ gövdesini forseps ile yırtın. Forsepslerin uçları arasındaki yumurtalıkların merkezini kavrayarak yumurtalıkları kuyudan mikroskop lamı üzerinde 1x PBS'lik bir damlaya aktarın.

Çözelti kuruduğunda slayta birkaç damla 1X PBS ekleyin. Tüm yumurtalıklar diseke edildikten ve mikroskop lamına aktarıldıktan sonra, 40 mikrolitre montaj ortamını 22 x 22 milimetrelik bir kapak kızağına pipetleyin ve kapak kızağını yavaşça yumurtalıkların üzerine yerleştirin. Son olarak, görüntülemeden önce slaytın gece boyunca kurumasını bekleyin.

Fosfohiston H3 boyaması gibi hücre proliferasyonuna özgü immünohistokimya, kök hücrelerin ve diğer mitotik olarak aktif hücre tiplerinin hücre bölünme modellerini incelemek için kullanılabilir. Sürü hücrelerinden elde edilen pupa sap hücreleri, Fasiclin III boyama ile ana hatları belirlenebilir. Bu prosedürü denerken, deney için gerekenden daha fazla PB toplamak ve incelemek en iyisidir, yağ gövdesi ekstraksiyonu veya immünohistokimya işlemi sırasında birkaç yumurtalığın kaybedilebileceği göz önüne alındığında.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneyde iyi şanslar.