Name: Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Öğrenin Drosophila pupa yumurtalık diseksiyonu ve boyama yöntemini kullanarak kök hücre niş gelişimini incelemeyi. Bu protokol küçük ve saydam dokuların izolasyonunu kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (RO1 GM079351 D.K. için). Dorothea Godt onun orijinal protokolüne dayanan pupa yumurtalık diseksiyonu yararlı onun tavsiye için teşekkür ediyoruz. Biz ayrıca Amy Reilein ona yardım ve el yazması üzerine yorum için teşekkür ederiz.

1. EggLaying
<ol><li>Yaklaşık on erkek ve on beş kadın yetişkin Drosophila sinekler istenen genotip normal zengin sinek yemek Maya ile desteklenmiş bir şişe içinde birleştirir. Şişeyi aşırı kalabalık önlemek için 2-4 h14saatten uzun için yumurtlamak şeklindeki kadın izin.</li>
	<li>Yetişkinler şişeyi uçmak gıda ile farklı bir şişe karşı açılış şişe dokunarak yeni bir şişe aktarın. Larvalar, oda sıcaklığında içine 3-4 gün için geliştirmek yumurta izin.</li>
</ol>2. kadın larva seçme
<ol><li>Nemli bir ince fırça ile yumuşak kıllar kullanarak, göçebe üçüncü-biçim larva de 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x ile ağzına kadar dolu bir cam şişe aktarmak için şişe duvar boyunca fırça ile çalışırken bir hareketi yapmak. Gıda artıkları larvalar kapalı onların 1 x PBS ile dolu iyi diğerine transfer ederek yıkayın.</li>
	<li>Erkek ve dişi larva forseps kullanarak ayırın. Büyük, yuvarlak ve yarı saydam testis yağ vücutta yaklaşık üçte vücut yan tarafındaki aşağı onun ön uç15gömülü bir çift tarafından erkek larva tanımlayın. Kadın larva ortalama olarak daha büyük, daha az erkeklerden daha saydam ve daha tespit etmek zordur çok daha küçük gonads var.</li>
	<li>Erkek larva karşı kadın larva toplamak için seçin. En az 10 kadın kuyudan toplamak. Kadın larva de 1 x PBS ile dolu ayrı bir yerleştirin.</li>
	<li>Kadın larva yavaşça taze uçmak yiyecek yeni bir şişe aktarmak için kullanmak forseps Maya ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Şişeyi kadın larvaları ile pupariation16kolaylaştırmak için karanlık bir konuma yerleştirin. Gün boyunca, larva pupariation için izleyin. Her larva immobilizes ve bir prepupa geliştirir, şişeyi karşı prepupa daire ve ne zaman o ilk oluşturur bir prepupa yaklaşık süreyi kaydetmek. Prepupae anterior vızıltısı çıkıntı ve zamanlama puparium oluşumu17belirleyebilir. Prepupae (puparium oluşumu, APF sonra saat cinsinden) istenen saat noktasına geliştirmeye olanak sağlar. Not: bir prepupa puparium formasyonu içerisinde yaklaşık 10 s aralığı tabi herhangi bir hayvan olarak kabul edilebilir. Dahili bir tüy dökme yerini almıştır sonra pupa aşamada yaklaşık 12 h puparium oluşumu sonra başlar.</li>
</ol>3. pupa antikor boyama için hazırlanması
<ol><li>
Sonraki adımda pupa yağ cesedi temizlenmesi için kullanılmak üzere bir ince cam damlalıklı oluştururlar.
	<ol>
<li>Pasteur damlalıklı cam ucu Bunsen brülör üzerinde kavrulur. Cam erir gibi pens ucunu yatay olarak daha ince bir ipucu oluşturmak üzere damlalıklı kalan uzak çekmek için kullanın.</li>
		<li>Soğutma sonra temiz bir dairesel açılış kurmaya damlalıklı ipucu küçük bir bölümünü kır. Bir ampul damlalıklı diğer ucunu takın.</li>
		<li>1 x PBS ile damlalıklı yükleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Şişeyi duvara yapıştırılmış, Pupa, hasat için küçük bir damla su pupa ve flakon arasında temas bölgesi boyunca geçerlidir. Protein bildirmek için 1-2 dakika bekleyin tutkal dağıtılması hafifçe nemli bir ince fırça ile duvarından pupa kaldırma önce. 1 x PBS ile dolu pupa bir cama iyi transfer. Tek bir kuyu kuyu aşırı kalabalık önlemek için pupa başına adamak.</li>
	<li>Pupa başkanı görünene kadar pupa arka sonu forseps bir çift ile açgözlü iken, başka bir çifti pupa modelinde ön kısmını dikkatlice gözyaşı.</li>
	<li>Pupa başından en ön ucu Forseps ile kavrama ve yavaşça pupa pupa kendi halinde dışarı çekin. Not: Yağ vücudun bir kısmı dışarı bu süreçte dökülme.</li>
	<li>Ayrı ve pupa posterior yarım üzerinden ön yarısı kadar sadece karın çuval kalır atın.</li>
	<li>
Yağ vücut hücrelerinin karın çuval ayıklayın.
	<ol>
<li>1 x PBS başka bir el ile dolu ince cam damlalıklı tutarken bir yandan Forseps ile karın çuval kuyunun karşı kavramak.</li>
		<li>İnce damlalıklı ipucu açılması çuval ve yavaş yavaş damlalıklı 1 x PBS pupa yumurtalık çevreleyen yağ vücut hücrelerinin silsin karın içine doğru nişan al. Not: Yumurtalık karın çuval içinde kalması gereken küçük, yarı saydam, çizgili ve dikdörtgen yapıları bir çift vardır.</li>
		<li>Yağ vücut hücreleri en az üçte iki yağ vücudun gitmiş oluncaya veya yumurtalıkların karın çuval açılış yakınındaki görünür hale gelene kadar silsin. Yavaş yavaş bu adımı yürütmek çok önemlidir bu yüzden karın dışında yumurtalıkların kazara yıkamak değil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yumurtalık dışarı yağ vücut hücre yıkama sırasında dökülen Eğer kontrol etmek için iyi inceleyin. Yumurtalık içinde iyi görünür değilse, karın içinde kalması gereken. Yumurtalık dışarı gelmiş varsa, yeni bir pupa kuyuda yerleştirebilir ve bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Fiksasyon arabellek (1 x PBS, %4 paraformaldehyde) ile dolu bir açık coverglass odasına karın aktarmak ve kapağı üzerinde yer. Yumurtalıklar yeterli sayıda dayanacak boyama ve montaj işlemi, emin olmak için gerekenden daha fazla yumurtalıkların incelemek. Uyarı: Toksik olan paraformaldehyde fiksasyon arabellek içeriyor. Lütfen uygun korumaları eldiven, koruyucu gözlük, vbgibi tak.</li>
</ol>4. immünhistokimya
<ol><li>Boyama işlemi süresince, forseps cam kuyunun kayan herhangi bir yumurtalık yumurtalık tamamen antikor çözümde daldırılır emin olmak için yavaşça itin için kullanın.</li>
	<li>Yer çift taraflı bant bir Nutator düz yüzeyine çıkarır ve sonra odacıklı coverglass veya yapışkanlı çekilebilecek.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 15 dk için adım 3.7 fiksasyon arabellekte yumurtalık kuluçkaya.</li>
	<li>Yumurtalık durulama üç 1 x PBS % 1 ile Triton X-100 5, 10 ve 45 dk (toplamda 1 h), sırasıyla, kapsamlı permeabilization izin vermek için kez.</li>
	<li>1 x PBS % 0,5 ile % 10 normal keçi Serumda yumurtalık engellemek Triton X-100 30 dk için.</li>
	<li>Yumurtalık gecede 600 kuluçkaya seçim birincil antikor µL Triton X-100 4 ° C'de % 0,5 ile 1 x PBS uygun konsantrasyonu seyreltilmiş</li>
	<li>1 x PBS % 0.5 ile yumurtalık üç kez 5 min için durulama Triton X-100.</li>
	<li>Triton X-100 oda sıcaklığında 1 x PBS % 0.5 ile uygun konsantrasyon için 2 h seçtiğiniz ikincil antikor 600 µL içinde seyreltilmiş için yumurtalıkların kuluçkaya.</li>
	<li>Yumurtalık iki kez 5 min için 1 x PBS %0.5 Triton X-100 ve 5 dakika içinde 1 x PBS için bir kez ile yıkayın.</li>
</ol>5. anatomi ve pupa yumurtalık montaj
<ol><li>1 x PBS bir mikroskop slayt üzerine küçük bir damla yerleştirin. Kullanım forseps karın çuval odacıklı coverglass bir cam de aktarmak için 1 x PBS ile dolu. Tek bir kuyu kuyu aşırı kalabalık önlemek için pupa başına adamak.</li>
	<li>Dışında kalan herhangi bir yağ vücut ve karın çuval Forseps ile gözyaşı. Not: bir çift küçük, yarı saydam, çizgili ve dikdörtgen yapıları vardır, yumurtalık, kuyunun içinde görünür olması gerekir. Yumurtalık kez sıkıca yağ vücut tarafından çevrili, emin olmak önemlidir bu yüzden tüm yağ vücut iyice parçalanmış ayrı.</li>
	<li>Yumurtalık kuyudan 1 x mikroskop PBS slayt yumurtalık forseps ipuçları arasında merkezi açgözlü tarafından damla içine aktarın. Bir tutuş yumurtalık sıkma olmadan kullanılması şekilde değil kaybetmek veya aktarım sırasında edilebilmek için çok önemlidir. Çözüm zaman içinde kurur 1 x PBS birkaç damla slayda ekleyin.</li>
	<li>Bir kez tüm yumurtalık disseke ve mikroskop slayt, damlalıklı 40 µL, 22 x 22 mm coverslip ve yer coverslip yavaşça yumurtalıklar üzerine montaj ortamına aktarılır. Slayt kuru gecede görüntüleme önce izin.</li>
</ol>

<ol><li>Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21763616">Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation.</a> Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li>
<li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ovary%3A+an+active+stem+cell+community%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).</li>
<li>Dansereau, D. A., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+Germline+Stem+Cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Development of Germline Stem Cells in Drosophila.</a> Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).</li>
<li>Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+Drosophila+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in Drosophila stem cell biology.</a> Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).</li>
<li>Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+cells%2C+wound+healing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem cells, wound healing and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+myeloid+leukemia%3A+proving+ground+for+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells.</a> Cell. 119 (3), 314-316 (2004).</li>
<li>Reilein, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28414313">Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling.</a> Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).</li>
<li>Eliazer, S., Buszczack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+niche%3A+studies+from+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).</li>
<li>Godt, D., Laski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cell+rearrangement+and+cell+recruitment+in+Drosophila+ovary+morphogenesis+and+the+requirement+of+bric+%C3%A0+brac%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac.</a> Development. 121 (1), 173-187 (1995).</li>
<li>King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+female+Drosophila+reproductive+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">The development of the female Drosophila reproductive system.</a> J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).</li>
<li>Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pak-regulated+cell+intercalation+event+leading+to+a+novel+radial+cell+polarity+is+involved+in+positioning+of+the+follicle+stem+cell+niche+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary.</a> Development. 142 (1), 82-91 (2015).</li>
<li>Irizarry, J., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+supports+Drosophila+fertility+by+regulating+development+of+ovarian+muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues.</a> Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).</li>
<li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Staining+of+Drosophila+Larval+Ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries.</a> J Vis Exp. (51), e2537(2011).</li>
<li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growth+of+the+Gonads+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).</li>
<li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).</li>
<li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Courdec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bric+%C3%A0+brac+locus+consists+of+two+paralagous+genes+encoding+BTB%2FPOZ+domain+proteins+and+acts+as+a+homeotic+and+morphogenetic+regulator+of+imaginal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila.</a> Development. 129, 2419-2433 (2002).</li>
<li>Arrese, E. L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((INSECT+FAT+BODY%3A+ENERGY%2C+METABOLISM%2C+AND+REGULATION%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., Xi, Y. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/open-access/fat-body-development-and-its-function-in-energy-storage-and-nutrient-sensing-in-drosophila-melanogaster-2157-7552.1000141.php?aid=36443">Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster.</a> J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).</li>
<li>Wong, L. C., Schedl, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2504450/">Dissection of Drosophila Ovaries.</a> J Vis Exp. (1), e52(2006).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.

Bu iletişim kuralının en kritik ve zor adım pupa yumurtalık fiksasyon öncesinde hazırlanması içerir. Yumurtalıklar, küçük ve gömülü içinde pupa karın yağ vücut hücreleri tarafından yeterince antikorlar ile lekeli emin olmak için sadece büyük bir açılış karın yatakta Forseps ile gözyaşı ama aynı zamanda engel yağ vücut hücreleri ayıklamak önemlidir Yumurtalık antikorlar üzerinden. Bu adımın başarılı yürütme gerektirir yağ vücut hücrelerinin karın çuval dışarı yıkama sırasında Pasteur damlalıklı ampul üzerinde ince baskı u...

Drosophila yumurtalık kullanarak kök hücre araştırma kök hücre niş1,2,3,4ilk belgelenmesi beri yaygın olarak genişletti. Soy izleme genetik araçlarını, Drosophila yumurtalık diseksiyonlarının sık kök hücre soy eğitim için kullanılan gelişimi takip ve kök hücre bakım, yayılmasını önleme ve kök hücre niş kadere düzenleyen yolları sinyal. Bu sinyal yolları bilgisine kanserlerin anormal kök hücre etkinlik5,6,7' den kaynaklanan olası nedenler anlayışlar verim. Ayrıca son zamanlarda folikül kök hücreler (FSCs) bilinen Drosophila yumurtalık somatik kök hücre şiddetle memeli bağırsak kök hücre kendi organizasyon8birçok yönleriyle benzer gösterilmiştir. Bu nedenle, Drosophila yumurtalık kök hücre davranış eğitimi için son derece faydalı model sistemi vardır.
Larva ve yetişkin yumurtalık erken kök hücre gelişimi ve niş içinde son kök hücre organizasyon ipuçları sırasıyla sunarken, Pupa yumurtalık germline ve somatik hücre yeniden düzenlemek ve kimliklerini kurmak bir ara yapıdır 9 , 10. rağmen birçok araştırma yönleri pupa yumurtalık10,11,12,13' te doku gelişimi inceledik, farklılaşma ve mekansal organizasyonu ile ilgili sorular kalır pupa geliştirme sırasında yumurtalık hücre türleri. Özellikle, bu döneminde FSCs tayini oluşur. Bu iletişim kuralı anatomi ve istediğiniz zaman noktalarda pupa yumurtalık boyama yöntemi özetliyor — pupa yumurtalık gelişimi yetişkin sahneye larva üzerinden ayrıntılı olarak analiz zaman ders deneylerde kullanılan bir teknik.
Küçük boyutu, translucence ve pupa karın içinde pupa yumurtalık erişilememesi için hesap için bu iletişim kuralını antikor erişimin engellenmesi karın yağ vücut dokusu kaldırmak için bir ısmarlama ince uçlu Pasteur damlalıklı gibi araçlar kullanır Yumurtalık. Teklifler geniş çaplı bir görünürlük pupa ve yumurtalık "Nutator" üzerinde sallanan nazik bir platform boyama antikor sırasında kullanılan bir açık, odacıklı coverglass Larva yumurtalık gruptakiler için bir protokol Maimon ve beratını14tarafından dayanarak, Triton X-100 nispeten yüksek bir konsantrasyon boyama yordamın ilk adımda hücre zarının permeabilization ve antikor erişimin en üst düzeye çıkarmak için istihdam edilmiştir Yumurtalık hücreleri.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Forseps, biyoloji</td><td>İnce Bilimsel Araçlar</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Odacıklı Kapak</td><td>Camı Thermo Fisher Bilimsel</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Analiz yazılımı</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen</td><td></td></tr><tr><td>9 Depresyon Cam Spot Plakaları</td><td>Pyrex</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet ampulü</td><td>Çeşitli satıcılar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen brülör</td><td>Çeşitli satıcılar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Buzlu Mikroskop Slaytları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm cam lameller No 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Çift taraflı bant</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnce fırça #0, #3- #5</td><td>Çeşitli satıcılar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipetman Başlangıç Kiti</td><td>Thomas Scientific</td><td>F167300</td><td>p20, p200, p1000 içerir pipetleyiciler</td></tr><tr><td>%16 Paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td> 1x PBS Triton Sigma-Aldrich 9002-93-1'de <td>%4'e seyreltin paraformaldehit</td></tr><tr><td></td><td>10x</td> PBS<td>Ambion</td> AM9624 1x PBS Normal Keçi Serumu Jackson ImmunoResearch 5000121 PBST'de %0,5 Triton konsantrasyonu ile %10 normal keçi serumuna seyreltin <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Birincil antikorlar (protokolde: 7G10 anti-Fasiclin III 1:250 seyreltilmiş, tavşan anti-fosfohiston H3 1:1000 seyreltilmiş)</td><td>Çeşitli satıcılar (protokolde: Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası, Millipore)</td><td></td><td>% 0.5 Triton konsantrasyonu ile PBST'de seyreltin</td></tr><tr><td>İkincil antikorlar (protokolde: Alexa-546, FITC konjuge anti-tavşan serumu)</td> <td>Çeşitli satıcılar (protokolde: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)</td><td></td><td>PBST'de% 0.5 Triton konsantrasyonu ile seyreltin</td></tr><tr><td>Sinek şişeleri</td><td>Denville Scientific</td><td>V9406</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk Topları, Geniş Şişeler İçin</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-102W</td><td></td></tr><tr><td>Maya, Fırıncılar Kurutulmuş Aktif</td><td>MP Biyomedikal</td><td>101400</td><td></td></tr><tr><td>Sinek yemi</td><td>Laboratuvarda</td><td></td> <td>üretilmiştirSu, bira mayası, mısır unu, pekmez, agar, EtOH, penisilin, metil 4-hidrobenzoat ve propiyonik asit karışımı</td></tr><tr><td>Erkek ve dişi Drosophila sinekler (protokolde kullanılan genotip: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diseksiyon ve drosophila pupa yumurtalık boyama

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Yetişkin Drosophila yumurtalık, Pupa yumurtalık erişmek ve onların küçük nedeniyle incelemek nispeten zor olan boyut, translucence ve bir pupa dava içinde kapatan. Pupa yumurtalık dissekan meydan aynı zamanda fiziksel konumlarını pupa içinde yatıyor: yumurtalık içinde pupa karın yağ vücut hücreleri tarafından çevrilidir ve bu yağ hücrelerinin doğru antikor boyama için izin vermek için kaldırılması gerekir. Bu zorlukları aşmak için pupa karından yağ vücut hücreleri ayıklamak için özelleştirilmiş Pasteur pipets bu protokolü kullanır. Ayrıca, Pupa görünürlüğünü artırmak için odacıklı bir coverglass yerine microcentrifuge tüp boyama işlemi sırasında kullanılır. Ancak, bu ve diğer avantajları bu protokol için kullanılan araçlar rağmen bu tekniklerin başarılı yürütme hala pratik pupa yumurtalık küçük boyutu nedeniyle birkaç gün içerebilir. Bu protokol için özetlenen teknikleri yumurtalık çeşitli yaşlardaki pupa analiz edilir zaman ders deneyler için uygulanabilir.

Bu yordamın başarılı yürütme Drosophila pupa yumurtalık hücresel organizasyonu ve yapısını ortaya açık antikor boyama sonuçlanmalıdır. Bu protokol için özetlenen immünhistokimya genellikle larva ve yetişkin yumurtalıklarda lekeli hücre tipleri tanımlamak için kullanılabilir. Türetilen pupa SAP hücrelerinin hücre (beyaz Fasciclin III tarafından özetlenen)18 şekil 3' te gösterilen sürüsü. Pupa yumurtalık hücresel organizasyonu v...

Drosophila yumurtalık kök hücre niş geliştirme eğitim için mükemmel model bir sistemdir. Larva ve yetişkin yumurtalık dissekan için yöntemleri yayımlanmış olsa, Pupa yumurtalık diseksiyonlarının ayrıntılı olarak yayınlanmamıştır farklı teknikler gerektirir. Burada diseksiyon, boyama ve pupa yumurtalık montaj için bir protokol anahat.

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Bu prosedürün genel amacı, drosophila pupa yumurtalıklarını incelemek ve boyamaktır. Bu yöntem, model organizma drosophila'da kök hücre farklılaşması ve doku gelişimi ile ilgili olanlar gibi biyolojinin gelişimindeki kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, aksi takdirde izole edilmesi zor olan pupa yumurtalıklarının küçük boyutunu ve yarı saydam doğasını barındırmak için özelleştirilebilir araçların kullanılmasıdır.Pupa drosophila gelişimi sırasında yumurtalıktaki kök hücre bölünmesini izlemek için zaman kursu deneyleri yaptığımızda onun yöntemini kullanma fikrimiz vardı. Protokole başlamak için, 10 erkek ve 15 dişi yetişkin drosophila sineğini, maya ile takviye edilmiş normal zengin sinek yemi şişesinde birleştirin. Yumurtaların oda sıcaklığında üç ila dört gün larva haline gelmesine izin verin.Üç ila dört gün sonra, yumuşak kıllara sahip nemli ince bir fırça kullanarak, fırça ile şişenin duvarı boyunca yuvarlanma hareketi yapın, dolaşan üçüncü instar larvalarını şişeden bir cam kuyuya aktarın, ağzına kadar 1X fosfat tamponlu salin veya PBS ile doldurun. Larvalardaki yiyecek artıklarını 1X PBS ile doldurulmuş başka bir kuyuya aktararak yıkayın.

dissection-and-staining-of-drosophila-pupal-ovaries

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Nişler ve kök hücre gelişimi sırasında formu nasıl pratik etkileri olan önemli bir soru.

Diseksiyon ve boyanması Drosophila Larvaların Yumurtalıkların

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

Drosophila'nın yetişkin yapıları, hayali diskler adı verilen kese benzeri yapılardan türetilmiştir. Bu disklerin analizi, doku tayini, kompartman sınırı oluşturma, hücre proliferasyonu, hücre kaderi spesifikasyonu ve düzlemsel hücre polaritesi dahil olmak üzere birçok gelişimsel süreç hakkında bilgi sağlar. Bu protokol, ışık/floresan mikroskobu için hayali diskleri hazırlamak için kullanılır.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren Drosophila melanogaster

Bu tekniğin amacı, araştırmacıların herhangi bir yaştaki Drosophila melanogaster'den pupa göz disklerinin diseksiyonunu, immün boyama ve montajını gerçekleştirmelerini sağlamaktır.

Diseksiyon ve montajı<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz Diskler

Bu protokolde açıklanan dik görüntüleme yöntemi, gelişmekte olan bir Drosophila melanogaster yumurtasının kutuplarının ayrıntılı olarak görüntülenmesine olanak sağlar.  Bu uçtan bakış, foliküler epitelde çoklu hücre tiplerinin düzenlemelerine ve morfolojilerine yeni bir bakış açısı sağlar.

Dik Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Odaları

Yaprak biti embriyoları üzerinde tam montajlı immün boyama protokolü sunulmuştur, burada arka plan boyamasını azaltmak ve doku geçirgenliğini artırmak için kritik koşullar ele alınmaktadır. Bu koşullar, yaprak bitlerinin embriyonik dokularında protein ekspresyonunun etkili bir şekilde tespit edilmesi için özel olarak geliştirilmiştir.

Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması

Biz diseksiyon, tespit ve steroid hormon biyosentezi ve düzenleyici mekanizma çalışmaya Drosophila larvaları ve yetişkin kadınlarda Sterpidojenik organların immün için bir protokol açıklar. steroidojenik organlara ek olarak, böyle germ çizgili kök hücreleri gibi steroidojenik organların innervasyon olarak steroidojenik hedef hücreleri görselleştirmek.

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

Bu protokolün amacı, Drosophila yumurtalıklarındaki hücre altı yapıların lokalizasyonu ve dinamikleri üzerindeki oksidatif hasarın etkilerini görselleştirmek için canlı görüntüleme kullanmaktır.

Canlı Görüntüleme Kullanarak Oksidatif Hasarın Drosophila Yumurta Odaları Üzerindeki Etkilerini Görselleştirme

Bodrum zarı, gelişim sırasında doku ve organ morfogenezi için gereklidir. Bu yapının uygun şekilde yerleştirilmesine yol açan mekanizmaları daha iyi anlamak için, sunulan protokol, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak epitel hücrelerinde bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek ve karakterize etmek için yöntemleri açıklamaktadır.

Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi

Drosophila , miyogenezin temel mekanizmalarını anlamak için güçlü bir modeldir. Toraks hemi-sezaritlerinin diseksiyonu ve hazırlanması için bu protokol, hem pupa hem de yetişkin aşamalarından dolaylı uçuş kasının mikroskopi analizini sağlar. Bu protokol, hücresel morfolojinin, protein lokalizasyonunun, kas yapısının ve miyogenezin diğer birçok yönünün konfokal görüntülenmesini sağlar.

Mikroskopi Yaklaşımları için Drosophila melanogaster Dolaylı Uçuş Kaslarının Diseksiyonu

Öğrenin Drosophila pupa yumurtalık diseksiyonu ve boyama yöntemini kullanarak kök hücre niş gelişimini incelemeyi. Bu protokol küçük ve saydam dokuların izolasyonunu kolaylaştırır.

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Daha fazla video keşfet